Name: creation of a knee joint-on-a-chip for modeling joint diseases and testing drugs
Uploaded: 2023-01-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs at JoVE.com

Dit onderzoek werd voornamelijk ondersteund door financiering van de National Institutes of Health (UG3/UH3TR002136, UG3/UH3TR003090). Daarnaast bedanken we Dr. Paul Manner (University of Washington) voor het verstrekken van de menselijke weefselmonsters en Dr. Jian Tan voor hun hulp bij het isoleren van de MSC's en het creëren van de celpool.

Het volgende protocol volgt de ethische richtlijnen van de Universiteit van Pittsburgh en de ethische commissie voor menselijk onderzoek van de Universiteit van Pittsburgh. Informatie over de materialen die in dit onderzoek zijn gebruikt, is opgenomen in de materiaaltabel.
1. Productie van 3D-geprinte bioreactoren
<ol><li>Gebruik een computersoftware om osteochondrale (figuur 2A) en minijoint bioreactoren (f...

<ol>
	<li>Safiri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional+and+national+burden+of+osteoarthritis+1990-2017:+A+systematic+analysis+of+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).</li><li>Lawrence, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+the+prevalence+of+arthritis+and+other+rheumatic+conditions+in+the+United+States:+Part+II.">Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States: Part II.</a> Arthritis and Rheumatism. 58 (1), 26-35 (2008).</li><li>Makarczyk, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+models+for+development+of+disease-modifying+osteoarthritis+drugs.">Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 27 (2), 124-138 (2021).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+osteoarthritis:+risk+factors,+regulatory+pathways+in+chondrocytes,+and+experimental+models.">Pathogenesis of osteoarthritis: risk factors, regulatory pathways in chondrocytes, and experimental models.</a> Biology. 9 (8), 194 (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+A+fast+track+for+engineered+human+tissues+in+drug+development.">Organs-on-a-chip: A fast track for engineered human tissues in drug development.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).</li><li>Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells:+aging+and+tissue+engineering+applications+to+enhance+bone+healing.">Bone marrow mesenchymal stem cells: aging and tissue engineering applications to enhance bone healing.</a> Biomaterials. 203, 96-110 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cell-derived+miniature+joint+system+for+disease+modeling+and+drug+testing.">Human mesenchymal stem cell-derived miniature joint system for disease modeling and drug testing.</a> Advanced Science. 9 (21), 2105909 (2022).</li><li>Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+tissue+engineering+application+of+injectable+gelatin+hydrogel+with+in+situ+visible-light-activated+gelation+capability+in+both+air+and+aqueous+solution.">Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution.</a> Tissue Engineering. Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).</li><li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate:+polymerization+rate+and+cytocompatibility.">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).</li><li>Lin, H., Lozito, T. P., Alexander, P. G., Gottardi, R., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+microphysiological+osteochondral+system+to+model+tissue+response+to+interleukin-1&#946;.">Stem cell-based microphysiological osteochondral system to model tissue response to interleukin-1&#946;.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2203-2212 (2014).</li><li>Yin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+macro-porous+titanium+ornamented+by+degradable+3D+gel/nHA+micro-scaffolds+for+bone+tissue+regeneration.">Hybrid macro-porous titanium ornamented by degradable 3D gel/nHA micro-scaffolds for bone tissue regeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 575 (2016).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteochondral+tissue+chip+derived+from+iPSCs:+Modeling+OA+pathologies+and+testing+drugs.">Osteochondral tissue chip derived from iPSCs: Modeling OA pathologies and testing drugs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 411 (2019).</li><li>Atukorala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovitis+in+knee+osteoarthritis:+A+precursor+of+disease.">Synovitis in knee osteoarthritis: A precursor of disease.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (2), 390-395 (2016).</li><li>Occhetta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperphysiological+compression+of+articular+cartilage+induces+an+osteoarthritic+phenotype+in+a+cartilage-on-a-chip+model.">Hyperphysiological compression of articular cartilage induces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 545-557 (2019).</li><li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+changes+associated+with+cartilage+trauma+using+human-cell-laden+hydrogel+cartilage+models.">Modeling early changes associated with cartilage trauma using human-cell-laden hydrogel cartilage models.</a> Stem Cell Research and Therapy. 13 (1), 400 (2022).</li><li>Elsissy, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+septic+arthritis+of+the+adult+native+knee+joint:+A+review.">Bacterial septic arthritis of the adult native knee joint: A review.</a> JBJS Reviews. 8 (1), 0059 (2020).</li><li>Romero-Lopez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+effects+on+mesenchymal+stem+cell+osteogenesis+in+a+three-dimensional+in+vitro+bone+model.">Macrophage effects on mesenchymal stem cell osteogenesis in a three-dimensional in vitro bone model.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (19-20), 1099-1111 (2020).</li></ol>

In dit artikel presenteren we een protocol voor het maken van een kniegewricht-op-een-chip-systeem, waarin bot, kraakbeen, vetweefsel en synoviumachtige weefsels worden gevormd uit MSC's en co-gekweekt in een aangepaste bioreactor. Dit multi-component, van menselijke cellen afgeleide systeem met plug-and-play-functies vertegenwoordigt een nieuw hulpmiddel voor het bestuderen van de pathogenese van gewrichtsziekten en het ontwikkelen van medicijnen. 
Aangezien verschillende weefsels de voorkeur...

Gewrichtsziekten zoals artrose (OA) komen veel voor en zijn slopend en vormen wereldwijd een belangrijke oorzaak van invaliditeit1. Geschat wordt dat artrose alleen al in de VS 27 miljoen patiënten treft en voorkomt bij 12,1% van de volwassenen van 60 jaar en ouderdan 2 jaar. Helaas zijn de meeste geneesmiddelen die momenteel worden gebruikt om gewrichtsaandoeningen te beheersen palliatief en zijn er geen effectieve ziektemodificerende OA-geneesmiddelen (DMOADs) beschikbaar3. Deze onvervulde medische behoefte komt voornamelijk voort uit het ontbreken van een effectief model voor het bestuderen van de ziektemechanismen en het ontwikkelen van potentiële DMOADs. De conventionele tweedimensionale (2D) celcultuur weerspiegelt niet de 3D-aard van gewrichtsweefsels en de kweek van weefselexplantaten wordt vaak belemmerd door aanzienlijke celdood en slaagt er meestal niet in om de dynamische weefselverbindingen te repliceren4. Bovendien verminderen genetische en anatomische verschillen de fysiologische relevantie van diermodellen aanzienlijk4.
Organs-on-chips (OoC's), of microfysiologische systemen, zijn een veelbelovend onderzoeksveld op het snijvlak van engineering, biologie en geneeskunde. Deze in vitro platforms zijn minimale functionele eenheden die gedefinieerde gezonde of pathologische kenmerken van hun in vivo tegenhangers repliceren5. Bovendien kunnen deze geminiaturiseerde systemen verschillende cellen en matrices hosten en de biofysische en biochemische interacties tussen verschillende weefsels simuleren. Daarom belooft een microfysiologisch systeem dat het inheemse synoviale gewricht getrouw kan samenvatten een effectief platform te bieden voor het modelleren van gewrichtsaandoeningen en het ontwikkelen van potentiële DMOADs.
Menselijke mesenchymale stamcellen (MSC's) kunnen worden geïsoleerd uit vele weefsels in het lichaam en worden gedifferentieerd in osteogene, chongene en adipogene afstammingslijnen6. MSC's zijn met succes gebruikt om verschillende weefsels te engineeren, waaronder bot, kraakbeen en vetweefsel6, wat betekent dat ze een veelbelovende celbron vormen voor het engineeren van de weefselcomponenten van het kniegewricht. We hebben onlangs een miniatuur gewricht-nabootsend microfysiologisch systeem ontwikkeld, genaamd miniJoint, dat bestaat uit MSC-afgeleide bot-, kraakbeen-, vezel- en vetweefsels7. In het bijzonder maakt het nieuwe ontwerp weefseloverspraak mogelijk door microfluïdische stroming of permeatie (figuur 1). Hierin presenteren we de protocollen voor de fabricage van de chipcomponenten, de engineering van de weefselcomponenten, de cultuur van de gemanipuleerde weefsels in de chip en de verzameling van weefsels voor downstream-analyses.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64186/64186fig01.jpg"> Figuur 1: Schema van de miniJoint chip met de rangschikking van de verschillende weefselcomponenten en medium flows. OC = osteochondraal weefsel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64186/64186fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>I17018-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well non-tissue culture plate</td>
			<td>Corning Falcon&#174; Plates</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well non-tissue culture plate</td>
			<td>Corning Falcon&#174; Plates</td>
			<td>351147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringes</td>
			<td>BD Syringe Luer Lock Cascade Health</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue stain</td>
			<td>EK Industries</td>
			<td>1198</td>
			<td>1% w/v, pH 1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12491-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>12-460-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY&#174; fluorophore</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone morphogenic protein 7 (BMP7)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>16100110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexmethasome</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>02-05-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Shell 450 photopolymer in</td>
			<td>EnvisionTec</td>
			<td>RES-01-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini-Bio Products</td>
			<td>900-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>3505-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gelatin from bovine skin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>1003372809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>SH30588.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indomethacin</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>I7378-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>interleukin 1&#946;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leur-loc connectors</td>
			<td>Cole-Parmer Instruments</td>
			<td>45508-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>115388-93-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>1003129352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium bags</td>
			<td>KiYATEC</td>
			<td>FC045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic Anhydride</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>102378580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pointed forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>12000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon mold</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>RC00114P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon o-rings</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>ZMCCs1X5</td>
			<td>1mm x 5mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes SE, V&#233;lizy-Villacoublay, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blades</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Lagato210P, KD Scientific</td>
			<td>Z569631</td>
			<td>10 syringe racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-182 tissue culture flasks</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB012939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 150 mm</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB012925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor Beta (TGF-&#946;3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-36E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Flashlight</td>
			<td>KBS</td>
			<td>KB70109</td>
			<td>395 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vida Desktop 3D Printer</td>
			<td>EnvisionTec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>32222-06-3</td>
			<td>1,25-dihydroxyvitamin D3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creation of a knee joint-on-a-chip for modeling joint diseases and testing drugs

De hoge prevalentie van slopende gewrichtsaandoeningen zoals artrose (OA) vormt een hoge sociaaleconomische last. Momenteel zijn de beschikbare medicijnen die zich richten op gewrichtsaandoeningen meestal palliatief. De onvervulde behoefte aan effectieve disease-modifying OA drugs (DMOADs) is voornamelijk veroorzaakt door het ontbreken van geschikte modellen voor het bestuderen van de ziektemechanismen en het testen van potentiële DMOADs. Hierin beschrijven we de oprichting van een miniatuur synoviaal gewricht-nabootsend microfysiologisch systeem (miniJoint) bestaande uit vet-, vezel- en osteochondrale weefselcomponenten afgeleid van menselijke mesenchymale stamcellen (MSC's). Om de driedimensionale (3D) microweefsels te verkrijgen, werden MSC's ingekapseld in fotocrosslinkable methacrylated gelatine voor of na differentiatie. De met cellen beladen weefselconstructies werden vervolgens geïntegreerd in een 3D-geprinte bioreactor, waardoor de miniJoint werd gevormd. Afzonderlijke stromen van osteogene, fibrogene en adipogene media werden geïntroduceerd om de respectieve weefselfenotypen te behouden. Een algemeen gedeelde stroom werd doordrenkt door het kraakbeen, synoviale en vetweefsels om weefseloverspraak mogelijk te maken. Dit stromingspatroon maakt de inductie van verstoringen in een of meer van de weefselcomponenten voor mechanistische studies mogelijk. Bovendien kunnen potentiële DMOADs worden getest via "systemische toediening" via alle mediumstromen of "intra-articulaire toediening" door de geneesmiddelen toe te voegen aan alleen de gedeelde "synoviale vloeistof" -simulerende stroom. Zo kan de miniJoint dienen als een veelzijdig in vitro platform voor het efficiënt bestuderen van ziektemechanismen en het testen van geneesmiddelen in gepersonaliseerde geneeskunde.

Alle weefsels van de miniJoint werden verzameld om hun fenotypes te analyseren na 28 dagen kweek in de miniJoint (figuur 4A). Dit is gedetailleerd beschreven in onze vorige publicatie7.
Door het gebruik van RT-qPCR, immunostaining en histologische kleuring werd bevestigd dat de weefselspecifieke fenotypes goed werden onderhouden voor de individuele microtissues (figuur 4). Bijvoorbeeld, de botvormige component ...

Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs at JoVE.com

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

We bieden gedetailleerde methoden voor het genereren van vier soorten weefsels uit menselijke mesenchymale stamcellen, die worden gebruikt om het kraakbeen, bot, vetkussen en synovium in het menselijke kniegewricht samen te vatten. Deze vier weefsels zijn geïntegreerd in een aangepaste bioreactor en verbonden via microfluïdica, waardoor een kniegewricht-op-een-chip wordt gegenereerd.

Creatie van een kniegewricht-op-een-chip voor het modelleren van gewrichtsaandoeningen en het testen van medicijnen

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...

Ons vermogen om nauwkeurig te voorspellen hoe mensen reageren op geneesmiddelen tijdens klinische onderzoeken is beperkt vanwege het gebrek aan fysiologisch relevante preklinische modellen. Dit microfysiologische systeem kan die ongelijkheid aanpakken. Dit van menselijke cellen afgeleide systeem bootst nauwkeurig de hele gewrichtsziekte na aard van artrose in de menselijke knie, wat het mogelijk maakt om ziektemodificerende artrosegeneesmiddelen te testen voorafgaand aan klinische proeven, waardoor mogelijk miljoenen dollars worden bespaard.Begin met het bereiden van methacrylaatgelatine, of GelMA, door 17 gram gelatine type B toe te voegen aan 500 milliliter gedestilleerd water. Meng het gedurende 30 minuten op een shaker op 37 graden Celsius en voeg 13 milliliter methacrylanhydride toe voordat je het een nacht mengt op een shaker. Bereid de volgende dag ongeveer 60 milliliter aliquots van de GelMA in dialysezakken.Leg alle dialysezakjes zeven dagen in gedestilleerd water met een roerstaaf. Ververs het water meerdere keren per dag en laat de zakken een nacht op vier graden Celsius staan. Giet op dag zeven de GelMA in een schaal en vries deze in bij min 80 graden Celsius voor de lyofilisatie.Vervolgens lyofileer de GelMA door deze in de vacuümkamer van een lyofilisator te plaatsen. Zorg voor volledige droging voordat u de lyofilisator verwijdert. Los vervolgens de gelyofiliseerde GelMA op in de uitgebalanceerde zoutoplossing van Hanks met een concentratie van 15% en stel de pH in op 7,4 met behulp van een kleine hoeveelheid natriumhydroxide.Op basis van het verkregen volume vult u de oplossing aan met antibiotisch antimycotisch en 0,15% lithiumfenylfosfosfonaat of LAP. Bescherm de GelMA-oplossing tegen licht en bewaar deze bij min 20 graden Celsius tot verder gebruik. Autoclaaf 3D-geprinte dual flow bioreactorkamers, deksels en inzetstukken in autoclaafzakken bij 121 graden Celsius gedurende 20 minuten met stoom.En dan, gedurende 20 minuten met droge hitte. Week na sterilisatie de bioreactorkamers, deksels en inzetstukken 's nachts in 15 milliliter steriele PBS in de bioveiligheidskast, gevolgd door volledige droging. Gebruik een pipet van 1000 microliter om 20 keer 10 tot de zesde van het menselijk beenmerg afgeleide mesenchymale stamcellen, of MSC's, per millilitercellen in een 15% GelMA-oplossing te resuspenderen.Druk vervolgens een steriele, droge siliconen vorm tegen een petrischaaltje met steriele handschoenen. Plaats een inzetstuk in elk gat van de siliconenvorm met een tang met de gatzijde van het inzetstuk naar beneden gericht. Als u klaar bent, voegt u ongeveer 50 microliter van de celsuspensie per insert toe met behulp van een pipet van 200 microliter.Cross-link de gel in de insert door de bovenkant bloot te stellen aan een 395 nanometer golflengte UV-zaklamp gedurende 1,5 minuut en vervolgens de andere kant gedurende 30 seconden te verlichten. Breng met een steriele tang de inserts onmiddellijk over in acht milliliter groeimedium in een niet-weefselkweekplaat met zes putten en laat de cellen 's nachts herstellen. Om de differentiatie van vetweefsel te initiëren, brengt u de inserts over naar acht milliliter adipogeen medium en kweekt u ze gedurende 28 dagen met dagelijkse mediumverandering.Om de osteochondrale eenheden te engineeren, plaatst u de inserts in bioreactorkamers met dubbele stroom, sluit u de putten af en infundeert u de twee stromen afzonderlijk met een stroomsnelheid van vijf microliter per minuut met 35 milliliter osteogeen medium en 35 milliliter chondrogenisch medium. Houd cellen gedurende 28 dagen voor differentiatie door tweewekelijkse spuitwisselingen uit te voeren met de respectieve mediumtypen. Om de fibroblasten af te leiden, differentiëren de MSC's in 2D-cultuur in een T-150 vierkante centimeter weefselcelkweekkolf met 20 milliliter fibrogeen medium gedurende 21 dagen.Houd de wekelijkse verandering van het medium in stand. Gebruik na 21 dagen vier milliliter trypsine om de cellen los te maken. Sluit de 3D-gels in de inzetstukken in.Om synoviaal-achtig vezelig weefsel, of SFT, te verkrijgen, volgt u een soortgelijk protocol. Sluit de siliconen slang, met een binnendiameter van 0,062 inch en een buitendiameter van 0,125 inch, aan op de minijoint bioreactorbalk aan het ene uiteinde en F 1/16e lokvergrendelingsconnectoren aan het andere uiteinde. Autoclaaf vervolgens de 3D-minijoint-bioreactoren samen met de siliconenbuizen en deksels.Bereid en laad 35 milliliter medium voor gebruik voor de minijoint-cultuur in de mediumreservoirs. Gebruik een rechte tang om de osteochondrale eenheden van de dual flow bioreactor over te brengen naar de rechterput van de minijoint bioreactor. Breng het inzetstuk van het vetweefsel en het inbrengen van vezelig weefsel over in respectievelijk de linker- en middelste put, voordat alle putjes worden bedekt met gesteriliseerde deksels.Sluit de minijoint clipinlaten aan op de middelgrote reservoirs en de uitlaten op spuiten. Monteer vervolgens de spuiten op een spuitpomp. Breng de pomp en chips over naar een incubator.Plaats de middelgrote reservoirs op ijs buiten de incubator. Bedien de pomp in de opzuigmodus en trek het medium uit het mediumreservoir in de minijoint bioreactorkamer. Ga door met dit minijoint kweekproces gedurende 28 dagen.Om de gewrichtsontsteking en kraakbeendegeneratie te modelleren, voegt u interleukine één bèta toe aan de fibrogene mediumstam met 10 nanogram per milliliter gedurende zeven dagen. Zorg ervoor dat u de spuit op de derde dag vervangt voordat u verse interleukine één bèta aan het fibrogene medium verstrekt. Voor het testen van geneesmiddelen, na drie dagen interleukine één bètabehandeling, dient u het geneesmiddel toe in het gedeelde medium, waarbij een intra-articulaire toediening wordt gesimuleerd, of in alle mediumtypen, waarbij een systemische toediening wordt gesimuleerd.Na zeven dagen interleukine één bètabehandeling, verzamel individuele weefsels voor de analyse. Nadat u de inserts met een steriele tang hebt verwijderd, duwt u een biopsiepons door het midden van de insert om de gel te verwijderen en de gel in PBS te plaatsen. Snijd vervolgens de osteochondrale gels doormidden terwijl u de genexpressie beoordeelt.Verzamel en centrifugeer ongeveer 1,5 milliliter media van elke mediumbron bij 14.000 G gedurende 10 minuten. Na het weggooien van het sediment, flash bevriest u de geconditioneerde media in vloeibare stikstof. Voor histologische kleuring en immunokleuring fixeert u eerst het osteochondrale en synoviale vezelweefsel, of SFT-monsters, in 10% gebufferde formaline en droogt u ze uit in ethanol van oplopende concentraties.Wis het monster in xyleen, sluit ze in paraffine in en snijd de monsters ten slotte in zes micrometer dikte. In het geval van vetweefsel, kleurt u de 10% gebufferde formele en vaste monsters direct met olierode O-oplossing of BODIPY. De weefselspecifieke fenotypen werden goed onderhouden voor de individuele microweefsels.Alle weefsels van de minijoint werden verzameld om hun fenotypes na 28 dagen cultuur te analyseren. De botvormige component van de microweefsels van de osteochondrale eenheden bracht hoge niveaus van osteocalcine tot expressie. In het kraakbeengedeelte van het osteochondrale drukten weefsels significant hoge niveaus van collageen type twee en aggrecan uit.De expressieniveaus van representatieve adipogene genen, adiponectine en leptine waren hoger in het vetweefsel. De afzetting van calciummineralen, alkalische fosfatase en osteocalcine-eiwit werd voornamelijk gezien in de botgrootte van osteochondrale microweefsels. Kraakbeenzijde van osteochondrale weefsels vertoonde goed vastgehouden glycosaminoglycaan en collageen type twee.De expressie van chondrocytenhypertrofie geassocieerde markers, collageen type 10 en Indiase egel, was significant down-gereguleerd na 28 dagen cultuur. Overvloedige lipidedruppelafzetting werd gevonden in het vetweefsel. De immunofluorescente kleuring vertoonde robuuste smeer- en cadherine 11-expressie door de SFT na vier weken kweek.In een ziektemodel resulteerde IL één bètabehandeling in celapoptose en verhoogde MMP-13-niveaus in de SFT. De kraakbeenafbraak werd behandeld met IL one beta, wat wijst op het optreden van kruisverwijzing tussen de osteochondrale weefsels en SFT. De therapeutische werkzaamheid van naproxen door systemische toediening toonde verminderde kraakbeenafbraak in IL one beta minijoint.De realtime PCR gaf aan dat de vier potentiële ziektemodificerende artrosemedicijnen het kraakbeenverlies gedeeltelijk omkeerden. De belangrijkste stappen van deze procedure zijn crosslinking van de gels in de inserts en de plaatsing van de insert in de bioreactor. De chip maakt het mogelijk om de bijdrage van andere risicofactoren bij artrose te onderzoeken, zoals obesitas en mechanisch letsel.Het kan ook worden gebruikt om andere gewrichtsaandoeningen te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Plasma Lithografie Surface Patterning voor de schepping van Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Endothelialized Microfluidics voor het bestuderen van microvasculaire Interacties in Hematologische ziekten

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

Milieuvriendelijke gecontroleerde Microtensile Testen van mechanisch-adaptieve nanocomposieten voor<em&gt; Ex vivo</em&gt; Karakterisering

Implantable microdevices are gaining significant attention for several biomedical applications1-4. Such devices have been made from a range of materials, ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

Patiënt-specifieke modellering van het Hart: Schatting van ventriculaire vezeloriëntaties

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Bepaling van de Transport Rate van xenobiotica en nanomaterialen via de placenta met de<em&gt; Ex vivo</em&gt; Human placentaperfusie Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

Stress-geïnduceerde antibiotica gevoeligheid testen op een chip

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

Establishment of a Surgically-induced Model in Mice to Investigate the Protective Role of Progranulin in Osteoarthritis

Oprichting van een chirurgisch geïnduceerde Model in Muizen naar de beschermende rol van progranuline in Artrose Onderzoek

Destabilization of medial meniscus (DMM) model is an important tool for studying the pathophysiological roles of numerous arthritis associated molecules ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Microfluïdische fabricage van polymere en biohybridevezels met vooraf ontworpen grootte en vorm

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Oscillation and Reaction Board Techniques for Estimating Inertial Properties of a Below-knee Prosthesis

Oscillatie en Reaction Board technieken voor het schatten van inerte eigenschappen van een onder-knieprothese

The purpose of this study was two-fold: 1) demonstrate a technique that can be used to directly estimate the inertial properties of a below-knee ...

Creation of Patient-Specific Silicone Cardiac Models with Applications in Pre-surgical Plans and Hands-on Training

Creatie van patiëntspecifieke siliconen cardiale modellen met toepassingen in pre-chirurgische plannen en hands-on training

Three dimensional&#160;models can be a valuable tool for surgeons as they develop surgical plans and medical fellows as they learn about complex cases. In ...