Name: creation of a knee joint-on-a-chip for modeling joint diseases and testing drugs
Uploaded: 2023-01-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs at JoVE.com

Questa ricerca è stata sostenuta principalmente dal finanziamento del National Institutes of Health (UG3 / UH3TR002136, UG3 / UH3TR003090). Inoltre, ringraziamo il Dr. Paul Manner (Università di Washington) per aver fornito i campioni di tessuto umano e il Dr. Jian Tan per il loro aiuto nell'isolamento delle MSC e nella creazione del pool cellulare.

Il seguente protocollo segue le linee guida etiche dell'Università di Pittsburgh e del comitato etico per la ricerca umana dell'Università di Pittsburgh. Le informazioni sui materiali utilizzati in questo studio sono elencate nella tabella dei materiali.
1. Produzione di bioreattori stampati in 3D
<ol><li>Utilizzare un software per computer per progettare bioreattori osteocondrali (Figura 2A) e miniJoint (...

<ol>
	<li>Safiri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional+and+national+burden+of+osteoarthritis+1990-2017:+A+systematic+analysis+of+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).</li><li>Lawrence, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+the+prevalence+of+arthritis+and+other+rheumatic+conditions+in+the+United+States:+Part+II.">Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States: Part II.</a> Arthritis and Rheumatism. 58 (1), 26-35 (2008).</li><li>Makarczyk, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+models+for+development+of+disease-modifying+osteoarthritis+drugs.">Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 27 (2), 124-138 (2021).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+osteoarthritis:+risk+factors,+regulatory+pathways+in+chondrocytes,+and+experimental+models.">Pathogenesis of osteoarthritis: risk factors, regulatory pathways in chondrocytes, and experimental models.</a> Biology. 9 (8), 194 (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+A+fast+track+for+engineered+human+tissues+in+drug+development.">Organs-on-a-chip: A fast track for engineered human tissues in drug development.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).</li><li>Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells:+aging+and+tissue+engineering+applications+to+enhance+bone+healing.">Bone marrow mesenchymal stem cells: aging and tissue engineering applications to enhance bone healing.</a> Biomaterials. 203, 96-110 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cell-derived+miniature+joint+system+for+disease+modeling+and+drug+testing.">Human mesenchymal stem cell-derived miniature joint system for disease modeling and drug testing.</a> Advanced Science. 9 (21), 2105909 (2022).</li><li>Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+tissue+engineering+application+of+injectable+gelatin+hydrogel+with+in+situ+visible-light-activated+gelation+capability+in+both+air+and+aqueous+solution.">Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution.</a> Tissue Engineering. Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).</li><li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate:+polymerization+rate+and+cytocompatibility.">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).</li><li>Lin, H., Lozito, T. P., Alexander, P. G., Gottardi, R., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+microphysiological+osteochondral+system+to+model+tissue+response+to+interleukin-1&#946;.">Stem cell-based microphysiological osteochondral system to model tissue response to interleukin-1&#946;.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2203-2212 (2014).</li><li>Yin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+macro-porous+titanium+ornamented+by+degradable+3D+gel/nHA+micro-scaffolds+for+bone+tissue+regeneration.">Hybrid macro-porous titanium ornamented by degradable 3D gel/nHA micro-scaffolds for bone tissue regeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 575 (2016).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteochondral+tissue+chip+derived+from+iPSCs:+Modeling+OA+pathologies+and+testing+drugs.">Osteochondral tissue chip derived from iPSCs: Modeling OA pathologies and testing drugs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 411 (2019).</li><li>Atukorala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovitis+in+knee+osteoarthritis:+A+precursor+of+disease.">Synovitis in knee osteoarthritis: A precursor of disease.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (2), 390-395 (2016).</li><li>Occhetta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperphysiological+compression+of+articular+cartilage+induces+an+osteoarthritic+phenotype+in+a+cartilage-on-a-chip+model.">Hyperphysiological compression of articular cartilage induces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 545-557 (2019).</li><li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+changes+associated+with+cartilage+trauma+using+human-cell-laden+hydrogel+cartilage+models.">Modeling early changes associated with cartilage trauma using human-cell-laden hydrogel cartilage models.</a> Stem Cell Research and Therapy. 13 (1), 400 (2022).</li><li>Elsissy, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+septic+arthritis+of+the+adult+native+knee+joint:+A+review.">Bacterial septic arthritis of the adult native knee joint: A review.</a> JBJS Reviews. 8 (1), 0059 (2020).</li><li>Romero-Lopez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+effects+on+mesenchymal+stem+cell+osteogenesis+in+a+three-dimensional+in+vitro+bone+model.">Macrophage effects on mesenchymal stem cell osteogenesis in a three-dimensional in vitro bone model.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (19-20), 1099-1111 (2020).</li></ol>

In questo articolo, presentiamo un protocollo per la creazione di un sistema articolato del ginocchio su un chip, in cui ossa, cartilagine, tessuto adiposo e tessuti simil-sinoviali sono formati da MSC e co-coltivati all'interno di un bioreattore personalizzato. Questo sistema multicomponente derivato da cellule umane con funzionalità plug-and-play rappresenta un nuovo strumento per lo studio della patogenesi delle malattie articolari e lo sviluppo di farmaci. 
Dato che tessuti diversi favori...

Le malattie articolari come l'osteoartrite (OA) sono altamente diffuse e debilitanti e rappresentano una delle principali cause di disabilità in tutto il mondo1. Si stima che solo negli Stati Uniti, l'OA colpisca 27 milioni di pazienti e si verifichi nel 12,1% degli adulti di età pario superiore a 60 anni. Sfortunatamente, la maggior parte dei farmaci attualmente utilizzati per gestire le malattie articolari sono palliativi e non sono disponibili farmaci OA modificanti la malattia (DMOAD) efficaci3. Questo bisogno medico insoddisfatto deriva principalmente dall'assenza di un modello efficace per studiare i meccanismi della malattia e sviluppare potenziali DMOAD. La coltura cellulare bidimensionale convenzionale (2D) non riflette la natura 3D dei tessuti articolari e la coltura degli espianti tissutali è spesso ostacolata da una significativa morte cellulare e di solito non riesce a replicare le interconnessioni tissutali dinamiche4. Inoltre, le differenze genetiche e anatomiche riducono significativamente la rilevanza fisiologica dei modelli animali4.
Gli organi su chip (OoC), o sistemi microfisiologici, sono un campo di ricerca promettente all'interfaccia tra ingegneria, biologia e medicina. Queste piattaforme in vitro sono unità funzionali minime che replicano caratteristiche sane o patologiche definite delle loro controparti in vivo 5. Inoltre, questi sistemi miniaturizzati possono ospitare diverse cellule e matrici e simulare le interazioni biofisiche e biochimiche tra diversi tessuti. Pertanto, un sistema microfisiologico in grado di ricapitolare fedelmente l'articolazione sinoviale nativa promette di offrire una piattaforma efficace per modellare le malattie articolari e sviluppare potenziali DMOAD.
Le cellule staminali mesenchimali umane (MSC) possono essere isolate da molti tessuti in tutto il corpo e differenziate in linee osteogeniche, condrogeniche e adipogeniche6. Le MSC sono state utilizzate con successo per ingegnerizzare vari tessuti, tra cui ossa, cartilagine e tessuto adiposo6, il che significa che rappresentano una fonte cellulare promettente per l'ingegneria dei componenti tissutali dell'articolazione del ginocchio. Recentemente abbiamo sviluppato un sistema microfisiologico miniaturizzato che imita le articolazioni, chiamato miniJoint, che comprende ossa, cartilagine, tessuti fibrosi e adiposi derivati da MSC7. In particolare, il nuovo design consente la diafonia tissutale mediante flusso microfluidico o permeazione (Figura 1). Qui presentiamo i protocolli per la fabbricazione dei componenti del chip, l'ingegneria dei componenti tissutali, la coltura dei tessuti ingegnerizzati nel chip e la raccolta dei tessuti per le analisi a valle.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64186/64186fig01.jpg"> Figura 1: Schema del chip miniJoint che mostra la disposizione dei diversi componenti tissutali e dei flussi del mezzo. OC = tessuto osteocondrale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64186/64186fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>I17018-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well non-tissue culture plate</td>
			<td>Corning Falcon&#174; Plates</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well non-tissue culture plate</td>
			<td>Corning Falcon&#174; Plates</td>
			<td>351147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringes</td>
			<td>BD Syringe Luer Lock Cascade Health</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue stain</td>
			<td>EK Industries</td>
			<td>1198</td>
			<td>1% w/v, pH 1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12491-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>12-460-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY&#174; fluorophore</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone morphogenic protein 7 (BMP7)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>16100110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexmethasome</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>02-05-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Shell 450 photopolymer in</td>
			<td>EnvisionTec</td>
			<td>RES-01-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini-Bio Products</td>
			<td>900-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>3505-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gelatin from bovine skin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>1003372809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>SH30588.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indomethacin</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>I7378-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>interleukin 1&#946;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leur-loc connectors</td>
			<td>Cole-Parmer Instruments</td>
			<td>45508-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>115388-93-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>1003129352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium bags</td>
			<td>KiYATEC</td>
			<td>FC045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic Anhydride</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>102378580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pointed forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>12000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon mold</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>RC00114P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon o-rings</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>ZMCCs1X5</td>
			<td>1mm x 5mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes SE, V&#233;lizy-Villacoublay, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blades</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Lagato210P, KD Scientific</td>
			<td>Z569631</td>
			<td>10 syringe racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-182 tissue culture flasks</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB012939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 150 mm</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB012925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor Beta (TGF-&#946;3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-36E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Flashlight</td>
			<td>KBS</td>
			<td>KB70109</td>
			<td>395 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vida Desktop 3D Printer</td>
			<td>EnvisionTec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>32222-06-3</td>
			<td>1,25-dihydroxyvitamin D3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creation of a knee joint-on-a-chip for modeling joint diseases and testing drugs

L'elevata prevalenza di malattie articolari debilitanti come l'osteoartrite (OA) rappresenta un elevato onere socioeconomico. Attualmente, i farmaci disponibili che colpiscono i disturbi articolari sono per lo più palliativi. Il bisogno insoddisfatto di farmaci OA modificanti la malattia (DMOAD) efficaci è stato causato principalmente dall'assenza di modelli appropriati per studiare i meccanismi della malattia e testare potenziali DMOAD. Qui descriviamo la creazione di un sistema microfisiologico che imita l'articolazione sinoviale in miniatura (miniJoint) comprendente componenti del tessuto adiposo, fibroso e osteocondrale derivati da cellule staminali mesenchimali umane (MSC). Per ottenere i microtessuti tridimensionali (3D), le MSC sono state incapsulate in gelatina metacrilata fotocrosslinkabile prima o dopo la differenziazione. I costrutti tissutali carichi di cellule sono stati quindi integrati in un bioreattore stampato in 3D, formando il miniJoint. Sono stati introdotti flussi separati di mezzi osteogenici, fibrogenici e adipogeni per mantenere i rispettivi fenotipi tissutali. Un flusso comunemente condiviso è stato perfuso attraverso la cartilagine, la sinoviale e i tessuti adiposi per consentire la diafonia tissutale. Questo modello di flusso consente l'induzione di perturbazioni in uno o più componenti tissutali per studi meccanicistici. Inoltre, i potenziali DMOAD possono essere testati tramite "somministrazione sistemica" attraverso tutti i flussi di mezzo o "somministrazione intraarticolare" aggiungendo i farmaci solo al flusso di simulazione del "liquido sinoviale" condiviso. Pertanto, il miniJoint può fungere da piattaforma versatile in vitro per studiare in modo efficiente i meccanismi della malattia e testare i farmaci nella medicina personalizzata.

Tutti i tessuti del miniJoint sono stati raccolti per analizzare i loro fenotipi dopo 28 giorni di coltura nel miniJoint (Figura 4A). Questo è stato dettagliato nella nostra precedente pubblicazione7.
Attraverso l'uso di RT-qPCR, immunocolorazione e colorazione istologica, è stato confermato che i fenotipi tessuto-specifici erano ben mantenuti per i singoli microtessuti (Figura 4). Ad esempio, la componente o...

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Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

Forniamo metodi dettagliati per generare quattro tipi di tessuti da cellule staminali mesenchimali umane, che vengono utilizzate per ricapitolare la cartilagine, l'osso, il cuscinetto adiposo e la sinovia nell'articolazione del ginocchio umano. Questi quattro tessuti sono integrati in un bioreattore personalizzato e collegati attraverso la microfluidica, generando così un'articolazione del ginocchio su un chip.

Creazione di un ginocchio joint-on-a-chip per la modellazione delle malattie articolari e la sperimentazione di farmaci

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...

La nostra capacità di prevedere con precisione come gli esseri umani rispondono ai farmaci durante gli studi clinici è limitata a causa della mancanza di modelli preclinici fisiologicamente rilevanti. Questo sistema microfisiologico può affrontare tale disparità. Questo sistema derivato da cellule umane imita accuratamente l'intera natura della malattia articolare dell'osteoartrite nel ginocchio umano, che consente di testare i farmaci per l'osteoartrite modificanti la malattia prima degli studi clinici, risparmiando potenzialmente milioni di dollari.Iniziare a preparare gelatina metacrilata, o GelMA, aggiungendo 17 grammi di gelatina di tipo B a 500 millilitri di acqua distillata. Mescolare per 30 minuti su uno shaker a 37 gradi Celsius e aggiungere 13 millilitri di anidride metacrilica prima di mescolare durante la notte su uno shaker. Il giorno successivo, preparare circa 60 millilitri di aliquote del GelMA in sacche di dialisi.Mettere tutte le sacche di dialisi in acqua distillata con una barra di mescolamento per sette giorni. Cambia l'acqua più volte al giorno e lascia i sacchetti a quattro gradi Celsius durante la notte. Il settimo giorno, versare il GelMA in un piatto e congelarlo a meno 80 gradi Celsius prima della liofilizzazione.Quindi, liofilizzare il GelMA posizionandolo nella camera a vuoto di un liofilizzatore. Assicurarsi la completa asciugatura prima della rimozione dal liofilizzatore. Quindi, sciogliere il GelMA liofilizzato nella soluzione salina bilanciata di Hanks al 15% di concentrazione e regolare il pH a 7,4 utilizzando una piccola quantità di idrossido di sodio.Sulla base del volume acquisito, integrare la soluzione con antibiotico antimicotico e 0,15% litio fenil fosfinato, o LAP. Proteggere la soluzione GelMA dalla luce e conservarla a meno 20 gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo. Camere di bioreattore a doppio flusso stampate in 3D in autoclave, coperchi e inserti in sacchetti per autoclave a 121 gradi Celsius per 20 minuti con vapore.E poi, per 20 minuti con calore secco. Dopo la sterilizzazione, immergere le camere del bioreattore, i coperchi e gli inserti in 15 millilitri di PBS sterile durante la notte all'interno dell'armadio di biosicurezza, seguito da un'asciugatura completa. Utilizzando una pipetta da 1000 microlitri, risospendere 20 volte 10 alla sesta cellula staminalizzata mesenchimale derivata dal midollo osseo umano, o MSC, per millilitro di cellule in una soluzione di GelMA al 15%.Quindi, premere uno stampo di silicone sterile e asciutto contro una capsula di Petri, usando guanti sterili. Inserire un inserto in ciascun foro dello stampo in silicone con una pinza con il lato del foro dell'inserto rivolto verso il basso. Una volta fatto, aggiungere circa 50 microlitri di sospensione cellulare per inserto utilizzando una pipetta da 200 microlitri.Reticolare il gel all'interno dell'inserto esponendo la parte superiore a una torcia UV a lunghezza d'onda di 395 nanometri per 1,5 minuti, quindi illuminando l'altro lato per 30 secondi. Con una pinza sterile, trasferire immediatamente gli inserti in otto millilitri di terreno di coltura in una piastra a sei pozzetti di coltura non tissutale e consentire alle cellule di recuperare durante la notte. Per avviare la differenziazione del tessuto adiposo, trasferire gli inserti in otto millilitri di terreno adipogeno e coltivarli per 28 giorni con cambio giornaliero del mezzo.Per progettare le unità osteocondrali, posizionare gli inserti nelle camere del bioreattore a doppio flusso, tappare i pozzetti e infondere i due flussi separatamente a una portata di cinque microlitri al minuto con 35 millilitri di mezzo osteogenico e 35 millilitri di mezzo condrogeno. Mantenere le cellule per la differenziazione per 28 giorni eseguendo cambi di siringa bisettimanali con i rispettivi tipi di mezzo. Per ricavare i fibroblasti, differenziare le MSC in coltura 2D in un matraccio di coltura di cellule tissutali T di 150 centimetri quadrati contenente 20 millilitri di terreno fibrogenico per 21 giorni.Mantenere il cambio settimanale del mezzo. Dopo 21 giorni, utilizzare quattro millilitri di tripsina per staccare le cellule. Incapsula i gel 3D all'interno degli inserti.Per ottenere tessuto fibroso simil-sinoviale, o SFT, seguire un protocollo simile. Collegare il tubo in silicone, con un diametro interno di 0,062 pollici e un diametro esterno di 0,125 pollici, alla barra del bioreattore minijoint a un'estremità e ai connettori di blocco esca F 1/16th all'altra estremità. Quindi, autoclavare i bioreattori minijoint 3D insieme ai tubi e ai coperchi in silicone.Preparare e caricare 35 millilitri di terreno da utilizzare per la coltura miniarticolare nei serbatoi medi. Utilizzare una pinza dritta per trasferire le unità osteocondrali dal bioreattore a doppio flusso al pozzetto destro del bioreattore miniarticolare. Trasferire l'inserto di tessuto adiposo e l'inserto di tessuto fibroso nei pozzetti sinistro e centrale, rispettivamente, prima di coprire tutti i pozzetti con coperchi sterilizzati.Collegare le prese a clip minijoint ai serbatoi medi e le uscite alle siringhe. Quindi, montare le siringhe su una pompa a siringa. Trasferire la pompa e i trucioli in un'incubatrice.Posizionare i serbatoi medi sul ghiaccio all'esterno dell'incubatore. Far funzionare la pompa in modalità di prelievo, aspirando il mezzo dal serbatoio del mezzo nella camera del bioreattore minijoint. Continuare questo processo di coltura miniarticolare per 28 giorni.Per modellare l'infiammazione articolare e la degenerazione della cartilagine, aggiungere l'interleuchina una beta al ceppo medio fibrogenico a 10 nanogrammi per millilitro per sette giorni. Assicurarsi di sostituire la siringa il terzo giorno prima di fornire interleuchina fresca una beta al mezzo fibrogenico. Per il test farmacologico, dopo tre giorni di trattamento con interleuchina una beta, somministrare il farmaco sia nel mezzo condiviso, simulando una somministrazione intraarticolare, sia in tutti i tipi di mezzo, simulando una somministrazione sistemica.Dopo sette giorni di trattamento con interleuchina una beta, raccogliere singoli tessuti per l'analisi. Dopo aver rimosso gli inserti con una pinza sterile, spingere un pugno bioptico attraverso il centro dell'inserto per rimuovere il gel e posizionare il gel in PBS. Quindi, tagliare i gel osteocondrali a metà mentre si valuta l'espressione genica.Raccogliere e centrifugare circa 1,5 millilitri di terreno da ciascuna fonte di mezzo a 14.000 G per 10 minuti. Dopo aver scartato il sedimento, congelare i mezzi condizionati in azoto liquido. Per la colorazione istologica e la colorazione immuno, in primo luogo, fissare il tessuto fibroso osteocondrale e simil-sinoviale, o campioni SFT, in formalina tamponata al 10% e disidratarli in etanolo di concentrazioni ascendenti.Eliminare il campione in xilene, incorporarli in paraffina e, infine, sezionare i campioni in uno spessore di sei micrometri. Nel caso del tessuto adiposo, colorare direttamente i campioni formali e fissi tamponati al 10%, con una soluzione di O rosso olio o BODIPY. I fenotipi specifici del tessuto erano ben mantenuti per i singoli micro tessuti.Tutti i tessuti della miniarticolazione sono stati raccolti per analizzare i loro fenotipi dopo 28 giorni di coltura. La componente ossea dei microtessuti delle unità osteocondrali esprimeva alti livelli di osteocalcina. Nella porzione cartilaginea dell'osteocondrale, i tessuti esprimevano livelli significativamente elevati di collagene di tipo due e aggrecano.I livelli di espressione dei geni adipogenici rappresentativi, dell'adiponectina e della leptina erano più alti nel tessuto adiposo. La deposizione di minerali di calcio, fosfatasi alcalina e proteina osteocalcina è stata osservata principalmente nelle dimensioni ossee dei micro tessuti osteocondrali. Il lato cartilagineo dei tessuti osteocondrali ha mostrato glicosaminoglicani e collagene di tipo due ben conservati.L'espressione dei marcatori associati all'ipertrofia dei condrociti, collagene di tipo 10 e riccio indiano, è stata significativamente sotto-regolata dopo 28 giorni di coltura. Un'abbondante deposizione di goccioline lipidiche è stata trovata nel tessuto adiposo. La colorazione immunofluorescente ha mostrato una robusta espressione di lubricina e caderina 11 da parte della SFT dopo quattro settimane di coltura.In un modello di malattia, il trattamento con IL one beta ha provocato apoptosi cellulare e livelli elevati di MMP-13 nella SFT. La degradazione della cartilagine è stata trattata con IL one beta, suggerendo l'insorgenza di diafonia tra i tessuti osteocondrali e SFT. L'efficacia terapeutica del naprossene attraverso la somministrazione sistemica ha mostrato una ridotta degradazione della cartilagine in IL one beta minijoint.La PCR in tempo reale ha indicato che i quattro potenziali farmaci modificanti l'osteoartrite hanno parzialmente invertito la perdita di cartilagine. I passaggi più importanti di questa procedura includono la reticolazione dei gel negli inserti e il posizionamento dell'inserto nel bioreattore. Il chip consente di studiare il contributo di altri fattori di rischio offerti nell'osteoartrite, come l'obesità e le lesioni meccaniche.Può anche essere usato per studiare altre malattie articolari.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

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Ricerca

Bioingegneria

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Microfluidica Endothelialized per lo studio delle interazioni microvascolari nelle patologie ematologiche

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

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