Name: dissecting cell-autonomous function of fragile x mental retardation protein in an auditory circuit by in ovo electroporation
Uploaded: 2022-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af: et tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr. 32000697); Videnskabs- og teknologiprogrammet i Guangzhou (202102080139); Guangdong Natural Science Foundation (2019A1515110625, 2021A1515010619); de centrale universiteters grundforskningsfonde (11620324) et forskningsstipendium fra Key Laboratory of Regenerative Medicine, Undervisningsministeriet, Jinan University (nr. ZSYXM202107); grundforskningsfondene for de centrale universiteter i Kina (21621054) og Medical Scientific Research Foundation i Guangdong-provinsen i Kina (20191118142729581). Vi takker det medicinske eksperimentelle center på Jinan University. Vi takker Dr. Terra Bradley for omhyggelig redigering af manuskriptet.

Æg og kyllingembryoner blev håndteret med omhu og respekt i overensstemmelse med de dyreprotokoller, der blev godkendt af Jinan University Animal Care and Use Committee.
1. Forberedelse af æg og plasmid
<ol><li>Æg forberedelse<ol><li>Få friske befrugtede kyllingæg (Gallus gallus) fra South China Agricultural University og opbevar ved 16 ° C før inkubation. For optimal levedygtighed skal du indstille alle æg til inkubation inden for en uge efter ankomsten.</...

<ol>
	<li>Hagerman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+syndrome.">Fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).</li><li>Hinds, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+expression+of+FMR-1+provides+evidence+for+a+functional+role+in+fragile+X+syndrome.">Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome.</a> Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).</li><li>Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome+FMRP+co-localizes+with+regulatory+targets+PSD-95,+GABA+receptors,+CaMKIIalpha,+and+mGluR5+at+fiber+cell+membranes+in+the+eye+lens.">Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens.</a> Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).</li><li>Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+distribution+of+the+fragile+X+mental+retardation+protein+in+the+mouse+brain.">Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).</li><li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism.">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li><li>Bakker, C. E., Oostra, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+fragile+X+syndrome:+insights+from+animal+models.">Understanding fragile X syndrome: insights from animal models.</a> Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).</li><li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li><li>Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+presynaptic+short-term+plasticity+and+information+processing+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).</li><li>Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+target+cell-specific+role+for+presynaptic+Fmr1+in+regulating+glutamate+release+onto+neocortical+fast-spiking+inhibitory+neurons.">A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).</li><li>Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+FMRP+promotes+the+pruning+of+cell-to-cell+connections+among+pyramidal+neurons+in+the+L5A+neocortical+network.">Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network.</a> Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).</li><li>Higashimori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+deletion+of+astroglial+FMRP+dysregulates+glutamate+transporter+GLT1+and+contributes+to+Fragile+X+syndrome+phenotypes+in+vivo.">Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).</li><li>Hodges, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+contributions+to+synaptic+and+learning+abnormalities+in+a+mouse+model+of+Fragile+X+syndrome.">Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome.</a> Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).</li><li>Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Audiogenic+seizures+in+the+Fmr1+knock-out+mouse+are+induced+by+Fmr1+deletion+in+subcortical,+VGlut2-expressing+excitatory+neurons+and+require+deletion+in+the+inferior+colliculus.">Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).</li><li>Bland, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+regulates+the+subcellular+distribution+of+cortical+dendritic+spine+density+in+a+non-cell-autonomous+manner.">FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner.</a> Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+induces+synapse+loss+through+acute+postsynaptic+translational+regulation.">Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+is+required+for+synapse+elimination+by+the+activity-dependent+transcription+factor+MEF2.">Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2.</a> Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).</li><li>Deng, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+regulates+neurotransmitter+release+and+synaptic+information+transmission+by+modulating+action+potential+duration+via+BK+channels.">FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels.</a> Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).</li><li>Yang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+molecular+locus+for+normalizing+dysregulated+GABA+release+from+interneurons+in+the+Fragile+X+brain.">Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain.</a> Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).</li><li>Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+studies+in+fragile+X+syndrome.">Developmental studies in fragile X syndrome.</a> Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).</li><li>Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+FMRP+regulates+synaptogenesis+in+vivo+in+the+developing+cochlear+nucleus.">Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-specific+roles+of+fragile+X+mental+retardation+protein+in+the+development+of+the+hindbrain+auditory+circuit.">Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit.</a> Development. 147 (21), (2020).</li><li>Rubel, E. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+system+development:+primary+auditory+neurons+and+their+targets.">Auditory system development: primary auditory neurons and their targets.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).</li><li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+auditory+brain-stem+nuclei+in+the+chick+hindbrain.">Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain.</a> Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).</li><li>Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+expression+of+Zic+genes+during+vertebrate+inner+ear+development.">Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development.</a> Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+the+chicken+auditory+brainstem.">In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).</li><li>Evsen, L., Doetzlhofer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+the+chicken+auditory+organ+by+in+ovo+micro-electroporation.">Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).</li><li>Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrkB+downregulation+is+required+for+dendrite+retraction+in+developing+neurons+of+chicken+nucleus+magnocellularis.">TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).</li><li>Wang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+environment+inhibits+cranial+neural+crest+survival+by+activating+excessive+autophagy+in+the+chick+embryo.">High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo.</a> Scientific Reports. 5, 18321 (2015).</li><li>Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+fragile+X+mental+retardation+protein+correlates+with+cellular+and+synaptic+properties+in+primary+auditory+neurons+following+afferent+deprivation.">Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet-1+expression+in+the+developing+chicken+inner+ear.">Islet-1 expression in the developing chicken inner ear.</a> Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).</li><li>Carr, C. E., Boudreau, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+auditory+nerve+fibers+in+the+barn+owl.">Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl.</a> Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).</li><li>Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochleovestibular+nerve+development+is+integrated+with+migratory+neural+crest+cells.">Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells.</a> Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).</li><li>Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+signaling+promotes+axon+segregation+in+the+developing+auditory+system.">EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system.</a> Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).</li><li>Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+neurogenesis+in+the+inner+ear+requires+inhibition+of+Sox2+transcription+by+neurogenin1+and+neurod1.">Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1.</a> Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).</li><li>Curnow, E., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+animal+models+for+understanding+FMRP+functions+and+FXS+pathology.">New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology.</a> Cells. 11 (10), 1628 (2022).</li></ol>

For at bestemme FMRP's celleautonome funktion er det nødvendigt at manipulere dets udtryk i individuelle cellegrupper eller celletyper. Da en af FMRP's hovedfunktioner er at regulere synaptisk dannelse og plasticitet, er selektiv manipulation af hver synaptisk komponent i et bestemt kredsløb forudsætning for en fuld forståelse af FMRP-mekanismen i synaptisk kommunikation. Ved hjælp af ovo elektroporation af kyllingembryoner demonstrerede vi en metode til at målrette FMRP-ek...

Fragilt X syndrom (FXS) er en neurodevelopmental lidelse præget af intellektuel handicap, sensoriske abnormiteter og autistisk adfærd. I de fleste tilfælde er FXS forårsaget af et globalt tab af skrøbeligt X mentalt retarderingsprotein (FMRP; kodet af Fmr1-genet), der starter ved tidlige embryonale stadier1. FMRP er et RNA-bindende protein, der normalt udtrykkes i de fleste neuroner og gliaceller i hjernen såvel som i sensoriske organer 2,3,4. I pattedyrhjerner er FMRP sandsynligvis forbundet med hundredvis af mRNA'er, der koder for proteiner, der er vigtige for forskellige neurale aktiviteter5. Undersøgelser af konventionelle Fmr1 knockout-dyr viste, at FMRP-ekspression er særlig vigtig for samlingen og plasticiteten af synaptisk neurotransmission6. Flere betingede og mosaik knockout-modeller har yderligere vist, at FMRP-handlinger og signaler varierer på tværs af hjerneområder, celletyper og synaptiske steder under flere udviklingshændelser, herunder axonal projektion, dendritisk mønster og synaptisk plasticitet 7,8,9,10,11,12,13,14 . Akut funktion af FMRP til regulering af synaptisk transmission blev undersøgt ved intracellulær levering af hæmmende FMRP-antistoffer eller FMRP selv i hjerneskiver eller dyrkede neuroner15,16,17,18. Disse metoder giver imidlertid ikke mulighed for at spore FMRP-fejludtryksinducerede konsekvenser under udviklingen. Der er således et stort behov for at udvikle in vivo-metoder til at undersøge FMRP's celleautonome funktioner og forventes at hjælpe med at afgøre, om de rapporterede anomalier hos FXS-patienter er direkte konsekvenser af FMRP-tab i de tilknyttede neuroner og kredsløb eller sekundære konsekvenser afledt af netværksdækkende ændringer under udvikling19.
Den auditive hjernestamme af kyllingembryoner tilbyder en unik fordelagtig model til dybdegående funktionelle analyser af FMRP-regulering i kredsløbs- og synapseudvikling. Den lette adgang til embryonale kyllingehjerner og den veletablerede teknik til genmanipulation har i høj grad bidraget til vores forståelse af hjernens udvikling i de tidlige fosterstadier. I en nyligt offentliggjort undersøgelse blev denne teknik kombineret med avancerede molekylære værktøjer, der tillader tidsmæssig kontrol af FMRP-fejludtryk20,21. Her er metoden avanceret til at inducere selektive manipulationer af presynaptiske og postsynaptiske neuroner separat. Denne metode blev udviklet i det auditive hjernestammekredsløb. Akustisk signal detekteres af hårceller i det auditive indre øre og overføres derefter til den auditive ganglion (AG; også kaldet spiralganglion hos pattedyr). Bipolære neuroner i AG innerverer hårceller med deres perifere processer og sender igen en central projektion (hørenerven) til hjernestammen, hvor de ender i to primære cochlearkerner, kernen magnocellularis (NM) og kernen angularis (NA). Neuroner i NM er strukturelt og funktionelt sammenlignelige med de sfæriske buskede celler i pattedyrets anteroventrale cochlear kerne. Inden for NM synapser auditive nervefibre (ANF'er) på somata af NM-neuroner via den store endepære af Held-terminaler22. Under udviklingen opstår NM-neuroner fra rhombomerer 5 og 6 (r5/6) i baghjernen23, mens AG-neuroner er afledt af neuroblaster, der er bosiddende i otocyst24. Her beskriver vi proceduren for selektivt at slå FMRP-ekspression i de presynaptiske AG-neuroner og i de postsynaptiske NM-neuroner separat.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Egg incubation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 &#176;C refrigerator</td>
			<td>MAGAT</td>
			<td></td>
			<td>Used for fertilized egg storage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>SHANGHAI BOXUN</td>
			<td>GZX-9240MBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized eggs</td>
			<td>Farm of South China Agricultural University</td>
			<td></td>
			<td>Eggs must be used in one week for optimal viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1661</td>
			<td>Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi-prep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td>Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Make 7.5M working solution in nuclase-free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation and Doxycycline Administration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>ECM399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL / 5 mL Syringe</td>
			<td>GUANGZHOU KANGFULAI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>CNOPTEC</td>
			<td>SZM-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxcycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td>Use fresh aliquots for each dose and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>BEIBOBOMEI</td>
			<td>RD0910</td>
			<td>0.9-1.1 mm*100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory parafilm</td>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>PM996</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>CHENGDU INSTRUMENT FACTORY</td>
			<td>WD-2</td>
			<td>Pulling condition: 500 &#176;C for 15 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum elctrodes</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum elctrodes</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Dissection and Fixation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td>Tip size: 0.05*0.01 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other surgery tools</td>
			<td>RWD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 &#176;C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW</td>
			<td>01673921</td>
			<td>For black background plates, food-grade carbon powder is applied.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9391</td>
			<td>From bovine skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding microtome</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SM2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150113</td>
			<td>1:500 dilution, RRID: AB_2576208</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150078</td>
			<td>1:500 dilution, RRID: AB_2722519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab285390</td>
			<td>1: 1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>Southern&#160;Biotech</td>
			<td>Sb-0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMRP antibody</td>
			<td>Y. Wang, Florida State University</td>
			<td>#8263</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_2861242</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.3F7</td>
			<td>1:100 dilution, RRID: AB_1157901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4142</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_477272</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parvalbumin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3088</td>
			<td>1:10000 dilution, RRID: AB_477329</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAP25 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab66066</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_2192052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe photoshop</td>
			<td>ADOBE</td>
			<td></td>
			<td>image editing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Image-Pro Plus 7.0</td>
			<td>OlYMPUS</td>
			<td></td>
			<td>commercial image processing software package</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting cell-autonomous function of fragile x mental retardation protein in an auditory circuit by in ovo electroporation

Fragile X mental retardation protein (FMRP) er et mRNA-bindende protein, der regulerer lokal proteintranslation. FMRP-tab eller dysfunktion fører til afvigende neuronale og synaptiske aktiviteter i skrøbeligt X syndrom (FXS), som er karakteriseret ved intellektuel handicap, sensoriske abnormiteter og sociale kommunikationsproblemer. Undersøgelser af FMRP-funktion og FXS-patogenese er primært blevet udført med Fmr1 (genet, der koder for FMRP) knockout hos transgene dyr. Her rapporterer vi en in vivo-metode til bestemmelse af FMRP's celleautonome funktion i perioden med kredsløbssamling og synaptisk dannelse ved hjælp af kyllingembryoner. Denne metode anvender fase-, sted- og retningsspecifik elektroporation af et lægemiddelinducerbart vektorsystem indeholdende Fmr1 lille hårnål RNA (shRNA) og en EGFP-reporter. Med denne metode opnåede vi selektiv FMRP-knockdown i den auditive ganglion (AG) og i et af dens hjernestammemål, kernen magnocellularis (NM), hvilket gav en komponentspecifik manipulation inden for AG-NM-kredsløbet. Derudover tillader transfektens mosaikmønster kontrol inden for dyr og nærliggende neuron / fibersammenligninger for forbedret pålidelighed og følsomhed i dataanalyse. Det inducerbare vektorsystem giver tidsmæssig kontrol af genredigeringsstart for at minimere akkumulerende udviklingseffekter. Kombinationen af disse strategier giver et innovativt værktøj til at dissekere FMRP's celleautonome funktion i synaptisk og kredsløbsudvikling.

Ved at udføre i ovo elektroporation på forskellige steder og på forskellige udviklingsstadier opnåede vi selektiv FMRP-knockdown enten i den auditive periferi eller i den auditive hjernestamme.
FMRP knockdown i NM Lille hårnål RNA (shRNA) mod kyllingen Fmr1 blev designet og klonet ind i Tet-On vektorsystemet som beskrevet tidligere20. Opsætningen for in ovo-elektroporation er vist i figur 1A</str...

Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation at JoVE.com

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Ved hjælp af ovo elektroporation udtænkte vi en metode til selektivt at transficere det auditive indre øre og cochlearkernen i kyllingembryoner for at opnå en cellegruppespecifik knockdown af skrøbeligt X mentalt retarderingsprotein i diskrete perioder med kredsløbssamling.

Dissekering af celle-autonom funktion af skrøbeligt X mentalt retarderingsprotein i et auditivt kredsløb ved In Ovo-elektroporation

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to ...

Vores protokol er en in vivo-metode til at undersøge FMRP's celleautonome funktioner under udviklingen. Dette kan hjælpe med at forstå den celletypespecifikke patofysiologi af fragilt X syndrom. Denne metode anvender fase-, sted- og retningsspecifik elektroporation af et lægemiddelinducerbart vektorsystem indeholdende Fmr1 lille hårnål RNA.Med denne metode opnår vi den selektive FMRP-knockdown i det auditive kredsløb. Denne metode kan også anvendes til at undersøge funktionen af andre gener i det auditive kredsløb eller det vestibulære system. Begynd med at placere æggene vandret for at placere embryoet på toppen af ægget for nem manipulation.Inkuberes ved 38 grader Celsius i 46 til 48 timer indtil Hamburger og Hamilton, eller HH trin 12, til neuralrørstransfektion eller i 54 til 56 timer indtil HH 13 til otocysttransfektion. Fjern æggene fra inkubatoren, et dusin æg ad gangen. At holde æg ude af deres inkubator i mere end en time introducerer udviklingsvariationer og reducerer levedygtigheden.Brug en lommelygte til at kaste lys fra bunden af ægget. Embryonets placering fremstår som et mørkt område på æggeskallen. Marker embryoets placering på æggeskallen med en blyant.Tør æggene af med gaze indeholdende 75% ethanol, og bor et hul i den spidse ende af æggene ved hjælp af spidsen af en saks. Fjern derefter to milliliter albumin med en 18-gauge nålesprøjte. Sørg for, at hullet kun er stort nok til at tillade nåleindsættelse.Tør ethvert lækkende albumin væk med gasbind og forsegl hullet med klar tape. Dæk toppen af æggene med klar tape, centreret på det blyantmærkede mørke område for at minimere revner og forhindre faldende skalrester under vinduesåbning. Tør alt kirurgiske værktøj af med gazebind indeholdende 75 % ethanol, og tør det tapedækkede område af med 75 % ethanol.Brug en lille saks til at klippe et vindue på en til to kvadratcentimeter rundt om blyantmærkets omkreds. Hold saksen flad for at undgå at beskadige embryoet nedenunder. Placer vinduesægget under et stereomikroskop med et 10X øjenstykke og 2X zoom.Fyld en sprøjte på en milliliter med blækopløsningen, og monter derefter en 27-gauge nål. Bøj nålen til en 45 graders vinkel med tang. Under mikroskopet skal du forsigtigt stikke fra kanten af området opaqua og indsætte nålen under embryoet.Injicer omkring 50 mikroliter blæk, som vil diffundere under området pellucida, til embryovisualisering. Blækket danner en mørk baggrund for den klare visualisering af embryoet. Træk glaskapillærer ind i pipetter ved hjælp af en pipettetrækker.Under et dissekeringsmikroskop skal du forsigtigt åbne spidsen af kapillærnålen til 10 til 20 mikrometer i diameter med tang. Opbevar pipetterne i en opbevaringsboks indtil brug. Fyld derefter en kapillærpipette med 0,5 til 1 mikroliter af plasmidblandingen ved at påføre undertryk gennem et gummirør i enden af pipetten med en sprøjte.Placer ægget under mikroskopet, så embryoet er lodret orienteret med halen tæt på dig. Hold kapillærpipetten med den ene hånd eller med den treaksede manipulator, og kør pipettens spids til rombomere 5 til 6. i en hale-til-hoved retning.Stik forsigtigt spidsen gennem vitellinmembranen og ind i dorsalneuralrøret, og træk derefter pipetten lidt ud, så spidsen er i neuralrørets lumen. Injicer plasmidblandingen ved at påføre lufttryk, indtil det tonede plasmid diffunderer helt ind i rhombomere 5 til 6 og strækker sig ind i rhombomere 3 og rhombomere 4. Kontroller for vellykket injektion, hvilket opnås, når den blå plasmidopløsning hurtigt diffunderer ned i neuralrøret uden at lække.Når der opstår lækage, falder det blå hurtigt. Umiddelbart efter injektionen anbringes en platin bipolar elektrode på hver side af neuralrøret. Lever to impulser på 12 volt og 50 millisekunder varighed med en elektroporator.Overhold luftbobler i enderne af den bipolære elektrode, med mere på den negative side. Kontroller for vellykket elektroporation, hvilket opnås, når den tonede plasmidblanding kommer ind i neuralrørsvævet nær den positive side af elektroden. Efter elektroporation skal du forsigtigt fjerne den bipolære elektrode.Dæk vinduet på æggeskallen med et stykke gennemsigtig film, der er forskåret til to tommer firkanter og sprøjtet med 75% ethanol. Placer ægget tilbage i sin inkubator. Rengør den bipolære elektrode ved at levere 10 til 20 impulser på 12 volt og 50 millisekunder i saltvand, inden du fortsætter til det næste æg.Under mikroskopet skal du placere ægget på en sådan måde, at embryoet er lodret med halen i nærheden af dig. Hold kapillærpipetten og stik forsigtigt den højre otocyst i dorsolateral retning. Injicer plasmidblandingen med lufttryk, indtil otocysten er fyldt med blå opløsning.Kontroller for en vellykket injektion, som opnås, når den blå plasmidblanding er begrænset i otocysten og ikke lækker. Umiddelbart efter injektionen placeres den bipolære elektrode på otocysten og placeres henholdsvis de positive og negative sider anterior og posterior til otocysten. Lever to impulser på 12 volt og 50 millisekunders varighed med elektroporatoren.Kontroller for vellykket elektroporation, som opnås, når den blå plasmidblanding kommer ind i otocystens væv nær den positive side af elektroden. Efter elektroporation skal du forsigtigt fjerne den bipolære elektrode og dække vinduet på æggeskallen med en gennemsigtig film. Til sidst returneres ægget til inkubatoren.Det repræsentative billede viser et eksempel på embryonal dag tre eller E3 efter neurorørtransfektion og doxbehandling på embryonal dag to eller E2. Transinficerede celler med Fmr1 shRNA og EGFP på tværsnittet er vist her. EGFP-ekspressive celler var begrænset til den ene side af neuralrøret og hjernestammen. Et tværsnit ved E15 med EGFP-ekspressive kerne magnocellularis eller NM-neuroner på den transficerede side er vist her.På den kontralaterale side blev EGFP-holdige axoner set i den ventrale del af kernen laminaris eller NL. Knockdown-effekten af Fmr1 shRNA blev valideret ved markante reduktioner i FMRP-immunreaktivitet i transinficerede NM-neuroner sammenlignet med nærliggende ikke-transficerede neuroner. Den auditive ganglion ved E19 med FMRP-immunreaktivitet er vist her. Auditive ganglion neuroner blev ikke transficeret.Nogle gliaceller afledt af kraniale neurale kamceller blev transficeret. De repræsentative billeder viser FMRP-knock-down i den auditive kanal efter otocysttransfektion. Auditive kanaler på E9 udviste omfattende EGFP-fluorescens.På tværgående sektioner var EGFP-ekspressive celler placeret i basilar papilla og den auditive ganglion. Knockdown-effekten af Fmr1 shRNA blev valideret af reduceret FMRP-immunreaktivitet i transinficerede hårceller sammenlignet med nærliggende ikke-transficerede hårceller. Tilsvarende blev FMRP-immunreaktivitet stort set formindsket i transficerede auditive ganglionneuroner.Den centrale projektion af de transficerede auditive ganglionneuroner blev sporet til hjernestammen via den auditive nerve med karakteriserede endbulb terminaler. Mens du forsøger denne procedure, er det vigtigste at kontrollere stedet og retningen af elektroporation til selektiv transfektion. Efter denne procedure kan enkeltcelletypefyldning, immunostaining, cellesortering efterfulgt af massespektrum eller enkeltcellesekventering udføres for at afsløre ændringerne på morfologiske og biokemiske niveauer.Denne teknik muliggør også selektiv redigering af andre gener med tidsmæssig kontrol og komponentspecificitet i det auditive øre for stamkredsløb og kan modificeres til at manipulere det vestibulære system.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

I ovo Elektroporation i Chick midthjernen for at studere genfunktion i dopaminerg Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

I ovo Elektroporation af miRNA-baserede plasmider i udviklingslandene neuralrøret og vurdering af fænotyper ved Dil Injection i Open-bog Forberedelser

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Undersøgelser om Ændringer af hippocampus Circuit funktion efter Mild traumatisk hjerneskade

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

I ovo Angivelse af MicroRNA i Ventral Chick Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

Et let, Hovedtelefoner-baseret system til at manipulere Auditiv Feedback i Songbirds

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Påvisning af protein palmitoylering i dyrkede hippocampale neuroner ved immunopræcipitation og Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...