Name: creation of a knee joint-on-a-chip for modeling joint diseases and testing drugs
Uploaded: 2023-01-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs at JoVE.com

Diese Forschung wurde in erster Linie durch Mittel der National Institutes of Health (UG3/UH3TR002136, UG3/UH3TR003090) unterstützt. Darüber hinaus danken wir Dr. Paul Manner (University of Washington) für die Bereitstellung der menschlichen Gewebeproben und Dr. Jian Tan für ihre Hilfe bei der Isolierung der MSCs und der Erstellung des Zellpools.

Das folgende Protokoll folgt den ethischen Richtlinien der University of Pittsburgh und der Ethikkommission für Humanforschung der University of Pittsburgh. Informationen zu den in dieser Studie verwendeten Materialien sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Herstellung von 3D-gedruckten Bioreaktoren
<ol><li>Verwenden Sie eine Computersoftware, um osteochondrale (Abbildung 2A) und miniJoint-Bioreaktoren (<strong class="xfig...

<ol>
	<li>Safiri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional+and+national+burden+of+osteoarthritis+1990-2017:+A+systematic+analysis+of+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).</li><li>Lawrence, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+the+prevalence+of+arthritis+and+other+rheumatic+conditions+in+the+United+States:+Part+II.">Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States: Part II.</a> Arthritis and Rheumatism. 58 (1), 26-35 (2008).</li><li>Makarczyk, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+models+for+development+of+disease-modifying+osteoarthritis+drugs.">Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 27 (2), 124-138 (2021).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+osteoarthritis:+risk+factors,+regulatory+pathways+in+chondrocytes,+and+experimental+models.">Pathogenesis of osteoarthritis: risk factors, regulatory pathways in chondrocytes, and experimental models.</a> Biology. 9 (8), 194 (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+A+fast+track+for+engineered+human+tissues+in+drug+development.">Organs-on-a-chip: A fast track for engineered human tissues in drug development.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).</li><li>Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells:+aging+and+tissue+engineering+applications+to+enhance+bone+healing.">Bone marrow mesenchymal stem cells: aging and tissue engineering applications to enhance bone healing.</a> Biomaterials. 203, 96-110 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cell-derived+miniature+joint+system+for+disease+modeling+and+drug+testing.">Human mesenchymal stem cell-derived miniature joint system for disease modeling and drug testing.</a> Advanced Science. 9 (21), 2105909 (2022).</li><li>Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+tissue+engineering+application+of+injectable+gelatin+hydrogel+with+in+situ+visible-light-activated+gelation+capability+in+both+air+and+aqueous+solution.">Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution.</a> Tissue Engineering. Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).</li><li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate:+polymerization+rate+and+cytocompatibility.">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).</li><li>Lin, H., Lozito, T. P., Alexander, P. G., Gottardi, R., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+microphysiological+osteochondral+system+to+model+tissue+response+to+interleukin-1&#946;.">Stem cell-based microphysiological osteochondral system to model tissue response to interleukin-1&#946;.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2203-2212 (2014).</li><li>Yin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+macro-porous+titanium+ornamented+by+degradable+3D+gel/nHA+micro-scaffolds+for+bone+tissue+regeneration.">Hybrid macro-porous titanium ornamented by degradable 3D gel/nHA micro-scaffolds for bone tissue regeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 575 (2016).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteochondral+tissue+chip+derived+from+iPSCs:+Modeling+OA+pathologies+and+testing+drugs.">Osteochondral tissue chip derived from iPSCs: Modeling OA pathologies and testing drugs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 411 (2019).</li><li>Atukorala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovitis+in+knee+osteoarthritis:+A+precursor+of+disease.">Synovitis in knee osteoarthritis: A precursor of disease.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (2), 390-395 (2016).</li><li>Occhetta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperphysiological+compression+of+articular+cartilage+induces+an+osteoarthritic+phenotype+in+a+cartilage-on-a-chip+model.">Hyperphysiological compression of articular cartilage induces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 545-557 (2019).</li><li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+changes+associated+with+cartilage+trauma+using+human-cell-laden+hydrogel+cartilage+models.">Modeling early changes associated with cartilage trauma using human-cell-laden hydrogel cartilage models.</a> Stem Cell Research and Therapy. 13 (1), 400 (2022).</li><li>Elsissy, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+septic+arthritis+of+the+adult+native+knee+joint:+A+review.">Bacterial septic arthritis of the adult native knee joint: A review.</a> JBJS Reviews. 8 (1), 0059 (2020).</li><li>Romero-Lopez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+effects+on+mesenchymal+stem+cell+osteogenesis+in+a+three-dimensional+in+vitro+bone+model.">Macrophage effects on mesenchymal stem cell osteogenesis in a three-dimensional in vitro bone model.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (19-20), 1099-1111 (2020).</li></ol>

In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll zur Herstellung eines Kniegelenk-on-a-Chip-Systems vor, bei dem Knochen, Knorpel, Fettgewebe und synoviumähnliches Gewebe aus MSCs gebildet und in einem maßgeschneiderten Bioreaktor kokultiviert werden. Dieses aus menschlichen Zellen bestehende Mehrkomponentensystem mit Plug-and-Play-Funktionen stellt ein neues Werkzeug für die Untersuchung der Pathogenese von Gelenkerkrankungen und die Entwicklung von Medikamenten dar. 
Da unterschiedliche Gewebe...

Gelenkerkrankungen wie Arthrose (OA) sind weit verbreitet und schwächend und stellen weltweit eine der Hauptursachen für Behinderungendar 1. Es wird geschätzt, dass allein in den USA 27 Millionen Patienten von Arthrose betroffen sind und 12,1 % der Erwachsenen ab 60 Jahren auftreten2. Leider sind die meisten Medikamente, die derzeit zur Behandlung von Gelenkerkrankungen eingesetzt werden, palliativ, und es gibt keine wirksamen krankheitsmodifizierenden OA-Medikamente (DMOADs)3. Dieser ungedeckte medizinische Bedarf ergibt sich in erster Linie aus dem Fehlen eines wirksamen Modells zur Untersuchung der Krankheitsmechanismen und zur Entwicklung potenzieller DMOADs. Die konventionelle zweidimensionale (2D) Zellkultur spiegelt nicht die 3D-Natur von Gelenkgewebe wider, und die Kultur von Gewebeexplantaten wird oft durch einen signifikanten Zelltod behindert und repliziert in der Regel nicht die dynamischen Gewebeverbindungen4. Darüber hinaus verringern genetische und anatomische Unterschiede die physiologische Relevanz von Tiermodellenerheblich 4.
Organs-on-Chips (OoCs), also mikrophysiologische Systeme, sind ein vielversprechendes Forschungsfeld an der Schnittstelle von Ingenieurwissenschaften, Biologie und Medizin. Bei diesen In-vitro-Plattformen handelt es sich um minimalfunktionelle Einheiten, die definierte gesunde oder pathologische Merkmale ihrer In-vivo-Gegenstücke replizieren5. Darüber hinaus können diese miniaturisierten Systeme verschiedene Zellen und Matrizen beherbergen und die biophysikalischen und biochemischen Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Geweben simulieren. Ein mikrophysiologisches System, das das native Synovialgelenk originalgetreu rekapitulieren kann, verspricht daher, eine effektive Plattform für die Modellierung von Gelenkerkrankungen und die Entwicklung potenzieller DMOADs zu bieten.
Humane mesenchymale Stammzellen (MSCs) können aus vielen Geweben im ganzen Körper isoliert und in osteogene, chondrogene und adipogene Linien differenziert werden6. MSCs wurden erfolgreich eingesetzt, um verschiedene Gewebe zu züchten, darunter Knochen, Knorpel und Fettgewebe6, was bedeutet, dass sie eine vielversprechende Zellquelle für die Entwicklung der Gewebekomponenten des Kniegelenks darstellen. Wir haben kürzlich ein mikrophysiologisches Miniatur-Gelenksystem namens miniJoint entwickelt, das aus MSC gewonnenes Knochen-, Knorpel-, Faser- und Fettgewebe umfasst7. Insbesondere ermöglicht das neuartige Design das Übersprechen von Gewebe durch mikrofluidische Strömung oder Permeation (Abbildung 1). Im Folgenden stellen wir die Protokolle für die Herstellung der Chipkomponenten, das Engineering der Gewebekomponenten, die Kultur der künstlich hergestellten Gewebe im Chip und die Entnahme von Geweben für nachgelagerte Analysen vor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64186/64186fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des miniJoint-Chips, die die Anordnung der verschiedenen Gewebekomponenten und Mediumflüsse zeigt. OC = osteochondrales Gewebe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64186/64186fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>I17018-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well non-tissue culture plate</td>
			<td>Corning Falcon&#174; Plates</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well non-tissue culture plate</td>
			<td>Corning Falcon&#174; Plates</td>
			<td>351147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringes</td>
			<td>BD Syringe Luer Lock Cascade Health</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue stain</td>
			<td>EK Industries</td>
			<td>1198</td>
			<td>1% w/v, pH 1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12491-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>12-460-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY&#174; fluorophore</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone morphogenic protein 7 (BMP7)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>16100110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexmethasome</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>02-05-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Shell 450 photopolymer in</td>
			<td>EnvisionTec</td>
			<td>RES-01-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini-Bio Products</td>
			<td>900-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>3505-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gelatin from bovine skin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>1003372809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>SH30588.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indomethacin</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>I7378-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>interleukin 1&#946;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leur-loc connectors</td>
			<td>Cole-Parmer Instruments</td>
			<td>45508-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>115388-93-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>1003129352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium bags</td>
			<td>KiYATEC</td>
			<td>FC045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic Anhydride</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>102378580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pointed forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>12000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon mold</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>RC00114P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon o-rings</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>ZMCCs1X5</td>
			<td>1mm x 5mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes SE, V&#233;lizy-Villacoublay, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blades</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Lagato210P, KD Scientific</td>
			<td>Z569631</td>
			<td>10 syringe racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-182 tissue culture flasks</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB012939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 150 mm</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB012925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor Beta (TGF-&#946;3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-36E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Flashlight</td>
			<td>KBS</td>
			<td>KB70109</td>
			<td>395 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vida Desktop 3D Printer</td>
			<td>EnvisionTec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>32222-06-3</td>
			<td>1,25-dihydroxyvitamin D3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creation of a knee joint-on-a-chip for modeling joint diseases and testing drugs

Die hohe Prävalenz von schwächenden Gelenkerkrankungen wie Arthrose (OA) stellt eine hohe sozioökonomische Belastung dar. Derzeit sind die verfügbaren Medikamente, die auf Gelenkerkrankungen abzielen, meist palliativ. Der ungedeckte Bedarf an wirksamen krankheitsmodifizierenden OA-Medikamenten (DMOADs) wurde in erster Linie durch das Fehlen geeigneter Modelle zur Untersuchung der Krankheitsmechanismen und zur Erprobung potenzieller DMOADs verursacht. In dieser Arbeit beschreiben wir die Etablierung eines mikrophysiologischen Miniatursystems (miniJoint), das aus fettigen, fibrösen und osteochondralen Gewebekomponenten besteht, die von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) abgeleitet sind. Um die dreidimensionalen (3D) Mikrogewebe zu erhalten, wurden MSCs vor oder nach der Differenzierung in photovernetzbare methacrylierte Gelatine eingekapselt. Die zellbeladenen Gewebekonstrukte wurden dann in einen 3D-gedruckten Bioreaktor integriert, wodurch das miniJoint entstand. Getrennte Ströme von osteogenen, fibrogenen und adipogenen Medien wurden eingeführt, um die jeweiligen Gewebephänotypen zu erhalten. Ein gemeinsam genutzter Strom wurde durch das Knorpel-, Synovial- und Fettgewebe perfundiert, um eine Gewebeübersprechung zu ermöglichen. Dieses Strömungsmuster ermöglicht die Induktion von Störungen in einer oder mehreren Gewebekomponenten für mechanistische Untersuchungen. Darüber hinaus können potenzielle DMOADs entweder durch "systemische Verabreichung" über alle Medienströme oder durch "intraartikuläre Verabreichung" getestet werden, indem die Medikamente nur dem gemeinsamen "Synovialflüssigkeit"-simulierenden Fluss zugesetzt werden. Damit kann das miniJoint als vielseitige In-vitro-Plattform dienen, um Krankheitsmechanismen effizient zu untersuchen und Medikamente in der personalisierten Medizin zu testen.

Alle Gewebe des miniJoint wurden gesammelt, um ihre Phänotypen nach 28-tägiger Kultivierung im miniJoint zu analysieren (Abbildung 4A). Dies wurde in unserer vorherigen Publikation7 ausführlich beschrieben.
Durch den Einsatz von RT-qPCR, Immunfärbung und histologischer Färbung konnte bestätigt werden, dass die gewebespezifischen Phänotypen für die einzelnen Mikrogewebe gut erhalten blieben (Abbildung 4)...

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Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

Wir stellen detaillierte Methoden zur Generierung von vier Gewebetypen aus humanen mesenchymalen Stammzellen vor, die zur Rekapitulation von Knorpel, Knochen, Fettpolster und Synovia im menschlichen Kniegelenk verwendet werden. Diese vier Gewebe werden in einen maßgeschneiderten Bioreaktor integriert und durch Mikrofluidik miteinander verbunden, so dass ein Kniegelenk-on-a-Chip entsteht.

Erstellung eines Kniegelenk-on-a-Chips zur Modellierung von Gelenkerkrankungen und zur Erprobung von Medikamenten

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...

Unsere Fähigkeit, genau vorherzusagen, wie Menschen während klinischer Studien auf Medikamente reagieren, ist aufgrund des Mangels an physiologisch relevanten präklinischen Modellen begrenzt. Dieses mikrophysiologische System kann diese Diskrepanz beheben. Dieses aus menschlichen Zellen gewonnene System ahmt die gesamte Art der Gelenkerkrankung der Arthrose im menschlichen Knie genau nach, was das Testen von krankheitsmodifizierenden Arthrosemedikamenten vor klinischen Studien ermöglicht, wodurch möglicherweise Millionen von Dollar eingespart werden.Beginnen Sie mit der Zubereitung von Methacrylgelatine oder GelMA, indem Sie 17 Gramm Gelatine Typ B zu 500 Millilitern destilliertem Wasser hinzufügen. Mischen Sie es 30 Minuten lang auf einem Shaker bei 37 Grad Celsius und fügen Sie 13 Milliliter Methacrylanhydrid hinzu, bevor Sie es über Nacht auf einem Shaker mischen. Bereiten Sie am nächsten Tag ca. 60 Milliliter Aliquot des GelMA in Dialysebeutel vor.Legen Sie alle Dialysebeutel sieben Tage lang in destilliertes Wasser mit einem Rührstab. Wechseln Sie das Wasser mehrmals täglich und lassen Sie die Beutel über Nacht bei vier Grad Celsius stehen. Gießen Sie das GelMA am siebten Tag in eine Schüssel und frieren Sie es vor der Gefriertrocknung bei minus 80 Grad Celsius ein.Anschließend wird das GelMA lyophilisiert, indem man es in die Vakuumkammer eines Lyophilisators legt. Stellen Sie sicher, dass Sie vor der Entnahme aus dem Gefriertrockner vollständig getrocknet werden. Als nächstes löst man das lyophilisierte GelMA in Hanks' ausgewogener Salzlösung bei einer Konzentration von 15 % auf und stellt den pH-Wert mit einer kleinen Menge Natriumhydroxid auf 7,4 ein.Ergänzen Sie die Lösung auf der Grundlage des aufgenommenen Volumens mit einem Antibiotikum Antimykotikum und 0,15 % Lithiumphenylphosphinat oder LAP. Schützen Sie die GelMA-Lösung vor Licht und lagern Sie sie bis zur weiteren Verwendung bei minus 20 Grad Celsius. Autoklav 3D-gedruckte Dual-Flow-Bioreaktorkammern, Deckel und Einsätze in Autoklavenbeuteln bei 121 Grad Celsius für 20 Minuten mit Dampf.Und dann für 20 Minuten bei trockener Hitze. Nach der Sterilisation werden die Kammern, Deckel und Einsätze des Bioreaktors über Nacht in 15 Millilitern sterilem PBS in der Biosicherheitswerkbank eingeweicht, gefolgt von einer vollständigen Trocknung. Mit einer 1000-Mikroliter-Pipette resuspendieren Sie 20 mal 10 mesenchymale Stammzellen (MSCs) aus menschlichem Knochenmark pro Milliliterzellen in einer 15%igen GelMA-Lösung.Drücken Sie dann eine sterile, trockene Silikonform mit sterilen Handschuhen gegen eine Petrischale. Setzen Sie mit einer Pinzette einen Einsatz in jedes Loch der Silikonform ein, wobei die Lochseite des Einsatzes nach unten zeigt. Wenn Sie fertig sind, fügen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipette etwa 50 Mikroliter der Zellsuspension pro Einsatz hinzu.Vernetzen Sie das Gel im Inneren des Einsatzes, indem Sie die Oberseite 1,5 Minuten lang einer UV-Taschenlampe mit einer Wellenlänge von 395 Nanometern aussetzen und dann die andere Seite 30 Sekunden lang beleuchten. Übertragen Sie die Einsätze mit einer sterilen Pinzette sofort in acht Milliliter Wachstumsmedium in einer Nicht-Gewebekultur-Sechs-Well-Platte und lassen Sie die Zellen über Nacht erholen. Um die Differenzierung des Fettgewebes einzuleiten, überführen Sie die Einsätze in acht Milliliter adipogenes Medium und kultivieren Sie sie 28 Tage lang mit täglichem Mediumwechsel.Um die osteochondralen Einheiten zu konstruieren, platzieren Sie die Einsätze in Bioreaktorkammern mit zwei Strömen, verschließen Sie die Vertiefungen und infundieren Sie die beiden Ströme separat mit einer Durchflussrate von fünf Mikrolitern pro Minute mit 35 Millilitern osteogenem Medium und 35 Millilitern chondrogenem Medium. Halten Sie die Zellen für die Differenzierung für 28 Tage aufrecht, indem Sie alle zwei Wochen Spritzenwechsel mit den jeweiligen Medientypen durchführen. Um die Fibroblasten abzuleiten, differenzieren Sie die MSCs in 2D-Kultur in einem 150 Quadratzentimeter großen T-Gewebezellkulturkolben mit 20 Millilitern fibrogenem Medium für 21 Tage.Pflegen Sie den wöchentlichen Wechsel des Mediums. Verwenden Sie nach 21 Tagen vier Milliliter Trypsin, um die Zellen abzulösen. Verkapseln Sie die 3D-Gele in den Einsätzen.Um synovial-ähnliches fibröses Gewebe (SFT) zu erhalten, befolgen Sie ein ähnliches Protokoll. Verbinden Sie den Silikonschlauch mit einem Innendurchmesser von 0,062 Zoll und einem Außendurchmesser von 0,125 Zoll an einem Ende mit der Minijoint-Bioreaktorstange und am anderen Ende mit den Köderverriegelungsanschlüssen F 1/16. Autoklavieren Sie dann die 3D-Minijoint-Bioreaktoren zusammen mit den Silikonschläuchen und -deckeln.Bereiten Sie 35 Milliliter Nährmedium vor, das für die Minijoint-Kultur verwendet werden soll, und laden Sie es in die Mediumreservoirs. Verwenden Sie eine gerade Pinzette, um die osteochondralen Einheiten aus dem Dual-Flow-Bioreaktor in die rechte Vertiefung des Minijoint-Bioreaktors zu übertragen. Übertragen Sie den Fettgewebeeinsatz und den Fasergewebeeinsatz in die linke bzw. mittlere Vertiefung, bevor Sie alle Vertiefungen mit sterilisierten Deckeln abdecken.Verbinden Sie die Minijoint-Clip-Einlässe mit den Medium-Reservoirs und die Auslässe mit Spritzen. Montieren Sie dann die Spritzen auf einer Spritzenpumpe. Bringen Sie die Pumpe und die Späne in einen Inkubator.Stellen Sie die mittleren Behälter außerhalb des Inkubators auf Eis. Betreiben Sie die Pumpe im Entnahmemodus und saugen Sie das Medium aus dem Mediumreservoir in die Minijoint-Bioreaktorkammer. Setzen Sie diesen Minijoint-Kulturprozess 28 Tage lang fort.Um die Gelenkentzündung und Knorpeldegeneration zu modellieren, fügen Sie dem fibrogenen Mediumstamm sieben Tage lang Interleukin mit 10 Nanogramm pro Milliliter hinzu. Stellen Sie sicher, dass Sie die Spritze am dritten Tag austauschen, bevor Sie frisches Interleukin ein Beta in das fibrogene Medium geben. Für die Arzneimitteltests wird das Medikament nach dreitägiger Interleukin-Ein-Beta-Behandlung entweder im gemeinsam genutzten Medium verabreicht, um eine intraartikuläre Verabreichung zu simulieren, oder in allen Medientypen, um eine systemische Verabreichung zu simulieren.Sammeln Sie nach siebentägiger Interleukin-Ein-Beta-Behandlung einzelne Gewebe für die Analyse. Nachdem Sie die Einsätze mit einer sterilen Pinzette entfernt haben, drücken Sie eine Biopsienstanze durch die Mitte des Einsatzes, um das Gel zu entfernen und das Gel in PBS zu legen. Als nächstes schneiden Sie die osteochondralen Gele in zwei Hälften, während Sie die Genexpression beurteilen.Sammeln und zentrifugieren Sie ca. 1,5 Milliliter Medien aus jeder Medienquelle bei 14.000 g für 10 Minuten. Nachdem Sie das Sediment verworfen haben, frieren Sie das konditionierte Medium in flüssigem Stickstoff ein. Für die histologische Färbung und Immunfärbung wird zunächst das osteochondrale und synovialartige fibröse Gewebe (SFT-Proben) in 10%igem gepuffertem Formalin fixiert und in Ethanol aufsteigender Konzentrationen dehydriert.Löschen Sie die Probe in Xylol, betten Sie sie in Paraffin ein und schneiden Sie die Proben schließlich in sechs Mikrometer Dicke. Im Falle von Fettgewebe werden die 10%igen gepufferten formalen und fixierten Proben direkt mit ölroter O-Lösung oder BODIPY gefärbt. Die gewebespezifischen Phänotypen waren für die einzelnen Mikrogewebe gut erhalten.Alle Gewebe des Minigelenks wurden gesammelt, um ihre Phänotypen nach 28-tägiger Kultivierung zu analysieren. Die knöcherne Komponente des Mikrogewebes der osteochondralen Einheiten exprimierte hohe Konzentrationen von Osteocalcin. Im Knorpelanteil des Osteochondren exprimierte das Gewebe signifikant hohe Konzentrationen von Kollagen Typ zwei und Aggrecan.Die Expressionsniveaus der repräsentativen adipogenen Gene, Adiponektin und Leptin, waren im Fettgewebe höher. Die Ablagerung von Calciummineralien, alkalischer Phosphatase und Osteocalcin-Protein wurde vor allem in der Knochengröße von osteochondralen Mikrogeweben beobachtet. Die Knorpelseite des osteochondralen Gewebes zeigte gut retinierte Glykosaminoglykane und Kollagen Typ zwei.Die Expression der mit der Knorpelzellhypertrophie assoziierten Marker, Kollagen Typ 10 und indischer Igel, war nach 28 Tagen Kultur signifikant herunterreguliert. Im Fettgewebe wurde eine reichliche Ablagerung von Lipidtröpfchen festgestellt. Die Immunfluoreszenzfärbung zeigte nach vierwöchiger Kultivierung eine robuste Expression von Lubricin und Cadherin 11 durch die OFS.In einem Krankheitsmodell führte die Behandlung mit IL one beta zu Zellapoptose und erhöhten MMP-13-Spiegeln in der SFT. Der Knorpelabbau wurde mit IL one beta behandelt, was auf das Auftreten von Crosstalk zwischen dem osteochondralen Gewebe und der OFS hindeutet. Die therapeutische Wirksamkeit von Naproxen durch systemische Verabreichung zeigte einen reduzierten Knorpelabbau in IL one beta minijoint.Die realtime PCR zeigte, dass die vier potenziell krankheitsmodifizierenden Arthrosemedikamente den Knorpelverlust teilweise rückgängig machten. Die wichtigsten Schritte dieses Verfahrens sind die Vernetzung der Gele in den Inserts und die Insert-Platzierung im Bioreaktor. Der Chip ermöglicht es, den Beitrag anderer Risikofaktoren bei Arthrose zu untersuchen, wie z. B. Fettleibigkeit und mechanische Verletzungen.Es kann auch zur Untersuchung anderer Gelenkerkrankungen verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Plasma Lithography Oberflächenstrukturierung für die Erzeugung von Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Forschung

Biotechnik

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Endothelialisierten Mikrofluidik für ein Studium Mikrovaskuläre Wechselwirkungen in Hämatologische Krankheiten

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

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Umweltfreundliche kontrollierten Microtensile Testing von mechanisch-adaptive Polymer-Nanokomposite für<em&gt; Ex vivo</em&gt; Charakterisierung

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Patienten-spezifischer Modellierung des Herz: Schätzung der Ventrikuläre Faserorientierungen

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