Name: creation of a knee joint-on-a-chip for modeling joint diseases and testing drugs
Uploaded: 2023-01-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs at JoVE.com

Denne forskningen ble primært støttet av finansiering fra National Institutes of Health (UG3 / UH3TR002136, UG3 / UH3TR003090). I tillegg takker vi Dr. Paul Manner (University of Washington) for å gi de menneskelige vevsprøvene og Dr. Jian Tan for deres hjelp med å isolere MSCene og skape cellebassenget.

Følgende protokoll følger de etiske retningslinjene fra University of Pittsburgh og komiteen for menneskelig forskningsetikk ved University of Pittsburgh. Informasjon om materialene som ble brukt i denne studien er oppført i materialfortegnelsen.
1. Produksjon av 3D-printede bioreaktorer
<ol><li>Bruk et dataprogram til å designe osteokondrale (figur 2A) og miniJoint bioreaktorer (figur 2B) som i...

<ol>
	<li>Safiri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional+and+national+burden+of+osteoarthritis+1990-2017:+A+systematic+analysis+of+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).</li><li>Lawrence, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+the+prevalence+of+arthritis+and+other+rheumatic+conditions+in+the+United+States:+Part+II.">Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States: Part II.</a> Arthritis and Rheumatism. 58 (1), 26-35 (2008).</li><li>Makarczyk, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+models+for+development+of+disease-modifying+osteoarthritis+drugs.">Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 27 (2), 124-138 (2021).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+osteoarthritis:+risk+factors,+regulatory+pathways+in+chondrocytes,+and+experimental+models.">Pathogenesis of osteoarthritis: risk factors, regulatory pathways in chondrocytes, and experimental models.</a> Biology. 9 (8), 194 (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+A+fast+track+for+engineered+human+tissues+in+drug+development.">Organs-on-a-chip: A fast track for engineered human tissues in drug development.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).</li><li>Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells:+aging+and+tissue+engineering+applications+to+enhance+bone+healing.">Bone marrow mesenchymal stem cells: aging and tissue engineering applications to enhance bone healing.</a> Biomaterials. 203, 96-110 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cell-derived+miniature+joint+system+for+disease+modeling+and+drug+testing.">Human mesenchymal stem cell-derived miniature joint system for disease modeling and drug testing.</a> Advanced Science. 9 (21), 2105909 (2022).</li><li>Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+tissue+engineering+application+of+injectable+gelatin+hydrogel+with+in+situ+visible-light-activated+gelation+capability+in+both+air+and+aqueous+solution.">Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution.</a> Tissue Engineering. Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).</li><li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate:+polymerization+rate+and+cytocompatibility.">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).</li><li>Lin, H., Lozito, T. P., Alexander, P. G., Gottardi, R., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+microphysiological+osteochondral+system+to+model+tissue+response+to+interleukin-1&#946;.">Stem cell-based microphysiological osteochondral system to model tissue response to interleukin-1&#946;.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2203-2212 (2014).</li><li>Yin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+macro-porous+titanium+ornamented+by+degradable+3D+gel/nHA+micro-scaffolds+for+bone+tissue+regeneration.">Hybrid macro-porous titanium ornamented by degradable 3D gel/nHA micro-scaffolds for bone tissue regeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 575 (2016).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteochondral+tissue+chip+derived+from+iPSCs:+Modeling+OA+pathologies+and+testing+drugs.">Osteochondral tissue chip derived from iPSCs: Modeling OA pathologies and testing drugs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 411 (2019).</li><li>Atukorala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovitis+in+knee+osteoarthritis:+A+precursor+of+disease.">Synovitis in knee osteoarthritis: A precursor of disease.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (2), 390-395 (2016).</li><li>Occhetta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperphysiological+compression+of+articular+cartilage+induces+an+osteoarthritic+phenotype+in+a+cartilage-on-a-chip+model.">Hyperphysiological compression of articular cartilage induces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 545-557 (2019).</li><li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+changes+associated+with+cartilage+trauma+using+human-cell-laden+hydrogel+cartilage+models.">Modeling early changes associated with cartilage trauma using human-cell-laden hydrogel cartilage models.</a> Stem Cell Research and Therapy. 13 (1), 400 (2022).</li><li>Elsissy, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+septic+arthritis+of+the+adult+native+knee+joint:+A+review.">Bacterial septic arthritis of the adult native knee joint: A review.</a> JBJS Reviews. 8 (1), 0059 (2020).</li><li>Romero-Lopez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+effects+on+mesenchymal+stem+cell+osteogenesis+in+a+three-dimensional+in+vitro+bone+model.">Macrophage effects on mesenchymal stem cell osteogenesis in a three-dimensional in vitro bone model.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (19-20), 1099-1111 (2020).</li></ol>

I denne artikkelen presenterer vi en protokoll for å lage et kneledd-on-a-chip-system, hvor bein, brusk, fettvev og synoviumlignende vev dannes fra MSC og dyrkes sammen i en tilpasset bioreaktor. Dette multikomponent, humane celleavledede systemet med plug-and-play-funksjoner representerer et nytt verktøy for å studere patogenesen av leddsykdommer og utvikle medisiner. 
Gitt at forskjellige vev favoriserer spesifikke kulturmedier, er det avgjørende å gi det respektive mediet for hvert vev...

Leddsykdommer som slitasjegikt (OA) er svært utbredt og ødeleggende og representerer en ledende årsak til funksjonshemming over hele verden1. Det er anslått at i USA alene påvirker OA 27 millioner pasienter og forekommer hos 12.1% av voksne i alderen 60 og over2. Dessverre er de fleste legemidler som for tiden brukes til å håndtere leddsykdommer, palliative, og ingen effektive sykdomsmodifiserende OA-legemidler (DMOAD) er tilgjengelige3. Dette udekkede medisinske behovet stammer først og fremst fra fraværet av en effektiv modell for å studere sykdomsmekanismer og utvikle potensielle DMOADer. Den konvensjonelle todimensjonale (2D) cellekulturen reflekterer ikke 3D-naturen til leddvev, og kulturen av vevseksplanter hindres ofte av betydelig celledød og klarer vanligvis ikke å replikere de dynamiske vevsforbindelsene4. I tillegg reduserer genetiske og anatomiske forskjeller signifikant den fysiologiske relevansen av dyremodeller4.
Organs-on-chips (OoC), eller mikrofysiologiske systemer, er et lovende forskningsfelt i grensesnittet mellom ingeniørfag, biologi og medisin. Disse in vitro-plattformene er minimale funksjonelle enheter som replikerer definerte sunne eller patologiske trekk ved deres in vivo-kolleger 5. Videre kan disse miniatyriserte systemene være vert for forskjellige celler og matriser og simulere de biofysiske og biokjemiske interaksjonene mellom forskjellige vev. Derfor lover et mikrofysiologisk system som trofast kan rekapitulere det opprinnelige synovialleddet å tilby en effektiv plattform for modellering av leddsykdommer og utvikling av potensielle DMOADer.
Humane mesenkymale stamceller (MSC) kan isoleres fra mange vev i hele kroppen og differensieres i osteogene, kondrogene og adipogene linjer6. MSC har blitt brukt til å konstruere forskjellige vev, inkludert bein, brusk og fettvev6, noe som betyr at de representerer en lovende cellekilde for engineering av vevskomponentene i kneleddet. Vi har nylig utviklet et miniatyrleddlignende mikrofysiologisk system, kalt miniJoint, som består av MSC-avledet bein, brusk, fibrøst og fettvev7. Spesielt muliggjør den nye designen vevskrysstale ved mikrofluidisk strømning eller permeasjon (figur 1). Her presenterer vi protokollene for fremstilling av brikkekomponentene, konstruksjonen av vevskomponentene, kulturen til det konstruerte vevet i brikken og samlingen av vev for nedstrømsanalyser.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64186/64186fig01.jpg"> Figur 1: Skjematisk fremstilling av miniJoin-brikken som viser arrangementet av de forskjellige vevskomponentene og mediumstrømmene. OC = osteokondralt vev. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64186/64186fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>I17018-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well non-tissue culture plate</td>
			<td>Corning Falcon&#174; Plates</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well non-tissue culture plate</td>
			<td>Corning Falcon&#174; Plates</td>
			<td>351147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringes</td>
			<td>BD Syringe Luer Lock Cascade Health</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue stain</td>
			<td>EK Industries</td>
			<td>1198</td>
			<td>1% w/v, pH 1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12491-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>12-460-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY&#174; fluorophore</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone morphogenic protein 7 (BMP7)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>16100110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexmethasome</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>02-05-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Shell 450 photopolymer in</td>
			<td>EnvisionTec</td>
			<td>RES-01-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini-Bio Products</td>
			<td>900-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>3505-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gelatin from bovine skin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>1003372809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>SH30588.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indomethacin</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>I7378-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>interleukin 1&#946;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leur-loc connectors</td>
			<td>Cole-Parmer Instruments</td>
			<td>45508-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>115388-93-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>1003129352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium bags</td>
			<td>KiYATEC</td>
			<td>FC045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic Anhydride</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>102378580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pointed forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>12000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon mold</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>RC00114P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon o-rings</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>ZMCCs1X5</td>
			<td>1mm x 5mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes SE, V&#233;lizy-Villacoublay, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blades</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Lagato210P, KD Scientific</td>
			<td>Z569631</td>
			<td>10 syringe racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-182 tissue culture flasks</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB012939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 150 mm</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB012925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor Beta (TGF-&#946;3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-36E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Flashlight</td>
			<td>KBS</td>
			<td>KB70109</td>
			<td>395 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vida Desktop 3D Printer</td>
			<td>EnvisionTec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>32222-06-3</td>
			<td>1,25-dihydroxyvitamin D3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creation of a knee joint-on-a-chip for modeling joint diseases and testing drugs

Den høye forekomsten av invalidiserende leddsykdommer som slitasjegikt (OA) utgjør en høy sosioøkonomisk belastning. For tiden er de tilgjengelige legemidlene som retter seg mot leddforstyrrelser for det meste palliative. Det udekkede behovet for effektive sykdomsmodifiserende OA-legemidler (DMOAD) har først og fremst vært forårsaket av fravær av egnede modeller for å studere sykdomsmekanismer og teste potensielle DMOADer. Her beskriver vi etableringen av et miniatyr synovialt leddlignende mikrofysiologisk system (miniJoint) som består av fett-, fibrøse og osteokondrale vevskomponenter avledet fra humane mesenkymale stamceller (MSC). For å oppnå de tredimensjonale (3D) mikrovevene ble MSC innkapslet i fotokryssbindbar metakryrylert gelatin før eller etter differensiering. De cellebelastede vevskonstruksjonene ble deretter integrert i en 3D-printet bioreaktor, som danner miniJoint. Separate strømmer av osteogene, fibrogene og adipogene medier ble introdusert for å opprettholde de respektive vevsfenotypene. En vanlig delt strøm ble perfusert gjennom brusk, synovial og fettvev for å muliggjøre vevskrysstale. Dette strømningsmønsteret tillater induksjon av forstyrrelser i en eller flere av vevskomponentene for mekanistiske studier. Videre kan potensielle DMOADer testes via enten "systemisk administrasjon" gjennom alle mediumstrømmene eller "intraartikulær administrasjon" ved å legge legemidlene til bare den delte "synovialvæsken" -simulerende strømning. Dermed kan miniJoint fungere som en allsidig in vitro-plattform for effektiv studier av sykdomsmekanismer og testing av legemidler i persontilpasset medisin.

Alle vevene i miniJoint ble samlet for å analysere fenotypene etter 28 dager med dyrkning i miniJoint (figur 4A). Dette er beskrevet i vår tidligere publikasjon7.
Ved bruk av RT-qPCR, immunfarging og histologisk farging ble det bekreftet at de vevsspesifikke fenotypene var godt vedlikeholdt for de enkelte mikrovevene (figur 4). For eksempel uttrykte den øseøse komponenten av OC-mikrovevene (OC-O), men ikke ...

Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs at JoVE.com

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

Vi tilbyr detaljerte metoder for å generere fire typer vev fra humane mesenkymale stamceller, som brukes til å rekapitulere brusk, bein, fettpute og synovium i det menneskelige kneleddet. Disse fire vevene er integrert i en tilpasset bioreaktor og koblet sammen gjennom mikrofluidikk, og genererer dermed et kneledd på en brikke.

Opprettelse av et kneledd på en brikke for modellering av leddsykdommer og testing av medisiner

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...

Vår evne til nøyaktig å forutsi hvordan mennesker reagerer på legemidler under kliniske studier er begrenset på grunn av mangel på fysiologisk relevante prekliniske modeller. Dette mikrofysiologiske systemet kan adressere denne ulikheten. Dette humane celleavledede systemet etterligner nøyaktig hele leddsykdomskarakteren av slitasjegikt i det menneskelige kneet, noe som gjør det mulig å teste sykdomsmodifiserende slitasjegiktmedisiner før kliniske studier, og potensielt spare millioner av dollar.Begynn å forberede metakrylert gelatin, eller GelMA, ved å tilsette 17 gram gelatin type B til 500 ml destillert vann. Bland det i 30 minutter på en shaker ved 37 grader Celsius og tilsett 13 ml metakrylanhydrid før du blander over natten på en shaker. På neste dag, lag rundt 60 ml aliquots av GelMA i dialyseposer.Legg alle dialyseposene i destillert vann med en rørestang i syv dager. Bytt vann flere ganger per dag og la posene stå på fire grader Celsius over natten. På dag syv, hell GelMA i en tallerken og frys den ved minus 80 grader Celsius før lyofiliseringen.Deretter lyofiliserer GelMA ved å plassere den i vakuumkammeret til en lyofilisator. Sørg for fullstendig tørking før fjerning fra lyofilisatoren. Oppløs deretter lyofilisert GelMA i Hanks balansert saltløsning ved 15% konsentrasjon og juster pH til 7,4 ved bruk av en liten mengde natriumhydroksyd.Basert på det oppkjøpte volumet, suppler løsningen med antibiotika antimykotisk og 0,15% litiumfenylfosfat eller LAP. Beskytt GelMA-løsningen mot lys og oppbevar den ved minus 20 grader Celsius til videre bruk. Autoklav 3D-printede bioreaktorkamre, lokk og innsatser i autoklavposer ved 121 grader Celsius i 20 minutter med damp.Og så, i 20 minutter med tørr varme. Etter sterilisering, suge bioreaktorkamrene, lokkene og innsatsene i 15 ml steril PBS over natten inne i biosikkerhetsskapet, etterfulgt av fullstendig tørking. Bruk en 1000 mikroliter pipette, resuspender 20 ganger 10 til den sjette humane benmargsavledede mesenkymale stamceller, eller MSC, per milliliter celler i en 15% GelMA-løsning.Trykk deretter en steril, tørr silikonform mot en petriskål ved hjelp av sterile hansker. Sett en innsats i hvert hull i silikonformen med tang med hullsiden av innsatsen vendt ned. Når du er ferdig, tilsett rundt 50 mikroliter av celleopphenget per innsats ved hjelp av en 200 mikroliter pipette.Kryssbind gelen inne i innsatsen ved å utsette toppen for en 395 nanometer bølgelengde UV-lommelykt i 1,5 minutter, og deretter belyse den andre siden i 30 sekunder. Med steril tang, overfør straks innsatsene til åtte milliliter vekstmedium i en ikke-vevskultur seks brønnplate og la cellene komme seg over natten. For å starte differensiering av fettvev, overfør innsatsene til åtte milliliter adipogent medium og dyrk dem i 28 dager med daglig mediumendring.For å konstruere osteokondrale enheter, plasser innsatsene i bioreaktorkamre med dobbel strømning, kapp brønnene og fyll de to strømmene separat med en strømningshastighet på fem mikroliter per minutt med 35 ml osteogent medium og 35 ml kondrogent medium. Vedlikehold celler for differensiering i 28 dager ved å utføre sprøyteskift annenhver uke med de respektive mediumtypene. For å utlede fibroblastene, skille MSCene i 2D-kultur i en T-150 kvadratcentimeter vevscellekulturkolbe som inneholder 20 ml fibrogent medium i 21 dager.Oppretthold den ukentlige endringen av mediet. Etter 21 dager, bruk fire milliliter trypsin for å løsne cellene. Kapsle inn 3D-gelene i innsatsene.For å oppnå synovial-lignende fibrøst vev, eller SFT, følg en lignende protokoll. Koble silikonrøret, med en 0,062 tommers indre diameter og en 0,125 tommers ytre diameter, til minijoint bioreaktorstangen i den ene enden og F 1/16th lokkelåskontakter i den andre enden. Deretter autoklaver du 3D-minijoint bioreaktorene sammen med silikonslangen og lokkene.Forbered og last 35 milliliter medium som skal brukes til minijoint kulturen i de mellomstore reservoarene. Bruk rett tang for å overføre osteokondrale enheter fra dual flow bioreaktoren til høyre brønn i minijoint bioreaktoren. Overfør fettvevsinnsatsen og fibrøst vevinnlegg i henholdsvis venstre og midtre brønner, før du dekker alle brønnene med steriliserte deksler.Koble minijoint klipsinntakene til mediumreservoarene og uttakene til sprøyter. Monter deretter sprøytene på en sprøytepumpe. Overfør pumpen og flis til en inkubator.Plasser de mellomstore reservoarene på is utenfor inkubatoren. Bruk pumpen i uttaksmodus, og trekk mediet fra mediumreservoaret inn i minijoint bioreaktorkammeret. Fortsett denne minifelles kulturprosessen i 28 dager.For å modellere leddbetennelsen og bruskdegenerasjonen, legg til interleukin en beta til den fibrogene mediumstammen ved 10 nanogram per milliliter i syv dager. Sørg for å sette sprøyten på den tredje dagen før du gir frisk interleukin en beta til det fibrogene mediet. For narkotikatesting, etter tre dager med interleukin en beta-behandling, administrer legemidlet enten i det delte medium, simulerer en intraartikulær administrering, eller i alle mediumtyper, simulerer en systemisk administrasjon.Etter syv dager med interleukin en beta-behandling, samle individuelle vev for analysen. Etter å ha fjernet innsatsene ved hjelp av steril tang, skyv en biopsi-stans gjennom midten av innsatsen for å fjerne gelen og legg gelen i PBS. Deretter kutter du osteokondrale geler i halvparten mens du vurderer genuttrykket.Samle og sentrifuge rundt 1, 5 milliliter media fra hver mediumkilde ved 14.000 G i 10 minutter. Etter å ha kastet sedimentet, fryser blitsen det kondisjonerte mediet i flytende nitrogen. For histologisk farging og immunfarging, fikser du først osteokondralt og synoviallignende fibrøst vev, eller SFT-prøver, i 10% bufret formalin og dehydrerer dem i etanol med stigende konsentrasjoner.Fjern prøven i xylen, legg dem inn i parafin, og til slutt seksjoner prøvene i seks mikrometer tykkelse. Når det gjelder fettvev, flekker de 10% bufrede formelle og faste prøvene direkte, med oljerød O-løsning eller BODIPY. De vevsspesifikke fenotypene ble godt vedlikeholdt for de enkelte mikrovevene.Alle vevene i minijoint ble samlet for å analysere deres fenotyper etter 28 dager med kultur. Den osseøse komponenten av osteokondrale enheters mikrovev uttrykte høye nivåer av osteocalcin. I bruskdelen av osteokondralen uttrykte vev signifikant høye nivåer av kollagen type to og aggrekansk.Ekspresjonsnivåene av representative adipogene gener, adiponektin og leptin var høyere i fettvevet. Avsetning av kalsiummineraler, alkalisk fosfatase og osteocalcinprotein ble primært sett i benstørrelsen til osteokondrale mikrovev. Brusksiden av osteokondrale vev viste godt beholdt glykosaminoglykan og kollagen type to.Ekspresjonen av kondrocytthypertrofiassosierte markører, kollagen type 10 og indisk pinnsvin, ble signifikant nedregulert etter 28 dager med kultur. Det ble funnet rikelig lipiddråpeavleiring i fettvevet. Den immunfluorescerende fargingen viste robust smøre- og cadherin 11-uttrykk fra SFT etter fire ukers dyrkning.I en sykdomsmodell resulterte IL en betabehandling i celleapoptose og forhøyede MMP-13-nivåer i SFT. Brusknedbrytningen ble behandlet med IL en beta, noe som tyder på forekomst av crosstalk mellom osteokondralt vev og SFT. Den terapeutiske effekten av naproksen ved systemisk administrasjon viste redusert nedbrytning av brusk i IL ett beta-miniledd.Sanntids-PCR indikerte at de fire potensielle sykdomsmodifiserende slitasjegiktmedisinene delvis reverserte brusktapet. De viktigste trinnene i denne prosedyren inkluderer kryssbinding av gelene i innsatsene og innsatsplassering i bioreaktoren. Brikken tillater undersøkelse av bidraget fra andre risikofaktorer som tilbys i slitasjegikt, som fedme og mekanisk skade.Det kan også brukes til å studere andre felles sykdommer.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

Miljøriktig kontrollert Microtensile Testing av Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for<em&gt; Ex vivo</em&gt; Karakterisering

Implantable microdevices are gaining significant attention for several biomedical applications1-4. Such devices have been made from a range of materials, ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

Pasient-spesifikke Modeling of the Heart: Beregning av Ventrikulære Fiber Orientations

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Fastsettelse av Transport Valuta xenobiotics og nanomaterialer over placenta ved hjelp<em&gt; Ex vivo</em&gt; Menneskelig placentaperfusjon Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

Stressindusert antibiotika følsomhetstesting på en brikke

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

Establishment of a Surgically-induced Model in Mice to Investigate the Protective Role of Progranulin in Osteoarthritis

Etablering av et kirurgisk indusert Model i mus for å undersøke den beskyttende rollen Progranulin i Artrose

Destabilization of medial meniscus (DMM) model is an important tool for studying the pathophysiological roles of numerous arthritis associated molecules ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Mikrofluidisk fabrikasjon av polymere og biohybridfibre med forhåndsdesignet størrelse og form

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Oscillation and Reaction Board Techniques for Estimating Inertial Properties of a Below-knee Prosthesis

Vibrasjons-og Reaction Board teknikker for å estimere treghet Egenskaper til en Under-kne protese

The purpose of this study was two-fold: 1) demonstrate a technique that can be used to directly estimate the inertial properties of a below-knee ...

Creation of Patient-Specific Silicone Cardiac Models with Applications in Pre-surgical Plans and Hands-on Training

Opprettelse av pasientspesifikke silikon hjertemodeller med applikasjoner i pre-kirurgiske planer og praktisk opplæring

Three dimensional&#160;models can be a valuable tool for surgeons as they develop surgical plans and medical fellows as they learn about complex cases. In ...