Name: creation of a knee joint-on-a-chip for modeling joint diseases and testing drugs
Uploaded: 2023-01-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs at JoVE.com

מחקר זה נתמך בעיקר על ידי מימון מהמכונים הלאומיים לבריאות (UG3/UH3TR002136, UG3/UH3TR003090). בנוסף, אנו מודים לד"ר פול מנר (אוניברסיטת וושינגטון) על מתן דגימות הרקמה האנושית ולד"ר ג'יאן טאן על עזרתם בבידוד MSCs ויצירת מאגר התאים.

הפרוטוקול הבא עוקב אחר ההנחיות האתיות של אוניברסיטת פיטסבורג וועדת האתיקה של המחקר האנושי של אוניברסיטת פיטסבורג. מידע על החומרים ששימשו במחקר זה מופיע בטבלת החומרים.
1. ייצור ביוריאקטורים מודפסים בתלת-ממד
<ol><li>השתמשו בתוכנת מחשב כדי לתכנן ביוריאקטורים ...

<ol>
	<li>Safiri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional+and+national+burden+of+osteoarthritis+1990-2017:+A+systematic+analysis+of+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).</li><li>Lawrence, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+the+prevalence+of+arthritis+and+other+rheumatic+conditions+in+the+United+States:+Part+II.">Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States: Part II.</a> Arthritis and Rheumatism. 58 (1), 26-35 (2008).</li><li>Makarczyk, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+models+for+development+of+disease-modifying+osteoarthritis+drugs.">Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 27 (2), 124-138 (2021).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+osteoarthritis:+risk+factors,+regulatory+pathways+in+chondrocytes,+and+experimental+models.">Pathogenesis of osteoarthritis: risk factors, regulatory pathways in chondrocytes, and experimental models.</a> Biology. 9 (8), 194 (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+A+fast+track+for+engineered+human+tissues+in+drug+development.">Organs-on-a-chip: A fast track for engineered human tissues in drug development.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).</li><li>Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells:+aging+and+tissue+engineering+applications+to+enhance+bone+healing.">Bone marrow mesenchymal stem cells: aging and tissue engineering applications to enhance bone healing.</a> Biomaterials. 203, 96-110 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cell-derived+miniature+joint+system+for+disease+modeling+and+drug+testing.">Human mesenchymal stem cell-derived miniature joint system for disease modeling and drug testing.</a> Advanced Science. 9 (21), 2105909 (2022).</li><li>Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+tissue+engineering+application+of+injectable+gelatin+hydrogel+with+in+situ+visible-light-activated+gelation+capability+in+both+air+and+aqueous+solution.">Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution.</a> Tissue Engineering. Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).</li><li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate:+polymerization+rate+and+cytocompatibility.">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).</li><li>Lin, H., Lozito, T. P., Alexander, P. G., Gottardi, R., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+microphysiological+osteochondral+system+to+model+tissue+response+to+interleukin-1&#946;.">Stem cell-based microphysiological osteochondral system to model tissue response to interleukin-1&#946;.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2203-2212 (2014).</li><li>Yin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+macro-porous+titanium+ornamented+by+degradable+3D+gel/nHA+micro-scaffolds+for+bone+tissue+regeneration.">Hybrid macro-porous titanium ornamented by degradable 3D gel/nHA micro-scaffolds for bone tissue regeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 575 (2016).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteochondral+tissue+chip+derived+from+iPSCs:+Modeling+OA+pathologies+and+testing+drugs.">Osteochondral tissue chip derived from iPSCs: Modeling OA pathologies and testing drugs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 411 (2019).</li><li>Atukorala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovitis+in+knee+osteoarthritis:+A+precursor+of+disease.">Synovitis in knee osteoarthritis: A precursor of disease.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (2), 390-395 (2016).</li><li>Occhetta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperphysiological+compression+of+articular+cartilage+induces+an+osteoarthritic+phenotype+in+a+cartilage-on-a-chip+model.">Hyperphysiological compression of articular cartilage induces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 545-557 (2019).</li><li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+changes+associated+with+cartilage+trauma+using+human-cell-laden+hydrogel+cartilage+models.">Modeling early changes associated with cartilage trauma using human-cell-laden hydrogel cartilage models.</a> Stem Cell Research and Therapy. 13 (1), 400 (2022).</li><li>Elsissy, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+septic+arthritis+of+the+adult+native+knee+joint:+A+review.">Bacterial septic arthritis of the adult native knee joint: A review.</a> JBJS Reviews. 8 (1), 0059 (2020).</li><li>Romero-Lopez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+effects+on+mesenchymal+stem+cell+osteogenesis+in+a+three-dimensional+in+vitro+bone+model.">Macrophage effects on mesenchymal stem cell osteogenesis in a three-dimensional in vitro bone model.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (19-20), 1099-1111 (2020).</li></ol>

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול ליצירת מערכת מפרק על שבב של מפרק הברך, שבה עצמות, סחוס, רקמת שומן ורקמות דמויות סינוביום נוצרים מתאי MSC ומתורבתים יחד בתוך ביוריאקטור מותאם אישית. מערכת מרובת רכיבים זו, שמקורה בתאים אנושיים עם תכונות plug-and-play מייצגת כלי חדש לחקר הפתוגנזה של מחלות מפרקים ופיתוח ת...

מחלות מפרקים כמו דלקת מפרקים ניוונית (OA) שכיחות מאוד ומתישות ומייצגות גורם מוביל לנכות ברחבי העולם1. ההערכה היא כי בארה"ב לבדה, OA משפיע על 27 מיליון חולים ומופיע אצל 12.1% מהמבוגרים בגילאי 60 ומעלהשנתיים. למרבה הצער, רוב התרופות המשמשות כיום לניהול מחלות מפרקים הן פליאטיביות, ואין תרופות OA יעילות משנות מחלה (DMOADs) זמינות3. צורך רפואי זה נובע בעיקר מהיעדר מודל יעיל לחקר מנגנוני המחלה ופיתוח DMOADs פוטנציאליים. תרבית התאים הדו-ממדית (2D) הקונבנציונלית אינה משקפת את האופי התלת-ממדי של רקמות המפרקים, ותרבית צמחי הרקמה מעוכבת לעתים קרובות על ידי מוות תאי משמעותי ובדרך כלל אינה מצליחה לשכפל את חיבורי הרקמה הדינמיים4. בנוסף, הבדלים גנטיים ואנטומיים מפחיתים באופן משמעותי את הרלוונטיות הפיזיולוגית של מודלים של בעלי חיים4.
איברים על שבבים (OoCs), או מערכות מיקרופיזיולוגיות, הם תחום מחקר מבטיח בממשק של הנדסה, ביולוגיה ורפואה. פלטפורמות in vitro אלה הן יחידות פונקציונליות מינימליות המשכפלות תכונות בריאותיות או פתולוגיות מוגדרות של עמיתיהן in vivo 5. יתר על כן, מערכות ממוזערות אלה יכולות לארח תאים ומטריצות מגוונות ולדמות את האינטראקציות הביופיזיקליות והביוכימיות בין רקמות שונות. לכן, מערכת מיקרופיזיולוגית שיכולה לשחזר נאמנה את המפרק הסינוביאלי המקומי מבטיחה להציע פלטפורמה יעילה למידול מחלות מפרקים ופיתוח DMOADs פוטנציאליים.
תאי גזע מזנכימליים אנושיים (MSCs) יכולים להיות מבודדים מרקמות רבות בכל הגוף ולהתמיין לשושלות אוסטאוגניות, כונדרוגניות ואדיפוגניות6. MSCs שימשו בהצלחה להנדסה של רקמות שונות, כולל עצם, סחוס ורקמת שומן6, ולכן הם מייצגים מקור תאים מבטיח להנדסת רכיבי הרקמה של מפרק הברך. לאחרונה פיתחנו מערכת מיקרופיזיולוגית מיניאטורית המחקה מפרקים, בשם miniJoint, הכוללת רקמות עצם, סחוס, סיבי ושומןשמקורן ב-MSC 7. בפרט, העיצוב החדשני מאפשר הצלבת רקמות באמצעות זרימה או חלחול מיקרופלואידים (איור 1). כאן אנו מציגים את הפרוטוקולים לייצור רכיבי השבב, הנדסת רכיבי הרקמה, תרבית הרקמות המהונדסות בשבב ואיסוף הרקמות לאנליזות במורד הזרם.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64186/64186fig01.jpg"> איור 1: סכמה של שבב miniJoint המראה את הסידור של רכיבי הרקמה השונים והזרימות הבינוניות. OC = רקמה אוסטאוכונדרלית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64186/64186fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>I17018-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well non-tissue culture plate</td>
			<td>Corning Falcon&#174; Plates</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well non-tissue culture plate</td>
			<td>Corning Falcon&#174; Plates</td>
			<td>351147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringes</td>
			<td>BD Syringe Luer Lock Cascade Health</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue stain</td>
			<td>EK Industries</td>
			<td>1198</td>
			<td>1% w/v, pH 1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12491-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>12-460-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY&#174; fluorophore</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone morphogenic protein 7 (BMP7)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>16100110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexmethasome</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>02-05-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Shell 450 photopolymer in</td>
			<td>EnvisionTec</td>
			<td>RES-01-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini-Bio Products</td>
			<td>900-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>3505-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gelatin from bovine skin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>1003372809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>SH30588.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indomethacin</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>I7378-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>interleukin 1&#946;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leur-loc connectors</td>
			<td>Cole-Parmer Instruments</td>
			<td>45508-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>115388-93-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>1003129352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium bags</td>
			<td>KiYATEC</td>
			<td>FC045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic Anhydride</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>102378580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pointed forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>12000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon mold</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>RC00114P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon o-rings</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>ZMCCs1X5</td>
			<td>1mm x 5mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes SE, V&#233;lizy-Villacoublay, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blades</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Lagato210P, KD Scientific</td>
			<td>Z569631</td>
			<td>10 syringe racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-182 tissue culture flasks</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB012939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 150 mm</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB012925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor Beta (TGF-&#946;3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-36E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Flashlight</td>
			<td>KBS</td>
			<td>KB70109</td>
			<td>395 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vida Desktop 3D Printer</td>
			<td>EnvisionTec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>32222-06-3</td>
			<td>1,25-dihydroxyvitamin D3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creation of a knee joint-on-a-chip for modeling joint diseases and testing drugs

השכיחות הגבוהה של מחלות מפרקים מתישות כמו דלקת מפרקים ניוונית (OA) מהווה נטל סוציו-אקונומי גבוה. נכון לעכשיו, התרופות הזמינות המכוונות להפרעות מפרקים הן בעיקר פליאטיביות. הצורך הבלתי מסופק בתרופות OA יעילות משנות מחלה (DMOADs) נגרם בעיקר על ידי היעדר מודלים מתאימים לחקר מנגנוני המחלה ובדיקת DMOADs פוטנציאליים. במאמר זה נתאר את הקמתה של מערכת מיקרופיזיולוגית סינוביאלית זעירה המחקה מפרקים (miniJoint) הכוללת רכיבי רקמה שומניים, סיביים ואוסטאוכונדרליים שמקורם בתאי גזע מזנכימליים אנושיים (MSCs). כדי להשיג את המיקרו-רקמות התלת-ממדיות (3D), MSCs היו עטופים בג'לטין מתקרילט הניתן להצלבה לפני או אחרי התמיינות זו. מבני הרקמה עמוסי התאים שולבו אז בביוריאקטור שהודפס בתלת-ממד, ויצרו את המיני-ג'וינט. זרמים נפרדים של מדיה אוסטאוגנית, פיברוגנית ואדיפוגנית הוכנסו כדי לשמור על פנוטיפים של רקמות בהתאמה. זרם משותף נפוץ חודר דרך רקמות הסחוס, הסינוביאליות והשומן כדי לאפשר הצלבת רקמות. דפוס זרימה זה מאפשר השראת הפרעות באחד או יותר ממרכיבי הרקמה למחקרים מכניסטיים. יתר על כן, ניתן לבדוק DMOAD פוטנציאלי באמצעות "מתן מערכתי" דרך כל הזרמים הבינוניים או "מתן תוך מפרקי" על ידי הוספת התרופות רק לזרימה המדמה "נוזל סינוביאלי" משותף. לפיכך, המיני-ג'וינט יכול לשמש כפלטפורמה רב-תכליתית במבחנה ללימוד יעיל של מנגנוני מחלה ובדיקת תרופות ברפואה מותאמת אישית.

כל הרקמות של המיני-ג'וינט נאספו כדי לנתח את הפנוטיפים שלהן לאחר 28 ימי תרבית במיני-ג'וינט (איור 4A). כך פורט בפרסום הקודם שלנו7.
באמצעות שימוש ב-RT-qPCR, צביעה חיסונית וצביעה היסטולוגית, אושר שהפנוטיפים הספציפיים לרקמות נשמרו היטב עבור המיקרו-רקמות הבו?...

Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs at JoVE.com

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

אנו מספקים שיטות מפורטות ליצירת ארבעה סוגים של רקמות מתאי גזע מזנכימליים אנושיים, המשמשים לשחזור הסחוס, העצם, כרית השומן והסינוביום במפרק הברך האנושי. ארבע רקמות אלה משולבות בביוריאקטור מותאם אישית ומחוברות באמצעות מיקרופלואידיקה, ובכך יוצרות מפרק ברך על שבב.

יצירת מפרק ברך על שבב למידול מחלות מפרקים ובדיקת תרופות

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...

היכולת שלנו לחזות במדויק כיצד בני אדם מגיבים לתרופות במהלך ניסויים קליניים מוגבלת בשל היעדר מודלים פרה-קליניים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. המערכת המיקרופיזיולוגית הזו יכולה להתמודד עם הפער הזה. מערכת זו שמקורה בתאים אנושיים מחקה במדויק את כל אופי מחלת המפרקים של דלקת מפרקים ניוונית בברך האדם, מה שמאפשר בדיקה של תרופות לשינוי מחלה לפני ניסויים קליניים, מה שעשוי לחסוך מיליוני דולרים.התחל להכין ג'לטין מתקרילט, או GelMA, על ידי הוספת 17 גרם של ג'לטין מסוג B ל 500 מיליליטר של מים מזוקקים. ערבבו במשך 30 דקות על שייקר בחום של 37 מעלות צלזיוס והוסיפו 13 מיליליטר של אנהידריד מטאקרילי לפני ערבוב לילה על שייקר. למחרת, להכין סביב 60 מיליליטר של aliquots של GelMA לתוך שקיות דיאליזה.הניחו את כל שקיות הדיאליזה במים מזוקקים עם מוט ערבוב למשך שבעה ימים. החליפו את המים מספר פעמים ביום והשאירו את השקיות בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה. ביום השביעי, יוצקים את הג'למה לצלחת ומקפיאים אותה במינוס 80 מעלות צלזיוס לפני הליאופיליזציה.לאחר מכן, lyophilize GelMA על ידי הצבתו בתא ואקום של lyophilizer. יש להקפיד על ייבוש מלא לפני ההסרה מהליופיליזר. לאחר מכן, המיסו את הג'ל הליופילי בתמיסת המלח המאוזנת של הנקס בריכוז של 15% והתאימו את ה- pH ל -7.4 באמצעות כמות קטנה של נתרן הידרוקסידי.בהתבסס על הנפח שנרכש, להשלים את התמיסה עם אנטיביוטי antimycotic ו 0.15% ליתיום פניל פוספינאט, או LAP. הגן על פתרון GelMA מפני אור ואחסן אותו בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף. Autoclave 3D הדפיס תאים ביוריאקטורים בזרימה כפולה, מכסים ותוספות בשקיות autoclave ב 121 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות עם קיטור.ואז, במשך 20 דקות עם חום יבש. לאחר העיקור, יש להשרות את תאי הביוריאקטור, המכסים והתוספות ב-15 מיליליטר של PBS סטרילי למשך הלילה בתוך ארון הבטיחות הביולוגית, ולאחר מכן לייבוש מלא. באמצעות פיפטה של 1000 מיקרוליטר, יש להשהות 20 פעמים 10 לתאי גזע מזנכימליים מזנכימליים ממח העצם האנושי השישי, או MSCs, למיליליטר בתמיסת 15% GelMA.לאחר מכן, לחצו תבנית סיליקון סטרילית ויבשה על צלחת פטרי, באמצעות כפפות סטריליות. הכניסו תוספת אחת לכל חור של תבנית הסיליקון עם מלקחיים כאשר צד החור של האינסרט פונה כלפי מטה. לאחר שתסיים, הוסף כ -50 מיקרוליטר של תרחיף התא לכל תוספת באמצעות פיפטה של 200 מיקרוליטר.הצליבו את הג'ל בתוך האינסרט על ידי חשיפת החלק העליון לפנס UV באורך גל של 395 ננומטר למשך 1.5 דקות, ולאחר מכן הארת הצד השני למשך 30 שניות. בעזרת מלקחיים סטריליים, העבירו מיד את התוספות לשמונה מיליליטר של מצע גידול בתרבית שאינה רקמה שש פלטות באר ואפשרו לתאים להתאושש בן לילה. כדי ליזום את ההבחנה של רקמת השומן, להעביר את תוספות לשמונה מיליליטר של מדיום אדיפוגני ולגדל אותם במשך 28 ימים עם שינוי בינוני יומי.כדי להנדס את היחידות האוסטאוכונדרליות, הכניסו את התוספות לתאי ביוריאקטור בעלי זרימה כפולה, סגרו את הבארות והזרימו את שני הזרמים בנפרד בקצב זרימה של חמישה מיקרוליטר לדקה עם 35 מיליליטר של תווך אוסטאוגני ו-35 מיליליטר של תווך כונדרוגני. שמור על תאים להתמיינות במשך 28 ימים על ידי ביצוע שינויים מזרק דו שבועי עם סוגי המדיום המתאימים. כדי להפיק את הפיברובלסטים, להבדיל את MSCs בתרבית דו-ממדית בבקבוק תרבית תאי רקמה T 150 סנטימטר מרובע המכיל 20 מיליליטר של תווך פיברוגני למשך 21 יום.שמור על השינוי השבועי של המדיום. לאחר 21 יום, השתמש ארבעה מיליליטר של טריפסין כדי לנתק את התאים. עטפו את הג'לים התלת-ממדיים בתוך התוספות.כדי להשיג רקמה סיבית סינוביאלית, או SFT, בצע פרוטוקול דומה. חבר את צינורות הסיליקון, בעלי קוטר פנימי של 0.062 אינץ 'וקוטר חיצוני של 0.125 אינץ ', למוט הביוריאקטור הזעיר בקצה אחד ולמחברי נעילת פיתוי F 1/16th בקצה השני. לאחר מכן, autoclave bioreactors 3D minijoint יחד עם צינורות סיליקון ומכסים.הכינו והעמיסו 35 מיליליטר של מדיום שישמשו לתרבית המיני-משותפת למאגרים הבינוניים. השתמש במלקחיים ישרים כדי להעביר את יחידות האוסטאוכונדרל מהביוריאקטור בזרימה כפולה לבאר הימנית של הביוריאקטור המיני-מפרקי. מעבירים את החדרת רקמת השומן ואת החדרת הרקמה הסיבית לבארות השמאלית והאמצעית, בהתאמה, לפני כיסוי כל הבארות בעפעפיים מעוקרים.חבר את פתחי הקליפס הזעירים למאגרים הבינוניים ואת השקעים למזרקים. לאחר מכן, הרכיבו את המזרקים על משאבת מזרק. מעבירים את המשאבה והשבבים לאינקובטור.מניחים את המאגרים הבינוניים על קרח מחוץ לאינקובטור. הפעל את המשאבה במצב נסיגה, ומשך את התווך מהמאגר הבינוני לתוך תא הביוריאקטור המיני-מפרקי. המשך תהליך תרבית מיני-משותף זה במשך 28 ימים.כדי למדל את דלקת המפרקים ואת ניוון הסחוס, הוסף אינטרלוקין בטא אחד לזן הבינוני הפיברוגני ב -10 ננוגרם למיליליטר למשך שבעה ימים. הקפד להחליף את המזרק ביום השלישי לפני מתן אינטרלוקין טרי בטא אחת למדיום פיברוגני. לצורך בדיקת התרופה, לאחר שלושה ימים של טיפול בטא אחד באינטרלוקין, יש לתת את התרופה או בתווך המשותף, המדמה מתן תוך מפרקי, או בכל סוגי המדיום, המדמה מתן מערכתי.לאחר שבעה ימים של טיפול בטא אחד interleukin, לאסוף רקמות בודדות לניתוח. לאחר הסרת התוספות באמצעות מלקחיים סטריליים, דחפו אגרוף ביופסיה דרך מרכז האינסרט כדי להסיר את הג'ל והניחו את הג'ל ב-PBS. לאחר מכן, לחתוך את הג'ל osteochondral לשניים תוך הערכת ביטוי הגן.לאסוף צנטריפוגה סביב 1.5 מיליליטר של מדיה מכל מקור בינוני ב 14, 000 G במשך 10 דקות. לאחר השלכת המשקעים, הבזק להקפיא את המדיה המותנית בחנקן נוזלי. עבור צביעה היסטולוגית וצביעה חיסונית, ראשית, יש לתקן את הרקמה הסיבית האוסטאוכונדרלית והסינוביאלית, או דגימות SFT, בפורמלין חוצץ של 10% ולייבש אותן באתנול בריכוזים עולים.נקה את הדגימה בקסילן, הטמע אותם בפרפין, ולבסוף, חלק את הדגימות לעובי שישה מיקרומטר. במקרה של רקמת שומן, יש להכתים ישירות את הדגימות הפורמליות והקבועות החוצצות ב-10%, בתמיסת O אדומה שמן או BODIPY. הפנוטיפים הספציפיים לרקמות נשמרו היטב עבור רקמות המיקרו הבודדות.כל רקמות המיני-מפרק נאספו כדי לנתח את הפנוטיפים שלהן לאחר 28 ימי תרבית. המרכיב האוסאוסאוסי ברקמות המיקרו של יחידות האוסטאוכונדרל ביטא רמות גבוהות של אוסטיאוקלצין. בחלק הסחוס של האוסטאוכונדרל, הרקמות ביטאו רמות גבוהות באופן משמעותי של קולגן מסוג 2 ואגרקן.רמות הביטוי של גנים אדיפוגניים מייצגים, אדיפונקטין ולפטין היו גבוהות יותר ברקמת השומן. שקיעת מינרלי סידן, פוספטאז אלקליין וחלבון אוסטיאוקלצין נצפתה בעיקר בגודל העצם של רקמות מיקרו אוסטאוכונדרליות. צד הסחוס של רקמות אוסטאוכונדרליות הראה גליקוזאמינוגליקן שמורה היטב וקולגן מסוג שתיים.הביטוי של סמנים הקשורים להיפרטרופיה של כונדרוציטים, קולגן מסוג 10 וקיפוד הודי, היה מווסת באופן משמעותי לאחר 28 ימי תרבית. שקיעת טיפות שומנים בשפע נמצאה ברקמת השומן. הצביעה האימונופלואורסצנטית הראתה סיכה חזקה וביטוי קדרין 11 על ידי SFT לאחר ארבעה שבועות של תרבית.במודל המחלה, טיפול בטא IL one הביא לאפופטוזיס תאי ולרמות גבוהות של MMP-13 ב-SFT. השפלת הסחוס טופלה על ידי IL one beta, מה שמרמז על התרחשות של crosstalk בין הרקמות האוסטאוכונדרליות לבין SFT. היעילות הטיפולית של נפרוקסן באמצעות מתן סיסטמי הראתה ירידה בפירוק הסחוס במיני מפרק בטא IL.בדיקת PCR בזמן אמת הצביעה על כך שארבע התרופות הפוטנציאליות לשינוי אוסטיאוארתריטיס הפכו חלקית את אובדן הסחוס. השלבים החשובים ביותר של הליך זה כוללים קישור צולב של הג'לים בתוספות ואת מיקום החדרת לתוך bioreactor. השבב מאפשר לחקור את תרומתם של גורמי סיכון אחרים המוצעים בדלקת מפרקים ניוונית, כגון השמנת יתר ופגיעה מכנית.זה יכול לשמש גם כדי ללמוד מחלות מפרקים אחרות.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Surface פלזמה ליתוגרפיה דפוסים של יצירת רשתות Cell

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

מיקרופלואידיקה Endothelialized לחקר אינטראקציות כלי הדם במחלות המטולוגיות

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

בדיקת Microtensile לסביבה מבוקרת של nanocomposites הפולימר מכאני-מסתגל ל<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; אפיון

Implantable microdevices are gaining significant attention for several biomedical applications1-4. Such devices have been made from a range of materials, ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

דוגמנות מטופל ספציפי של לב: אומדן של אורינטציות סיבי חדרית

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

קביעת תעריף הובלת xenobiotics ו ננו מעבר לשליה באמצעות<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; דגם זלוף שליה אנושי

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

בדיקת רגישות אנטיביוטית הנגרמת על ידי מתח על שבב

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

Establishment of a Surgically-induced Model in Mice to Investigate the Protective Role of Progranulin in Osteoarthritis

הקמת דגם בניתוח מושרה בעכברים כדי לחקור את תפקיד מגן של progranulin בדלקת מפרקים ניוונית

Destabilization of medial meniscus (DMM) model is an important tool for studying the pathophysiological roles of numerous arthritis associated molecules ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

ייצור מיקרופלואידי של סיבים פולימריים וביוהיברידים עם גודל וצורה מעוצבים מראש

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Oscillation and Reaction Board Techniques for Estimating Inertial Properties of a Below-knee Prosthesis

טכניקות תנודה ודירקטוריון תגובה למאפייני אינרציאליות אומדן של תותב מתחת לברך

The purpose of this study was two-fold: 1) demonstrate a technique that can be used to directly estimate the inertial properties of a below-knee ...

Creation of Patient-Specific Silicone Cardiac Models with Applications in Pre-surgical Plans and Hands-on Training

יצירת מודלים לב סיליקון ספציפיים למטופל עם יישומים בתוכניות טרום ניתוחיות והכשרה מעשית

Three dimensional&#160;models can be a valuable tool for surgeons as they develop surgical plans and medical fellows as they learn about complex cases. In ...