Name: creation of a knee joint-on-a-chip for modeling joint diseases and testing drugs
Uploaded: 2023-01-27T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs at JoVE.com

Bu araştırma öncelikle Ulusal Sağlık Enstitüleri (UG3 / UH3TR002136, UG3 / UH3TR003090) tarafından finanse edilmiştir. Buna ek olarak, insan dokusu örneklerini sağladığı için Dr. Paul Manner'a (Washington Üniversitesi) ve MSC'leri izole etme ve hücre havuzu oluşturma konusundaki yardımları için Dr. Jian Tan'a teşekkür ederiz.

Aşağıdaki protokol, Pittsburgh Üniversitesi'nin ve Pittsburgh Üniversitesi'nin insan araştırmaları etik komitesinin etik kurallarını izlemektedir. Bu çalışmada kullanılan malzemelerle ilgili bilgiler Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. 3D baskılı biyoreaktörlerin üretimi
<ol><li>Odacıklar, ekler ve kapaklar içeren osteokondral (Şekil 2A) ve miniJoint biyoreaktörlerini (Şekil 2B</str...

<ol>
	<li>Safiri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional+and+national+burden+of+osteoarthritis+1990-2017:+A+systematic+analysis+of+the+Global+Burden+of+Disease+Study+2017.">Global, regional and national burden of osteoarthritis 1990-2017: A systematic analysis of the Global Burden of Disease Study 2017.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 79 (6), 819-828 (2020).</li><li>Lawrence, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+of+the+prevalence+of+arthritis+and+other+rheumatic+conditions+in+the+United+States:+Part+II.">Estimates of the prevalence of arthritis and other rheumatic conditions in the United States: Part II.</a> Arthritis and Rheumatism. 58 (1), 26-35 (2008).</li><li>Makarczyk, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+models+for+development+of+disease-modifying+osteoarthritis+drugs.">Current models for development of disease-modifying osteoarthritis drugs.</a> Tissue Engineering. Part C, Methods. 27 (2), 124-138 (2021).</li><li>He, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenesis+of+osteoarthritis:+risk+factors,+regulatory+pathways+in+chondrocytes,+and+experimental+models.">Pathogenesis of osteoarthritis: risk factors, regulatory pathways in chondrocytes, and experimental models.</a> Biology. 9 (8), 194 (2020).</li><li>Ronaldson-Bouchard, K., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organs-on-a-chip:+A+fast+track+for+engineered+human+tissues+in+drug+development.">Organs-on-a-chip: A fast track for engineered human tissues in drug development.</a> Cell Stem Cell. 22 (3), 310-324 (2018).</li><li>Lin, H., Sohn, J., Shen, H., Langhans, M. T., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+mesenchymal+stem+cells:+aging+and+tissue+engineering+applications+to+enhance+bone+healing.">Bone marrow mesenchymal stem cells: aging and tissue engineering applications to enhance bone healing.</a> Biomaterials. 203, 96-110 (2019).</li><li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+mesenchymal+stem+cell-derived+miniature+joint+system+for+disease+modeling+and+drug+testing.">Human mesenchymal stem cell-derived miniature joint system for disease modeling and drug testing.</a> Advanced Science. 9 (21), 2105909 (2022).</li><li>Lin, H., Cheng, A. W., Alexander, P. G., Beck, A. M., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cartilage+tissue+engineering+application+of+injectable+gelatin+hydrogel+with+in+situ+visible-light-activated+gelation+capability+in+both+air+and+aqueous+solution.">Cartilage tissue engineering application of injectable gelatin hydrogel with in situ visible-light-activated gelation capability in both air and aqueous solution.</a> Tissue Engineering. Part A. 20 (17-18), 2402-2411 (2014).</li><li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate:+polymerization+rate+and+cytocompatibility.">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 30 (35), 6702-6707 (2009).</li><li>Lin, H., Lozito, T. P., Alexander, P. G., Gottardi, R., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+microphysiological+osteochondral+system+to+model+tissue+response+to+interleukin-1&#946;.">Stem cell-based microphysiological osteochondral system to model tissue response to interleukin-1&#946;.</a> Molecular Pharmaceutics. 11 (7), 2203-2212 (2014).</li><li>Yin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+macro-porous+titanium+ornamented+by+degradable+3D+gel/nHA+micro-scaffolds+for+bone+tissue+regeneration.">Hybrid macro-porous titanium ornamented by degradable 3D gel/nHA micro-scaffolds for bone tissue regeneration.</a> International Journal of Molecular Sciences. 17 (4), 575 (2016).</li><li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osteochondral+tissue+chip+derived+from+iPSCs:+Modeling+OA+pathologies+and+testing+drugs.">Osteochondral tissue chip derived from iPSCs: Modeling OA pathologies and testing drugs.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 411 (2019).</li><li>Atukorala, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synovitis+in+knee+osteoarthritis:+A+precursor+of+disease.">Synovitis in knee osteoarthritis: A precursor of disease.</a> Annals of the Rheumatic Diseases. 75 (2), 390-395 (2016).</li><li>Occhetta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyperphysiological+compression+of+articular+cartilage+induces+an+osteoarthritic+phenotype+in+a+cartilage-on-a-chip+model.">Hyperphysiological compression of articular cartilage induces an osteoarthritic phenotype in a cartilage-on-a-chip model.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 545-557 (2019).</li><li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+early+changes+associated+with+cartilage+trauma+using+human-cell-laden+hydrogel+cartilage+models.">Modeling early changes associated with cartilage trauma using human-cell-laden hydrogel cartilage models.</a> Stem Cell Research and Therapy. 13 (1), 400 (2022).</li><li>Elsissy, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+septic+arthritis+of+the+adult+native+knee+joint:+A+review.">Bacterial septic arthritis of the adult native knee joint: A review.</a> JBJS Reviews. 8 (1), 0059 (2020).</li><li>Romero-Lopez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+effects+on+mesenchymal+stem+cell+osteogenesis+in+a+three-dimensional+in+vitro+bone+model.">Macrophage effects on mesenchymal stem cell osteogenesis in a three-dimensional in vitro bone model.</a> Tissue Engineering. Part A. 26 (19-20), 1099-1111 (2020).</li></ol>

Bu makalede, kemik, kıkırdak, yağ dokusu ve sinovyum benzeri dokuların MSC'lerden oluşturulduğu ve özelleştirilmiş bir biyoreaktör içinde birlikte kültürlendiği bir çip üzerinde diz eklemi sistemi oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Tak ve çalıştır özelliklerine sahip bu çok bileşenli, insan hücresinden türetilmiş sistem, eklem hastalıklarının patogenezini incelemek ve ilaç geliştirmek için yeni bir aracı temsil etmektedir. 
Farklı dokuların belirli kü...

Osteoartrit (OA) gibi eklem hastalıkları oldukça yaygın ve zayıflatıcıdır ve dünya çapında önde gelen bir sakatlık nedenini temsil etmektedir1. Sadece ABD'de OA'nın 27 milyon hastayı etkilediği ve 60 yaş ve üstü yetişkinlerin% 12.1'inde ortaya çıktığıtahmin edilmektedir. Ne yazık ki, şu anda eklem hastalıklarını yönetmek için kullanılan ilaçların çoğu palyatiftir ve etkili bir hastalık modifiye edici OA ilacı (DMOAD) mevcut değildir3. Bu karşılanmamış tıbbi ihtiyaç, öncelikle hastalık mekanizmalarını incelemek ve potansiyel DMOAD'leri geliştirmek için etkili bir modelin bulunmamasından kaynaklanmaktadır. Geleneksel iki boyutlu (2B) hücre kültürü, eklem dokularının 3B doğasını yansıtmaz ve doku eksplantlarının kültürü genellikle önemli hücre ölümü tarafından engellenir ve genellikle dinamik doku ara bağlantılarını çoğaltmada başarısız olur4. Ek olarak, genetik ve anatomik farklılıklar hayvan modellerinin fizyolojik alaka düzeyini önemli ölçüde azaltır4.
Çip üzerindeki organlar (OoC'ler) veya mikrofizyolojik sistemler, mühendislik, biyoloji ve tıp arayüzünde umut verici bir araştırma alanıdır. Bu in vitro platformlar, in vivo muadillerinin tanımlanmış sağlıklı veya patolojik özelliklerini kopyalayan minimal fonksiyonel birimlerdir5. Ayrıca, bu minyatür sistemler çeşitli hücrelere ve matrislere ev sahipliği yapabilir ve farklı dokular arasındaki biyofiziksel ve biyokimyasal etkileşimleri simüle edebilir. Bu nedenle, doğal sinovyal eklemi sadık bir şekilde özetleyebilen mikrofizyolojik bir sistem, eklem hastalıklarını modellemek ve potansiyel DMOAD'leri geliştirmek için etkili bir platform sunmayı vaat ediyor.
İnsan mezenkimal kök hücreleri (MSC'ler) vücuttaki birçok dokudan izole edilebilir ve osteojenik, kondrojenik ve adipojenik soylara ayrılabilir6. MSC'ler kemik, kıkırdak ve yağ dokusu6 dahil olmak üzere çeşitli dokuların mühendisliğini yapmak için başarıyla kullanılmıştır, bu nedenle diz ekleminin doku bileşenlerinin mühendisliği için umut verici bir hücre kaynağını temsil ettikleri anlamına gelir. Yakın zamanda, MSC kaynaklı kemik, kıkırdak, fibröz ve yağ dokularından oluşan miniJoint adlı minyatür eklem taklit eden mikrofizyolojik bir sistem geliştirdik7. Özellikle, yeni tasarım, mikroakışkan akış veya geçirgenlik yoluyla doku çapraz karışmasını sağlar (Şekil 1). Burada, çip bileşenlerinin imalatı, doku bileşenlerinin mühendisliği, çipteki mühendislik dokularının kültürü ve aşağı akış analizleri için dokuların toplanması için protokolleri sunuyoruz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64186/64186fig01.jpg"> Şekil 1: Farklı doku bileşenlerinin ve ortam akışlarının düzenini gösteren miniJoint çipinin şeması. OC = osteokondral doku. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64186/64186fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>3-isobutyl-1-methylxanthine</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>I17018-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well non-tissue culture plate</td>
			<td>Corning Falcon&#174; Plates</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well non-tissue culture plate</td>
			<td>Corning Falcon&#174; Plates</td>
			<td>351147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL syringes</td>
			<td>BD Syringe Luer Lock Cascade Health</td>
			<td>302832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian blue stain</td>
			<td>EK Industries</td>
			<td>1198</td>
			<td>1% w/v, pH 1.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12491-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#945;MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12571-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biopsy punch</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>12-460-407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BODIPY&#174; fluorophore</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone morphogenic protein 7 (BMP7)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>16100110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexmethasome</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>02-05-2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-Shell 450 photopolymer in</td>
			<td>EnvisionTec</td>
			<td>RES-01-4022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Gemini-Bio Products</td>
			<td>900-208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>3505-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gelatin from bovine skin</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>1003372809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>SH30588.02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indomethacin</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>I7378-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>interleukin 1&#946;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>200-01B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leur-loc connectors</td>
			<td>Cole-Parmer Instruments</td>
			<td>45508-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-proline</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>115388-93-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>1003129352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium bags</td>
			<td>KiYATEC</td>
			<td>FC045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylic Anhydride</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>102378580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered Saline</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pointed forceps</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>12000122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon mold</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>RC00114P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon o-rings</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>ZMCCs1X5</td>
			<td>1mm x 5mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SolidWorks</td>
			<td>Dassault Syst&#232;mes SE, V&#233;lizy-Villacoublay, France</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Blades</td>
			<td>Integra Miltex</td>
			<td>4-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Lagato210P, KD Scientific</td>
			<td>Z569631</td>
			<td>10 syringe racks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-182 tissue culture flasks</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB012939</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Dish 150 mm</td>
			<td>Fisher Brand</td>
			<td>FB012925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transforming Growth Factor Beta (TGF-&#946;3)</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>100-36E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Flashlight</td>
			<td>KBS</td>
			<td>KB70109</td>
			<td>395 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vida Desktop 3D Printer</td>
			<td>EnvisionTec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vitamin D3</td>
			<td>Sigma -Aldrich</td>
			<td>32222-06-3</td>
			<td>1,25-dihydroxyvitamin D3</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creation of a knee joint-on-a-chip for modeling joint diseases and testing drugs

Osteoartrit (OA) gibi zayıflatıcı eklem hastalıklarının yüksek prevalansı yüksek sosyoekonomik yük oluşturmaktadır. Günümüzde eklem bozukluklarını hedef alan mevcut ilaçlar çoğunlukla palyatiftir. Etkili hastalık modifiye edici OA ilaçlarına (DMOAD'ler) yönelik karşılanmamış ihtiyaç, öncelikle hastalık mekanizmalarını incelemek ve potansiyel DMOAD'leri test etmek için uygun modellerin bulunmamasından kaynaklanmaktadır. Burada, insan mezenkimal kök hücrelerinden (MSC'ler) türetilen adipoz, fibröz ve osteokondral doku bileşenlerinden oluşan minyatür bir sinovyal eklem taklit eden mikrofizyolojik sistemin (miniJoint) kurulmasını tarif ediyoruz. Üç boyutlu (3D) mikrodokuları elde etmek için, MSC'ler farklılaşmadan önce veya sonra fotoçapraz bağlanabilir metakrillenmiş jelatin içinde kapsüllendi. Hücre yüklü doku yapıları daha sonra miniJoint'i oluşturan 3D baskılı bir biyoreaktöre entegre edildi. İlgili doku fenotiplerini korumak için ayrı osteojenik, fibrojenik ve adipojenik ortam akışları tanıtıldı. Yaygın olarak paylaşılan bir akış, doku çapraz karışmasını sağlamak için kıkırdak, sinovyal ve yağ dokuları boyunca perfüze edildi. Bu akış paterni, mekanik çalışmalar için bir veya daha fazla doku bileşeninde pertürbasyonların indüksiyonuna izin verir. Ayrıca, potansiyel DMOAD'ler, tüm ortam akışları boyunca "sistemik uygulama" veya ilaçları yalnızca paylaşılan "sinovyal sıvı" simüle eden akışa ekleyerek "eklem içi uygulama" yoluyla test edilebilir. Böylece, miniJoint, hastalık mekanizmalarını verimli bir şekilde incelemek ve kişiselleştirilmiş tıpta ilaçları test etmek için çok yönlü bir in vitro platform olarak hizmet edebilir.

miniJoint'in tüm dokuları, miniJoint'te 28 günlük kültürü takiben fenotiplerini analiz etmek için toplandı (Şekil 4A). Bu, önceki yayınımız7'de detaylandırılmıştır.
RT-qPCR, immün boyama ve histolojik boyama kullanılarak, dokuya özgü fenotiplerin bireysel mikrodokular için iyi korunduğu doğrulanmıştır (Şekil 4). Örneğin, OC mikrodokularının (OC-O) kemikli bileşeni, ancak diğe...

Watch this Scientific Journal Video about Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs at JoVE.com

Creation of a Knee Joint-on-a-Chip for Modeling Joint Diseases and Testing Drugs

İnsan diz eklemindeki kıkırdak, kemik, yağ yastığı ve sinovyumu özetlemek için kullanılan insan mezenkimal kök hücrelerinden dört tip doku üretmek için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Bu dört doku özelleştirilmiş bir biyoreaktöre entegre edilir ve mikroakışkanlar yoluyla bağlanır, böylece çip üzerinde bir diz eklemi oluşturur.

Eklem hastalıklarını modellemek ve ilaçları test etmek için çip üzerinde diz eklemi oluşturulması

The high prevalence of debilitating joint diseases like osteoarthritis (OA) poses a high socioeconomic burden. Currently, the available drugs that target ...

Klinik çalışmalar sırasında insanların ilaçlara nasıl tepki verdiğini doğru bir şekilde tahmin etme yeteneğimiz, fizyolojik olarak ilgili klinik öncesi modellerin eksikliği nedeniyle sınırlıdır. Bu mikrofizyolojik sistem bu eşitsizliği ele alabilir. Bu insan hücresinden türetilmiş sistem, insan dizindeki osteoartritin tüm eklem hastalığı doğasını doğru bir şekilde taklit eder, bu da klinik çalışmalardan önce hastalık modifiye edici osteoartrit ilaçlarının test edilmesine izin verir ve potansiyel olarak milyonlarca dolar tasarruf sağlar.500 mililitre damıtılmış suya 17 gram jelatin tip B ekleyerek metakrillenmiş jelatin veya GelMA hazırlamaya başlayın. 37 santigrat derecede bir çalkalayıcıda 30 dakika karıştırın ve bir çalkalayıcıda gece boyunca karıştırmadan önce 13 mililitre metakrilik anhidrit ekleyin. Ertesi gün, diyaliz torbalarına yaklaşık 60 mililitre GelMA alikotu hazırlayın.Tüm diyaliz torbalarını yedi gün boyunca bir karıştırma çubuğu ile damıtılmış suya koyun. Suyu günde birkaç kez değiştirin ve torbaları gece boyunca dört santigrat derecede bırakın. Yedinci günde, GelMA'yı bir tabağa dökün ve liyofilizasyondan önce eksi 80 santigrat derecede dondurun.Daha sonra, GelMA'yı bir liyofilizatörün vakum odasına yerleştirerek liyofilize edin. Liyofilizatörden çıkarmadan önce tamamen kuruduğundan emin olun. Daha sonra, liyofilize GelMA'yı Hanks'in dengeli tuz çözeltisinde% 15 konsantrasyonda çözün ve az miktarda sodyum hidroksit kullanarak pH'ı 7.4'e ayarlayın.Elde edilen hacme bağlı olarak, çözeltiyi antibiyotik antimikotik ve% 0.15 lityum fenil fosfinat veya LAP ile destekleyin. GelMA çözeltisini ışıktan koruyun ve sonraki kullanıma kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Otoklav 3D baskılı çift akışlı biyoreaktör odaları, kapakları ve ekleri, buharla 20 dakika boyunca 121 santigrat derecede otoklav torbalarında.Ve sonra, kuru ısı ile 20 dakika boyunca. Sterilizasyondan sonra, biyoreaktör odalarını, kapaklarını ve uçlarını biyogüvenlik kabininin içinde bir gecede 15 mililitre steril PBS'ye batırın ve ardından tamamen kurutun. 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak,% 15'lik bir GelMA çözeltisinde mililitre hücre başına altıncı insan kemik iliği türevi mezenkimal kök hücrelere veya MSC'lere 20 kez 10 kez yeniden askıya alın.Ardından, steril eldivenler kullanarak steril, kuru bir silikon kalıbı bir Petri kabına bastırın. Silikon kalıbın her deliğine, kesici ucun delik tarafı aşağı bakacak şekilde forseps olacak şekilde bir uç yerleştirin. İşiniz bittiğinde, 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak kesici uç başına yaklaşık 50 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin.Üst kısmı 1,5 dakika boyunca 395 nanometre dalga boyunda bir UV el fenerine maruz bırakarak kesici ucun içindeki jeli çapraz bağlayın, ardından diğer tarafı 30 saniye boyunca aydınlatın. Steril forsepslerle, ekleri derhal doku kültürü olmayan altı kuyucuklu bir plakada sekiz mililitre büyüme ortamına aktarın ve hücrelerin bir gecede iyileşmesine izin verin. Yağ dokusunun farklılaşmasını başlatmak için, ekleri sekiz mililitre adipojenik ortama aktarın ve günlük ortam değişimi ile 28 gün boyunca kültürleyin.Osteokondral üniteleri tasarlamak için, ekleri çift akışlı biyoreaktör odalarına yerleştirin, kuyucukları kapatın ve iki akışı, 35 mililitre osteojenik ortam ve 35 mililitre kondrojenik ortam ile dakikada beş mikrolitrelik bir akış hızında ayrı ayrı demleyin. İlgili ortam tipleriyle iki haftada bir şırınga değişiklikleri yaparak hücreleri 28 gün boyunca farklılaşma için koruyun. Fibroblastları türetmek için, 21 gün boyunca 20 mililitre fibrojenik ortam içeren bir T 150 santimetrekarelik doku hücresi kültürü şişesinde 2D kültürdeki MSC'leri ayırt edin.Ortamın haftalık değişimini koruyun. 21 gün sonra, hücreleri ayırmak için dört mililitre tripsin kullanın. 3D jelleri kesici uçların içinde kapsülleyin.Sinovyal benzeri fibröz doku veya SFT elde etmek için benzer bir protokol izleyin. 0,062 inç iç çapa ve 0,125 inç dış çapa sahip silikon boruyu bir uçtaki minijoint biyoreaktör çubuğuna ve diğer uçtaki F 1/16th cazibe kilidi konektörlerine bağlayın. Ardından, 3D mini eklem biyoreaktörlerini silikon boru ve kapaklarla birlikte otoklavlayın.Mini eklem kültürü için kullanılmak üzere 35 mililitre ortamı hazırlayın ve orta rezervuarlara yükleyin. Osteokondral üniteleri çift akışlı biyoreaktörden mini eklem biyoreaktörünün sağ kuyusuna aktarmak için düz forseps kullanın. Tüm kuyucukları sterilize edilmiş kapaklarla kaplamadan önce yağ dokusu ekini ve fibröz doku ekini sırasıyla sol ve orta kuyucuklara aktarın.Mini eklem klipsi girişlerini orta haznelere ve çıkışları şırıngalara bağlayın. Ardından, şırıngaları bir şırınga pompasına monte edin. Pompayı ve talaşları bir inkübatöre aktarın.Orta rezervuarları inkübatörün dışındaki buza yerleştirin. Pompayı geri çekme modunda çalıştırın ve ortamı orta hazneden mini eklem biyoreaktör odasına çekin. Bu mini eklem kültürü sürecine 28 gün boyunca devam edin.Eklem iltihabını ve kıkırdak dejenerasyonunu modellemek için, yedi gün boyunca mililitre başına 10 nanogramda fibrojenik ortam suşuna interlökin bir beta ekleyin. Fibrojenik ortama taze interlökin bir beta sağlamadan önce şırıngayı üçüncü günde değiştirdiğinizden emin olun. İlaç testi için, üç günlük interlökin bir beta tedavisinden sonra, ilacı ya paylaşılan ortamda, eklem içi bir uygulamayı simüle ederek ya da sistemik bir uygulamayı simüle ederek tüm orta tiplerde uygulayın.Yedi günlük interlökin bir beta tedavisinden sonra, analiz için bireysel dokuları toplayın. Steril forseps kullanarak uçları çıkardıktan sonra, jeli çıkarmak ve jeli PBS'ye yerleştirmek için kesici ucun ortasından bir biyopsi zımbasını itin. Daha sonra, gen ekspresyonunu değerlendirirken osteokondral jelleri ikiye bölün.Her bir ortam kaynağından yaklaşık 1,5 mililitre ortamı 14.000 G'de 10 dakika boyunca toplayın ve santrifüj edin. Tortuyu attıktan sonra, şartlandırılmış ortamı sıvı azot içinde dondurun. Histolojik boyama ve immün boyama için, ilk olarak, osteokondral ve sinovyal benzeri fibröz dokuyu veya SFT numunelerini% 10 tamponlu formaline sabitleyin ve bunları artan konsantrasyonlardaki etanolde dehidrate edin.Numuneyi ksilen içinde temizleyin, parafine gömün ve son olarak numuneleri altı mikrometre kalınlığa bölün. Yağ dokusu durumunda,% 10 tamponlanmış resmi ve sabit numuneleri doğrudan, yağ kırmızısı O çözeltisi veya BODIPY ile boyayın. Dokuya özgü fenotipler, bireysel mikro dokular için iyi korunmuştur.Mini eklemin tüm dokuları, 28 günlük kültürü takiben fenotiplerini analiz etmek için toplandı. Osteokondral ünitelerin mikro dokularının kemikli bileşeni yüksek düzeyde osteokalsin eksprese etti. Osteokondralın kıkırdak kısmında, dokular önemli ölçüde yüksek seviyelerde kollajen tip iki ve agrekan eksprese etti.Temsili adipojenik genlerin, adiponektin ve leptinin ekspresyon seviyeleri yağ dokusunda daha yüksekti. Kalsiyum mineralleri, alkalen fosfataz ve osteokalsin proteininin birikimi öncelikle osteokondral mikro dokuların kemik boyutunda görülmüştür. Osteokondral dokuların kıkırdak tarafında iyi korunmuş glikozaminoglikan ve kollajen tip iki görüldü.Kondrosit hipertrofisi ile ilişkili belirteçlerin, kollajen tip 10 ve Hint kirpi ekspresyonu, 28 günlük kültürden sonra önemli ölçüde düşük regüle edildi. Yağ dokusunda bol miktarda lipid damlacığı birikimi bulundu. İmmünofloresan boyama, dört haftalık kültürden sonra SFT tarafından sağlam yağlayıcı ve kadherin 11 ekspresyonu gösterdi.Bir hastalık modelinde, IL bir beta tedavisi, SFT'de hücre apoptozu ve yüksek MMP-13 seviyeleri ile sonuçlandı. Kıkırdak yıkımı IL bir beta ile tedavi edildi, bu da osteokondral dokular ve SFT arasında çapraz konuşma olduğunu düşündürdü. Naproksenin sistemik uygulama yoluyla terapötik etkinliği, IL bir beta minijoint'te kıkırdak degradasyonunun azaldığını göstermiştir.Gerçek zamanlı PCR, osteoartrit ilaçlarını modifiye eden dört potansiyel hastalığın kıkırdak kaybını kısmen tersine çevirdiğini göstermiştir. Bu prosedürün en önemli adımları, kesici uçlardaki jellerin çapraz bağlanmasını ve biyoreaktöre kesici uç yerleştirilmesini içerir. Çip, obezite ve mekanik yaralanma gibi osteoartritte sunulan diğer risk faktörlerinin katkısının araştırılmasına izin verir.Diğer eklem hastalıklarını incelemek için de kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Plasma Lithography Surface Patterning for Creation of Cell Networks

Plazma Litografi Yüzey Desenlendirme Hücre Ağları Oluşturma

Systematic manipulation of a cell microenvironment with micro- and nanoscale resolution is often required for deciphering various cellular and molecular ...

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

Environmentally-controlled Microtensile Testing of Mechanically-adaptive Polymer Nanocomposites for ex vivo Characterization

Için Mekanik-adaptif Polimer Nanokompozitler bir çevre kontrollü Mikrogerilim Test<em&gt; Ex vivo</em&gt; Karakterizasyonu

Implantable microdevices are gaining significant attention for several biomedical applications1-4. Such devices have been made from a range of materials, ...

Patient-specific Modeling of the Heart: Estimation of Ventricular Fiber Orientations

Kalp Hastaya özel Modelleme: Ventriküler Fiber Yönelimlerin Tahmini

Patient-specific  simulations of heart (dys)function aimed at personalizing cardiac therapy are hampered  by the absence of in vivo imaging technology for ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Plasenta karşısında Ksenobiyotik ve Nanomalzemelerin Ulaştırma Hızı belirlenmesi kullanarak<em&gt; Ex vivo</em&gt; İnsan Plasental Perfüzyon Modeli

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Stress-induced Antibiotic Susceptibility Testing on a Chip

Çip üzerinde Stres Kaynaklı Antibiyotik Duyarlılık Testi

We have developed a rapid microfluidic method for antibiotic susceptibility testing in a stress-based environment. Fluid is passed at high speeds over ...

Establishment of a Surgically-induced Model in Mice to Investigate the Protective Role of Progranulin in Osteoarthritis

Osteoartrit Progranulin ve koruyucu rolünü araştırmak için Farelerde bir Cerrahi kaynaklı Modeli Kurulması

Destabilization of medial meniscus (DMM) model is an important tool for studying the pathophysiological roles of numerous arthritis associated molecules ...

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

Önceden Tasarlanmış Boyut ve Şekle Sahip Polimerik ve Biyohidred Elyafların Mikroakışkan İmalatı

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Oscillation and Reaction Board Techniques for Estimating Inertial Properties of a Below-knee Prosthesis

Altında diz Protezi Tahmin Atalet Özellikleri için salınım ve Reaksiyon Kurulu Teknikleri

The purpose of this study was two-fold: 1) demonstrate a technique that can be used to directly estimate the inertial properties of a below-knee ...

Creation of Patient-Specific Silicone Cardiac Models with Applications in Pre-surgical Plans and Hands-on Training

Ameliyat Öncesi Planlarda ve Uygulamalı Eğitimde Uygulamalarla Hastaya Özgü Silikon Kardiyak Modellerin Oluşturulması

Three dimensional&#160;models can be a valuable tool for surgeons as they develop surgical plans and medical fellows as they learn about complex cases. In ...