Name: creation of a knee joint-on-a-chip for modeling joint diseases and testing drugs
Uploaded: 2023-01-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs at JoVE.com

Это исследование было в основном поддержано финансированием Национальных институтов здравоохранения (UG3 / UH3TR002136, UG3 / UH3TR003090). Кроме того, мы благодарим доктора Пола Маннера (Вашингтонский университет) за предоставление образцов тканей человека и доктора Цзянь Тана за помощь в изоляции МСК и создании пула клеток.

Следующий протокол следует этическим принципам Университета Питтсбурга и комитета по этике исследований на людях Университета Питтсбурга. Информация о материалах, использованных в данном исследовании, приведена в Таблице материалов.
1. Производство биореа...

<ol>
	<li>Safiri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional+and+national+burden+of+osteoarthritis+1990-2017:+A+systematic+analysis+of+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).</li><li>Lawrence, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+the+prevalence+of+arthritis+and+other+rheumatic+conditions+in+the+United+States:+Part+II.">Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States: Part II.</a> Arthritis and Rheumatism. 58 (1), 26-35 (2008).</li><li>Makarczyk, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+models+for+development+of+disease-modifying+osteoarthritis+drugs.">Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 27 (2), 124-138 (2021).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+osteoarthritis:+risk+factors,+regulatory+pathways+in+chondrocytes,+and+experimental+models.">Pathogenesis of osteoarthritis: risk factors, regulatory pathways in chondrocytes, and experimental models.</a> Biology. 9 (8), 194 (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+A+fast+track+for+engineered+human+tissues+in+drug+development.">Organs-on-a-chip: A fast track for engineered human tissues in drug development.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).</li><li>Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells:+aging+and+tissue+engineering+applications+to+enhance+bone+healing.">Bone marrow mesenchymal stem cells: aging and tissue engineering applications to enhance bone healing.</a> Biomaterials. 203, 96-110 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cell-derived+miniature+joint+system+for+disease+modeling+and+drug+testing.">Human mesenchymal stem cell-derived miniature joint system for disease modeling and drug testing.</a> Advanced Science. 9 (21), 2105909 (2022).</li><li>Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+tissue+engineering+application+of+injectable+gelatin+hydrogel+with+in+situ+visible-light-activated+gelation+capability+in+both+air+and+aqueous+solution.">Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution.</a> Tissue Engineering. Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).</li><li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate:+polymerization+rate+and+cytocompatibility.">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).</li><li>Lin, H., Lozito, T. P., Alexander, P. G., Gottardi, R., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+microphysiological+osteochondral+system+to+model+tissue+response+to+interleukin-1&#946;.">Stem cell-based microphysiological osteochondral system to model tissue response to interleukin-1&#946;.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2203-2212 (2014).</li><li>Yin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+macro-porous+titanium+ornamented+by+degradable+3D+gel/nHA+micro-scaffolds+for+bone+tissue+regeneration.">Hybrid macro-porous titanium ornamented by degradable 3D gel/nHA micro-scaffolds for bone tissue regeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 575 (2016).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteochondral+tissue+chip+derived+from+iPSCs:+Modeling+OA+pathologies+and+testing+drugs.">Osteochondral tissue chip derived from iPSCs: Modeling OA pathologies and testing drugs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 411 (2019).</li><li>Atukorala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovitis+in+knee+osteoarthritis:+A+precursor+of+disease.">Synovitis in knee osteoarthritis: A precursor of disease.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (2), 390-395 (2016).</li><li>Occhetta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperphysiological+compression+of+articular+cartilage+induces+an+osteoarthritic+phenotype+in+a+cartilage-on-a-chip+model.">Hyperphysiological compression of articular cartilage induces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 545-557 (2019).</li><li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+changes+associated+with+cartilage+trauma+using+human-cell-laden+hydrogel+cartilage+models.">Modeling early changes associated with cartilage trauma using human-cell-laden hydrogel cartilage models.</a> Stem Cell Research and Therapy. 13 (1), 400 (2022).</li><li>Elsissy, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+septic+arthritis+of+the+adult+native+knee+joint:+A+review.">Bacterial septic arthritis of the adult native knee joint: A review.</a> JBJS Reviews. 8 (1), 0059 (2020).</li><li>Romero-Lopez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+effects+on+mesenchymal+stem+cell+osteogenesis+in+a+three-dimensional+in+vitro+bone+model.">Macrophage effects on mesenchymal stem cell osteogenesis in a three-dimensional in vitro bone model.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (19-20), 1099-1111 (2020).</li></ol>

В этой статье мы представляем протокол создания системы коленного сустава на чипе, в которой кости, хрящи, жировая ткань и синовиально-подобные ткани формируются из МСК и совместно культивируются в индивидуальном биореакторе. Эта многокомпонентная система на основе клеток человека с ?...

Заболевания суставов, такие как остеоартрит (ОА), широко распространены и изнурительны и представляют собой ведущую причину инвалидности во всем мире1. По оценкам, только в США ОА поражает 27 миллионов пациентов и встречается у 12,1% взрослых в возрасте 60 лет и старше2 лет. К сожалению, большинство препаратов, используемых в настоящее время для лечения заболеваний суставов, являются паллиативными, и нет эффективных препаратов, модифицирующих болезнь ОА (DMOAD)3. Эта неудовлетворенная медицинская потребность в первую очередь связана с отсутствием эффективной модели для изучения механизмов заболевания и разработки потенциальных DMOAD. Традиционная двумерная (2D) культура клеток не отражает 3D-природу тканей суставов, а культивированию тканевых эксплантатов часто препятствует значительная гибель клеток и обычно не удается воспроизвести динамические тканевые взаимосвязи4. Кроме того, генетические и анатомические различия значительно снижают физиологическую значимость животных моделей4.
Органы-на-чипах (OoC), или микрофизиологические системы, являются перспективной областью исследований на стыке инженерии, биологии и медицины. Эти платформы in vitro представляют собой минимальные функциональные единицы, которые воспроизводят определенные здоровые или патологические особенности их аналогов in vivo 5. Кроме того, эти миниатюрные системы могут содержать различные клетки и матрицы и имитировать биофизические и биохимические взаимодействия между различными тканями. Таким образом, микрофизиологическая система, которая может точно повторять нативный синовиальный сустав, обещает предложить эффективную платформу для моделирования заболеваний суставов и разработки потенциальных DMOAD.
Мезенхимальные стволовые клетки человека (МСК) могут быть выделены из многих тканей по всему телу и дифференцированы на остеогенные, хондрогенные и адипогенные линии6. МСК успешно используются для создания различных тканей, включая костную, хрящевую и жировую ткань6, что означает, что они представляют собой многообещающий источник клеток для инженерии тканевых компонентов коленного сустава. Недавно мы разработали миниатюрную микрофизиологическую систему, имитирующую суставы, под названием miniJoint, которая включает в себя костную, хрящевую, фиброзную и жировую ткани, полученные из МСК7. В частности, новая конструкция обеспечивает перекрестные помехи тканей за счет микрофлюидного потока или проникновения (рис. 1). Здесь мы представляем протоколы изготовления компонентов чипа, проектирования компонентов ткани, культивирования инженерных тканей в чипе и сбора тканей для последующего анализа.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64186/64186fig01.jpg"> Рисунок 1: Схема чипа miniJoint, показывающая расположение различных компонентов ткани и потоков среды. ОК = остеохондральная ткань. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64186/64186fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>I17018-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well non-tissue culture plate</td>
			<td>Corning Falcon&#174; Plates</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well non-tissue culture plate</td>
			<td>Corning Falcon&#174; Plates</td>
			<td>351147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringes</td>
			<td>BD Syringe Luer Lock Cascade Health</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue stain</td>
			<td>EK Industries</td>
			<td>1198</td>
			<td>1% w/v, pH 1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12491-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>12-460-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY&#174; fluorophore</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone morphogenic protein 7 (BMP7)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>16100110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexmethasome</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>02-05-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Shell 450 photopolymer in</td>
			<td>EnvisionTec</td>
			<td>RES-01-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini-Bio Products</td>
			<td>900-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>3505-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gelatin from bovine skin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>1003372809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>SH30588.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indomethacin</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>I7378-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>interleukin 1&#946;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leur-loc connectors</td>
			<td>Cole-Parmer Instruments</td>
			<td>45508-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>115388-93-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>1003129352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium bags</td>
			<td>KiYATEC</td>
			<td>FC045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic Anhydride</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>102378580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pointed forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>12000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon mold</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>RC00114P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon o-rings</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>ZMCCs1X5</td>
			<td>1mm x 5mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes SE, V&#233;lizy-Villacoublay, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blades</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Lagato210P, KD Scientific</td>
			<td>Z569631</td>
			<td>10 syringe racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-182 tissue culture flasks</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB012939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 150 mm</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB012925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor Beta (TGF-&#946;3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-36E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Flashlight</td>
			<td>KBS</td>
			<td>KB70109</td>
			<td>395 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vida Desktop 3D Printer</td>
			<td>EnvisionTec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>32222-06-3</td>
			<td>1,25-dihydroxyvitamin D3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creation of a knee joint-on-a-chip for modeling joint diseases and testing drugs

Высокая распространенность изнурительных заболеваний суставов, таких как остеоартрит (ОА), представляет собой высокое социально-экономическое бремя. В настоящее время доступные препараты, нацеленные на заболевания суставов, в основном паллиативны. Неудовлетворенная потребность в эффективных препаратах ОА, модифицирующих болезнь (ДМОАД), была вызвана главным образом отсутствием соответствующих моделей для изучения механизмов заболевания и тестирования потенциальных ДМОАД. Здесь описано создание миниатюрной микрофизиологической системы, имитирующей синовиальный сустав (miniJoint), включающей компоненты жировой, фиброзной и остеохондральной ткани, полученные из мезенхимальных стволовых клеток (МСК) человека. Для получения трехмерных (3D) микротканей МСК инкапсулировали в фотосшиваемый метакрилированный желатин до или после дифференцировки. Затем тканевые конструкции, нагруженные клетками, были интегрированы в биореактор, напечатанный на 3D-принтере, образуя мини-соединение. Были введены отдельные потоки остеогенной, фиброгенной и адипогенной сред для поддержания соответствующих тканевых фенотипов. Общий поток перфузировался через хрящевую, синовиальную и жировую ткани, чтобы обеспечить перекрестные помехи тканей. Эта картина потока позволяет индукция возмущений в одном или нескольких тканевых компонентах для механистических исследований. Кроме того, потенциальные ДМОАД могут быть протестированы либо путем «системного введения» через все потоки среды, либо путем «внутрисуставного введения» путем добавления лекарств только к общему потоку, имитирующему «синовиальную жидкость». Таким образом, miniJoint может служить универсальной платформой in vitro для эффективного изучения механизмов заболевания и тестирования лекарств в персонализированной медицине.

Все ткани мини-сустава были собраны для анализа их фенотипов после 28 дней культивирования в мини-суставе (рис. 4А). Это было подробно описано в нашей предыдущей публикации7.
С помощью ОТ-кПЦР, иммуноокрашивания и гистологического окрашивания б?...

Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs at JoVE.com

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

Мы предлагаем подробные методы создания четырех типов тканей из мезенхимальных стволовых клеток человека, которые используются для рекапитуляции хряща, кости, жирового пакета и синовиальной оболочки коленного сустава человека. Эти четыре ткани интегрированы в индивидуальный биореактор и соединены с помощью микрофлюидики, создавая таким образом коленный сустав на чипе.

Создание коленного сустава-на-чипе для моделирования заболеваний суставов и тестирования лекарств

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...

Наша способность точно предсказывать, как люди реагируют на лекарства во время клинических испытаний, ограничена из-за отсутствия физиологически значимых доклинических моделей. Эта микрофизиологическая система может устранить это несоответствие. Эта система, полученная из клеток человека, точно имитирует всю природу остеоартрита в колене человека, что позволяет тестировать лекарства от остеоартрита, модифицирующие заболевание, до клинических испытаний, что потенциально экономит миллионы долларов.Начните приготовление метакрилированного желатина, или GelMA, добавив 17 граммов желатина типа B в 500 миллилитров дистиллированной воды. Перемешивайте его в течение 30 минут на шейкере при температуре 37 градусов Цельсия и добавьте 13 миллилитров метакрилового ангидрида, прежде чем на ночь перемешивать на шейкере. На следующий день приготовьте около 60 миллилитров аликвот GelMA в диализные мешки.Поместите все пакеты для диализа в дистиллированную воду с мешалкой на семь дней. Меняйте воду несколько раз в день и оставляйте пакеты при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. На седьмой день налейте ГельМА в посуду и заморозьте его при минус 80 градусах Цельсия перед лиофилизацией.Затем лиофилизируйте GelMA, поместив его в вакуумную камеру лиофилизатора. Перед извлечением из лиофилизатора обеспечьте полное высыхание. Затем растворите лиофилизированный GelMA в сбалансированном солевом растворе Хэнкса с концентрацией 15% и отрегулируйте рН до 7,4, используя небольшое количество гидроксида натрия.В зависимости от приобретенного объема дополните раствор антибиотиком-антимикотическим препаратом и 0,15%-ным фенилфосфинатом лития, или LAP. Защищайте раствор GelMA от света и храните его при температуре минус 20 градусов Цельсия до дальнейшего использования. Двухпоточные биореакторные камеры, крышки и вкладыши с автоклавной печатью на 3D-принтере в автоклавных мешках при температуре 121 градус Цельсия в течение 20 минут с паром.А затем, в течение 20 минут с сухим теплом. После стерилизации замочите камеры, крышки и вкладыши биореактора в 15 миллилитрах стерильного PBS на ночь внутри шкафа биобезопасности с последующей полной сушкой. Используя пипетку объемом 1000 микролитров, ресуспендируйте 20 раз по 10 до шестого количества мезенхимальных стволовых клеток, полученных из костного мозга человека, или МСК, на миллилитр клеток в 15% растворе GelMA.Затем прижмите стерильную сухую силиконовую форму к чашке Петри, используя стерильные перчатки. Вставьте по одной вставке в каждое отверстие силиконовой формы щипцами стороной отверстия вкладыша вниз. После этого добавьте около 50 микролитров клеточной суспензии на вставку с помощью пипетки объемом 200 микролитров.Сшите гель внутри вставки, подвергнув верхнюю часть воздействию ультрафиолетового фонарика с длиной волны 395 нанометров в течение 1,5 минут, а затем осветив другую сторону в течение 30 секунд. С помощью стерильных щипцов немедленно перенесите вкладыши в восемь миллилитров питательной среды в шестилуночную пластину для нетканевой культуры и дайте клеткам восстановиться в течение ночи. Чтобы инициировать дифференцировку жировой ткани, перенесите вкладыши на восемь миллилитров адипогенной среды и культивируйте их в течение 28 дней с ежедневной сменой среды.Чтобы спроектировать остеохондральные установки, поместите вставки в двухпоточные камеры биореактора, закройте лунки и вливайте два потока отдельно со скоростью пять микролитров в минуту с 35 миллилитрами остеогенной среды и 35 миллилитрами хондрогенной среды. Поддерживайте клетки для дифференцировки в течение 28 дней, выполняя двухнедельную смену шприца с соответствующими типами сред. Чтобы получить фибробласты, дифференцируйте МСК в 2D-культуре в колбе для культуры тканевых клеток площадью 150 квадратных сантиметров, содержащей 20 миллилитров фиброгенной среды в течение 21 дня.Поддерживайте еженедельную смену среды. Через 21 день используйте четыре миллилитра трипсина, чтобы отделить клетки. Инкапсулируйте 3D-гели во вкладыши.Чтобы получить синовиально-подобную фиброзную ткань, или SFT, следуйте аналогичному протоколу. Подсоедините силиконовую трубку с внутренним диаметром 0.062 дюйма и внешним диаметром 0.125 дюйма к стержню биореактора minijoint на одном конце и разъемам замка приманки F 1/16 на другом конце. Затем автоклавируйте 3D-мини-биореакторы вместе с силиконовыми трубками и крышками.Подготовьте и загрузите 35 миллилитров среды, которая будет использоваться для мини-совместной культуры, в резервуары для среды. Используйте прямые щипцы для переноса остеохондральных блоков из двухпоточного биореактора в правую лунку мини-совместного биореактора. Перенесите вставку жировой ткани и вставку из фиброзной ткани в левую и среднюю лунки соответственно, прежде чем накрыть все лунки стерилизованными крышками.Подсоедините входные отверстия мини-зажима к резервуарам для среды, а выпускные отверстия — к шприцам. Затем установите шприцы на шприцевой насос. Перенесите насос и чипсы в инкубатор.Поместите средние резервуары на лед за пределами инкубатора. Работайте насосом в режиме отбора, втягивая среду из резервуара среды в камеру биореактора minijoint. Продолжайте этот процесс культивирования в течение 28 дней.Чтобы смоделировать воспаление суставов и дегенерацию хряща, добавьте интерлейкин один бета к штамму фиброгенной среды в концентрации 10 нанограммов на миллилитр в течение семи дней. Обязательно замените шприц на третий день, прежде чем вводить свежий интерлейкин один бета в фиброгенную среду. Для тестирования лекарственного средства после трех дней лечения интерлейкином один бета вводите препарат либо в общую среду, имитируя внутрисуставное введение, либо во всех типах сред, имитируя системное введение.После семи дней лечения интерлейкином один бета соберите отдельные ткани для анализа. После удаления вкладышей с помощью стерильных щипцов протолкните перфоратор для биопсии через центр вкладыша, чтобы удалить гель и поместить гель в PBS. Затем разрежьте остеохондральные гели пополам, оценивая экспрессию генов.Соберите и центрифугируйте около 1,5 миллилитров среды из каждого источника среды при 14 000 г в течение 10 минут. После удаления осадка подвергните кондиционированную среду мгновенной заморозкой в жидком азоте. Для гистологического окрашивания и иммуноокрашивания сначала фиксируют остеохондральную и синовиально-подобную фиброзную ткань, или образцы SFT, в 10%-ном буферном формалине и обезвоживают их в этаноле возрастающих концентраций.Очистите образец в ксилоле, поместите его в парафин и, наконец, разделите образцы на шесть микрометров толщиной. В случае жировой ткани окрашивайте формальные и фиксированные образцы с 10%-ной буферизацией непосредственно масляным красным раствором O или BODIPY. Тканеспецифические фенотипы хорошо поддерживались для отдельных микротканей.Все ткани мини-сустава были собраны для анализа их фенотипов после 28 дней культивирования. Костный компонент микротканей костно-хрящевых звеньев экспрессировал высокий уровень остеокальцина. В хрящевой части остеохондрального отдела ткани экспрессируют значительно высокие уровни коллагена второго типа и аггрекана.Уровни экспрессии репрезентативных адипогенных генов, адипонектина и лептина были выше в жировой ткани. Отложение минералов кальция, щелочной фосфатазы и белка остеокальцина в основном наблюдалось в костном размере остеохондральных микротканей. Хрящевая сторона костно-хрящевых тканей показала хорошо удерживаемые гликозаминогликаны и коллаген второго типа.Экспрессия маркеров, связанных с гипертрофией хондроцитов, коллагена типа 10 и индийского ежа, была значительно снижена после 28 дней культивирования. В жировой ткани обнаружено обильное отложение липидных капель. Иммунофлуоресцентное окрашивание показало надежную экспрессию смазки и кадгерина 11 SFT после четырех недель культивирования.В модели заболевания лечение IL one beta приводило к апоптозу клеток и повышению уровня MMP-13 в SFT. Деградация хряща лечилась IL one beta, что свидетельствует о возникновении перекрестных помех между костно-хрящевой тканью и SFT. Терапевтическая эффективность напроксена при системном введении показала снижение деградации хряща в одном бета-минисуставе IL.ПЦР в реальном времени показала, что четыре потенциальных препарата для лечения остеоартрита, модифицирующих болезнь, частично обратили вспять потерю хряща. Наиболее важными этапами этой процедуры являются сшивание гелей во вставках и размещение вставки в биореакторе. Чип позволяет исследовать вклад других факторов риска, предлагаемых при остеоартрите, таких как ожирение и механические травмы.Он также может быть использован для изучения других заболеваний суставов.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Плазменные литографии поверхности паттернов для создания сотовых сетей

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Endothelialized Microfluidics для изучения взаимодействий в микрососудистой гематологические заболевания

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

Экологически-контролируемое Microtensile Тестирование Механически адаптивных полимерных нанокомпозитов для<em&gt; Экс естественных условиях</em&gt; Характеристика

Implantable microdevices are gaining significant attention for several biomedical applications1-4. Such devices have been made from a range of materials, ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

Пациент конкретного моделирования сердца: оценка ориентации волокон Желудочковая

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Определение транспортных Оценить ксенобиотиков и наноматериалы через плаценту помощью<em&gt; Экс естественных условиях</em&gt; Плацентарной перфузии модели

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

Стресс-индуцированной антибиотиков Восприимчивость Тестирование на чип

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

Establishment of a Surgically-induced Model in Mice to Investigate the Protective Role of Progranulin in Osteoarthritis

Создание вызванной хирургически, модели у мышей по расследованию защитную роль Progranulin в остеоартрита

Destabilization of medial meniscus (DMM) model is an important tool for studying the pathophysiological roles of numerous arthritis associated molecules ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Микрофлюидное изготовление полимерных и биогибридных волокон с заранее разработанным размером и формой

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Oscillation and Reaction Board Techniques for Estimating Inertial Properties of a Below-knee Prosthesis

Осцилляционные и реакция Совета методов оценки инерционных свойств в Ниже колена протезирования

The purpose of this study was two-fold: 1) demonstrate a technique that can be used to directly estimate the inertial properties of a below-knee ...

Creation of Patient-Specific Silicone Cardiac Models with Applications in Pre-surgical Plans and Hands-on Training

Создание специфических для пациента силиконовых моделей сердца с применением в предоперационных планах и практическом обучении

Three dimensional&#160;models can be a valuable tool for surgeons as they develop surgical plans and medical fellows as they learn about complex cases. In ...