Name: dissecting cell-autonomous function of fragile x mental retardation protein in an auditory circuit by in ovo electroporation
Uploaded: 2022-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door: een national natural science foundation of China grant (nr. 32000697); het wetenschaps- en technologieprogramma van Guangzhou (202102080139); de Guangdong Natural Science Foundation (2019A1515110625, 2021A1515010619); de Fondsen voor fundamenteel onderzoek voor de Centrale Universiteiten (11620324); een onderzoeksbeurs van Key Laboratory of Regenerative Medicine, Ministerie van Onderwijs, Jinan University (Nr. ZSYXM202107); de fondsen voor fundamenteel onderzoek voor de centrale universiteiten van China (21621054); en de Medical Scientific Research Foundation van de provincie Guangdong in China (20191118142729581). We bedanken het medisch experimenteel centrum van Jinan University. Wij danken Dr. Terra Bradley voor de zorgvuldige bewerking van het manuscript.

Eieren en kippenembryo's werden met zorg en respect behandeld in overeenstemming met de dierprotocollen die zijn goedgekeurd door de Jinan University Animal Care and Use Committee.
1. Bereiding van eieren en plasmide
<ol><li>Eierbereiding<ol><li>Verkrijg verse bevruchte kippeneieren (Gallus gallus) van de South China Agricultural University en bewaar bij 16 °C vóór de incubatie. Voor optimale levensvatbaarheid, zet alle eieren voor incubatie binnen een week na aa...

<ol>
	<li>Hagerman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+syndrome.">Fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).</li><li>Hinds, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+expression+of+FMR-1+provides+evidence+for+a+functional+role+in+fragile+X+syndrome.">Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome.</a> Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).</li><li>Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome+FMRP+co-localizes+with+regulatory+targets+PSD-95,+GABA+receptors,+CaMKIIalpha,+and+mGluR5+at+fiber+cell+membranes+in+the+eye+lens.">Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens.</a> Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).</li><li>Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+distribution+of+the+fragile+X+mental+retardation+protein+in+the+mouse+brain.">Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).</li><li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism.">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li><li>Bakker, C. E., Oostra, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+fragile+X+syndrome:+insights+from+animal+models.">Understanding fragile X syndrome: insights from animal models.</a> Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).</li><li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li><li>Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+presynaptic+short-term+plasticity+and+information+processing+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).</li><li>Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+target+cell-specific+role+for+presynaptic+Fmr1+in+regulating+glutamate+release+onto+neocortical+fast-spiking+inhibitory+neurons.">A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).</li><li>Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+FMRP+promotes+the+pruning+of+cell-to-cell+connections+among+pyramidal+neurons+in+the+L5A+neocortical+network.">Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network.</a> Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).</li><li>Higashimori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+deletion+of+astroglial+FMRP+dysregulates+glutamate+transporter+GLT1+and+contributes+to+Fragile+X+syndrome+phenotypes+in+vivo.">Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).</li><li>Hodges, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+contributions+to+synaptic+and+learning+abnormalities+in+a+mouse+model+of+Fragile+X+syndrome.">Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome.</a> Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).</li><li>Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Audiogenic+seizures+in+the+Fmr1+knock-out+mouse+are+induced+by+Fmr1+deletion+in+subcortical,+VGlut2-expressing+excitatory+neurons+and+require+deletion+in+the+inferior+colliculus.">Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).</li><li>Bland, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+regulates+the+subcellular+distribution+of+cortical+dendritic+spine+density+in+a+non-cell-autonomous+manner.">FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner.</a> Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+induces+synapse+loss+through+acute+postsynaptic+translational+regulation.">Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+is+required+for+synapse+elimination+by+the+activity-dependent+transcription+factor+MEF2.">Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2.</a> Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).</li><li>Deng, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+regulates+neurotransmitter+release+and+synaptic+information+transmission+by+modulating+action+potential+duration+via+BK+channels.">FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels.</a> Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).</li><li>Yang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+molecular+locus+for+normalizing+dysregulated+GABA+release+from+interneurons+in+the+Fragile+X+brain.">Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain.</a> Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).</li><li>Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+studies+in+fragile+X+syndrome.">Developmental studies in fragile X syndrome.</a> Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).</li><li>Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+FMRP+regulates+synaptogenesis+in+vivo+in+the+developing+cochlear+nucleus.">Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-specific+roles+of+fragile+X+mental+retardation+protein+in+the+development+of+the+hindbrain+auditory+circuit.">Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit.</a> Development. 147 (21), (2020).</li><li>Rubel, E. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+system+development:+primary+auditory+neurons+and+their+targets.">Auditory system development: primary auditory neurons and their targets.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).</li><li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+auditory+brain-stem+nuclei+in+the+chick+hindbrain.">Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain.</a> Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).</li><li>Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+expression+of+Zic+genes+during+vertebrate+inner+ear+development.">Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development.</a> Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+the+chicken+auditory+brainstem.">In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).</li><li>Evsen, L., Doetzlhofer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+the+chicken+auditory+organ+by+in+ovo+micro-electroporation.">Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).</li><li>Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrkB+downregulation+is+required+for+dendrite+retraction+in+developing+neurons+of+chicken+nucleus+magnocellularis.">TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).</li><li>Wang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+environment+inhibits+cranial+neural+crest+survival+by+activating+excessive+autophagy+in+the+chick+embryo.">High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo.</a> Scientific Reports. 5, 18321 (2015).</li><li>Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+fragile+X+mental+retardation+protein+correlates+with+cellular+and+synaptic+properties+in+primary+auditory+neurons+following+afferent+deprivation.">Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet-1+expression+in+the+developing+chicken+inner+ear.">Islet-1 expression in the developing chicken inner ear.</a> Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).</li><li>Carr, C. E., Boudreau, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+auditory+nerve+fibers+in+the+barn+owl.">Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl.</a> Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).</li><li>Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochleovestibular+nerve+development+is+integrated+with+migratory+neural+crest+cells.">Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells.</a> Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).</li><li>Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+signaling+promotes+axon+segregation+in+the+developing+auditory+system.">EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system.</a> Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).</li><li>Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+neurogenesis+in+the+inner+ear+requires+inhibition+of+Sox2+transcription+by+neurogenin1+and+neurod1.">Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1.</a> Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).</li><li>Curnow, E., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+animal+models+for+understanding+FMRP+functions+and+FXS+pathology.">New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology.</a> Cells. 11 (10), 1628 (2022).</li></ol>

Om de cel-autonome functie van FMRP te bepalen, is het manipuleren van de expressie ervan in individuele celgroepen of celtypen noodzakelijk. Aangezien een van de belangrijkste functies van FMRP is om synaptische vorming en plasticiteit te reguleren, is het selectief manipuleren van elke synaptische component van een bepaald circuit een voorwaarde voor een volledig begrip van het FMRP-mechanisme in synaptische communicatie. Met behulp van ovo-elektroporatie van kippenembryo's de...

Fragiele X-syndroom (FXS) is een neurologische ontwikkelingsstoornis die wordt gekenmerkt door een verstandelijke beperking, sensorische afwijkingen en autistisch gedrag. In de meeste gevallen wordt FXS veroorzaakt door een wereldwijd verlies van fragiel X-mentaal retardatie-eiwit (FMRP; gecodeerd door het Fmr1-gen) vanaf vroege embryonale stadia1. FMRP is een RNA-bindend eiwit dat normaal tot expressie komt in de meeste neuronen en gliacellen in de hersenen, evenals in sensorische organen 2,3,4. In zoogdierhersenen wordt FMRP waarschijnlijk geassocieerd met honderden mRNA's die coderen voor eiwitten die belangrijk zijn voor verschillende neurale activiteiten5. Studies van conventionele Fmr1 knock-out dieren toonden aan dat FMRP-expressie bijzonder belangrijk is voor de assemblage en plasticiteit van synaptische neurotransmissie6. Verschillende voorwaardelijke en mozaïek knock-outmodellen hebben verder aangetoond dat FMRP-acties en -signalen variëren tussen hersengebieden, celtypen en synaptische locaties tijdens verschillende ontwikkelingsgebeurtenissen, waaronder axonale projectie, dendritische patronen en synaptische plasticiteit 7,8,9,10,11,12,13,14 . Acute functie van FMRP bij het reguleren van synaptische transmissie werd bestudeerd door intracellulaire toediening van remmende FMRP-antilichamen of FMRP zelf in hersenplakken of gekweekte neuronen 15,16,17,18. Deze methoden bieden echter niet de mogelijkheid om FMRP-misexpressie-geïnduceerde gevolgen tijdens de ontwikkeling te volgen. Het ontwikkelen van in vivo methoden om de cel-autonome functies van FMRP te onderzoeken is dus in grote behoefte, en naar verwachting zal het helpen bepalen of de gerapporteerde anomalieën bij FXS-patiënten directe gevolgen zijn van FMRP-verlies in de geassocieerde neuronen en circuits, of secundaire gevolgen afgeleid van netwerkbrede veranderingen tijdens ontwikkeling19.
De auditieve hersenstam van kippenembryo's biedt een uniek voordelig model voor diepgaande functionele analyses van FMRP-regulatie in circuit- en synapsontwikkeling. De gemakkelijke toegang tot embryonale kippenhersenen en de gevestigde ovo-elektroporatietechniek voor genetische manipulatie hebben sterk bijgedragen aan ons begrip van de ontwikkeling van de hersenen in vroege embryonale stadia. In een onlangs gepubliceerde studie werd deze techniek gecombineerd met geavanceerde moleculaire hulpmiddelen die temporele controle van FMRP-misexpressie20,21 mogelijk maken. Hier is de methodologie geavanceerd om selectieve manipulaties van presynaptische en postsynaptische neuronen afzonderlijk te induceren. Deze methode is ontwikkeld in het auditieve hersenstamcircuit. Akoestisch signaal wordt gedetecteerd door haarcellen in het auditieve binnenoor en vervolgens overgebracht naar het auditieve ganglion (AG; ook wel het spiraalganglion bij zoogdieren genoemd). Bipolaire neuronen in de AG innerveren haarcellen met hun perifere processen en sturen op hun beurt een centrale projectie (de gehoorzenuw) naar de hersenstam waar ze eindigen in twee primaire cochleaire kernen, de nucleus magnocellularis (NM) en de nucleus angularis (NA). Neuronen in de NM zijn structureel en functioneel vergelijkbaar met de bolvormige bossige cellen van de anteroventrale cochleaire kern van zoogdieren. Binnen de NM synapsen gehoorzenuwvezels (ANF's) op de somata van NM-neuronen via de grote eindbulb van Held terminals22. Tijdens de ontwikkeling ontstaan NM-neuronen uit rhombomeren 5 en 6 (r5/6) in de achterhersenen23, terwijl AG-neuronen zijn afgeleid van neuroblasten die zich in de otocyste24 bevinden. Hier beschrijven we de procedure om selectief FMRP-expressie in de presynaptische AG-neuronen en in de postsynaptische NM-neuronen afzonderlijk af te slaan.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Egg incubation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 &#176;C refrigerator</td>
			<td>MAGAT</td>
			<td></td>
			<td>Used for fertilized egg storage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>SHANGHAI BOXUN</td>
			<td>GZX-9240MBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized eggs</td>
			<td>Farm of South China Agricultural University</td>
			<td></td>
			<td>Eggs must be used in one week for optimal viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1661</td>
			<td>Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi-prep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td>Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Make 7.5M working solution in nuclase-free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation and Doxycycline Administration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>ECM399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL / 5 mL Syringe</td>
			<td>GUANGZHOU KANGFULAI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>CNOPTEC</td>
			<td>SZM-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxcycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td>Use fresh aliquots for each dose and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>BEIBOBOMEI</td>
			<td>RD0910</td>
			<td>0.9-1.1 mm*100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory parafilm</td>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>PM996</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>CHENGDU INSTRUMENT FACTORY</td>
			<td>WD-2</td>
			<td>Pulling condition: 500 &#176;C for 15 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum elctrodes</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum elctrodes</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Dissection and Fixation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td>Tip size: 0.05*0.01 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other surgery tools</td>
			<td>RWD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 &#176;C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW</td>
			<td>01673921</td>
			<td>For black background plates, food-grade carbon powder is applied.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9391</td>
			<td>From bovine skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding microtome</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SM2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150113</td>
			<td>1:500 dilution, RRID: AB_2576208</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150078</td>
			<td>1:500 dilution, RRID: AB_2722519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab285390</td>
			<td>1: 1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>Southern&#160;Biotech</td>
			<td>Sb-0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMRP antibody</td>
			<td>Y. Wang, Florida State University</td>
			<td>#8263</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_2861242</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.3F7</td>
			<td>1:100 dilution, RRID: AB_1157901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4142</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_477272</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parvalbumin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3088</td>
			<td>1:10000 dilution, RRID: AB_477329</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAP25 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab66066</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_2192052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe photoshop</td>
			<td>ADOBE</td>
			<td></td>
			<td>image editing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Image-Pro Plus 7.0</td>
			<td>OlYMPUS</td>
			<td></td>
			<td>commercial image processing software package</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting cell-autonomous function of fragile x mental retardation protein in an auditory circuit by in ovo electroporation

Fragiele X mentale retardatie-eiwit (FMRP) is een mRNA-bindend eiwit dat de lokale eiwittransformatie reguleert. FMRP-verlies of disfunctie leidt tot afwijkende neuronale en synaptische activiteiten bij fragiele X-syndroom (FXS), dat wordt gekenmerkt door intellectuele achterstand, sensorische afwijkingen en sociale communicatieproblemen. Studies naar FMRP-functie en FXS-pathogenese zijn voornamelijk uitgevoerd met Fmr1 (het gen dat codeert voor FMRP) knock-out bij transgene dieren. Hier rapporteren we een in vivo methode voor het bepalen van de cel-autonome functie van FMRP tijdens de periode van circuitassemblage en synaptische vorming met behulp van kippenembryo's. Deze methode maakt gebruik van fase-, plaats- en richtingsspecifieke elektroporatie van een geneesmiddel-induceerbaar vectorsysteem met Fmr1 klein haarspeld-RNA (shRNA) en een EGFP-verslaggever. Met deze methode bereikten we selectieve FMRP-knockdown in het auditieve ganglion (AG) en in een van zijn hersenstamdoelen, de nucleus magnocellularis (NM), waardoor een componentspecifieke manipulatie binnen het AG-NM-circuit werd geboden. Bovendien maakt het mozaïekpatroon van de transfectie controles binnen het dier en naburige neuron / vezelvergelijkingen mogelijk voor verbeterde betrouwbaarheid en gevoeligheid bij het analyseren van gegevens. Het induceerbare vectorsysteem biedt temporele controle over het begin van genbewerking om accumulerende ontwikkelingseffecten te minimaliseren. De combinatie van deze strategieën biedt een innovatief hulpmiddel om de cel-autonome functie van FMRP in synaptische en circuitontwikkeling te ontleden.

Door ovo-elektroporatie uit te voeren op verschillende locaties en in verschillende ontwikkelingsstadia, bereikten we selectieve FMRP-knockdown in de auditieve periferie of in de auditieve hersenstam.
FMRP knockdown in NM Klein haarspeld RNA (shRNA) tegen de kip Fmr1 werd ontworpen en gekloond in het Tet-On vectorsysteem zoals eerder beschreven20. De opstelling voor in ovo-elektroporatie is weergegeven in <strong class="xfi...

Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation at JoVE.com

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Met behulp van ovo-elektroporatie hebben we een methode ontwikkeld om selectief het auditieve binnenoor en de cochleaire kern in kippenembryo's te transfecteren om een celgroepspecifieke knockdown van fragiele X mentale retardatie-eiwit te bereiken tijdens discrete perioden van circuitassemblage.

Ontleedende cel-autonome functie van fragiele X mentale retardatie-eiwit in een auditief circuit door In Ovo-elektroporatie

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to ...

Ons protocol is een in vivo methode om de cel-autonome functies van FMRP tijdens de ontwikkeling te onderzoeken. Dit kan helpen om de celtype-specifieke pathofysiologie van het fragiele X-syndroom te begrijpen. Deze methode maakt gebruik van fase-, plaats- en richtingsspecifieke elektroporatie van een geneesmiddelinduceerbaar vectorsysteem dat Fmr1 klein haarspeld-RNA bevat.Met deze methode bereiken we de selectieve FMRP-knockdown in het auditieve circuit. Deze methode kan ook worden toegepast om de functie van andere genen in het auditieve circuit of het vestibulaire systeem te onderzoeken. Begin met het horizontaal plaatsen van de eieren om het embryo op de bovenkant van het ei te plaatsen voor eenvoudige manipulatie.Incubeer bij 38 graden Celsius gedurende 46 tot 48 uur tot Hamburger en Hamilton, of HH stadium 12, voor neurale buistransfectie of gedurende 54 tot 56 uur tot HH 13 voor otocyste transfectie. Verwijder de eieren uit de broedmachine, een dozijn eieren per keer. Eieren langer dan een uur uit hun broedmachine houden, introduceert ontwikkelingsvariaties en vermindert de levensvatbaarheid.Gebruik een zaklamp om licht van de bodem van het ei te werpen. De locatie van het embryo verschijnt als een donker gebied op de eierschaal. Markeer de locatie van het embryo op de eierschaal met een potlood.Veeg de eieren af met gaas dat 75% ethanol bevat en boor een gat in het puntige uiteinde van de eieren met behulp van de schaarpunt. Verwijder vervolgens twee milliliter albumine met een naaldspuit van 18 gauge. Zorg ervoor dat het gat alleen groot genoeg is om de naald in te brengen.Veeg eventuele lekkende albumine weg met gaas en sluit het gat af met doorzichtige tape. Bedek de bovenkant van de eieren met doorzichtige tape, gecentreerd op het met potlood gemarkeerde donkere gebied om scheuren te minimaliseren en vallend schelpafval tijdens het vensteren te voorkomen. Veeg alle operatiegereedschappen af met gaas dat 75% ethanol bevat en veeg het met tape bedekte gebied af met 75% ethanol.Gebruik een kleine schaar om een venster van één tot twee vierkante centimeter rond de omtrek van het potloodmerk te knippen. Houd de schaar plat om te voorkomen dat het embryo eronder wordt beschadigd. Plaats het vensterei onder een stereomicroscoop met een 10X oogstuk en 2X zoom.Vul een spuit van één milliliter met de inktoplossing en plaats vervolgens een naald van 27 gauge. Buig de naald in een hoek van 45 graden met een tang. Steek onder de microscoop voorzichtig vanaf de rand van het gebied opaqua en steek de naald onder het embryo in.Injecteer ongeveer 50 microliter inkt, die onder het gebied pellucida diffundeert, voor embryovisualisatie. De inkt vormt een donkere achtergrond voor de heldere visualisatie van het embryo. Trek glazen haarvaten in pipetten met behulp van een pipettrekker.Open onder een ontleedmicroscoop voorzichtig de punt van de capillaire naald tot 10 tot 20 micrometer in diameter met een tang. Bewaar de pipetten in een opbergdoos tot gebruik. Vul vervolgens een capillaire pipet met 0,5 tot 1 microliter van het plasmidemengsel door negatieve druk uit te oefenen door een rubberen buis aan het einde van de pipet met een spuit.Leg het ei onder de microscoop zodat het embryo verticaal georiënteerd is met de staart bij je in de buurt. Houd de capillaire pipet met één hand of met de drieassige manipulator en drijf de punt van de pipet naar de rhombomeer 5 tot 6. in een staart-tot-kop richting.Prik de punt voorzichtig door het vitellinmembraan en in de dorsale neurale buis en trek vervolgens de pipet een beetje terug zodat de punt in het lumen van de neurale buis zit. Injecteer het plasmidemengsel door luchtdruk uit te oefenen totdat het getinte plasmide volledig diffundeert in rhombomeer 5 tot 6 en zich uitstrekt tot rhombomeer 3 en rhombomeer 4. Controleer op een succesvolle injectie, die wordt bereikt wanneer de blauwe plasmide-oplossing snel door de neurale buis diffundeert zonder te lekken.Wanneer er lekkage optreedt, vervaagt het blauw snel. Plaats onmiddellijk na de injectie een platina bipolaire elektrode aan weerszijden van de neurale buis. Lever twee pulsen van 12 volt en 50 milliseconden met een elektroporator.Observeer luchtbellen aan de uiteinden van de bipolaire elektrode, met meer aan de negatieve kant. Controleer op succesvolle elektroporatie, die wordt bereikt wanneer het getinte plasmidemengsel het neurale buisweefsel in de buurt van de positieve kant van de elektrode binnendringt. Verwijder na elektroporatie voorzichtig de bipolaire elektrode.Bedek het venster op de eierschaal met een stuk transparante film voorgesneden tot vierkanten van twee inch en besproeid met 75% ethanol. Leg het ei terug in de broedmachine. Reinig de bipolaire elektrode door 10 tot 20 pulsen van 12 volt en 50 milliseconden in zoutoplossing af te geven voordat u doorgaat naar het volgende ei.Plaats het ei onder de microscoop zo dat het embryo verticaal is met de staart bij u in de buurt. Houd de capillaire pipet vast en prik de rechterotocyst voorzichtig in dorsolaterale richting. Injecteer het plasmidemengsel met luchtdruk totdat de otocyst is gevuld met een blauwe oplossing.Controleer op een succesvolle injectie, die wordt bereikt wanneer het blauwe plasmidemengsel zich in de otocyste bevindt en niet lekt. Plaats onmiddellijk na de injectie de bipolaire elektrode op de otocyste en positioneer de positieve en negatieve zijden respectievelijk voor en achter de otocyste. Lever twee pulsen van 12 volt en 50 milliseconden met de elektroporator.Controleer op succesvolle elektroporatie, die wordt bereikt wanneer het blauwe plasmidemengsel het weefsel van de otocyste in de buurt van de positieve kant van de elektrode binnendringt. Verwijder na elektroporatie voorzichtig de bipolaire elektrode en bedek het venster op de eierschaal met een transparante film. Breng ten slotte het ei terug naar de couveuse.De representatieve afbeelding toont een voorbeeld van embryonale dag drie, of E3, na neurobuistransfectie en doxbehandeling op embryonale dag twee, of E2. Getransfecteerde cellen met Fmr1 shRNA en EGFP op de doorsnede worden hier weergegeven. EGFP-expresserende cellen waren beperkt tot één kant van de neurale buis en de hersenstam. Een doorsnede bij E15 met EGFP-expressing nucleus magnocellularis, of NM neuronen, aan de getransfecteerde kant wordt hier getoond.Aan de contralaterale kant werden EGFP-bevattende axonen gezien in het ventrale deel van de nucleus laminaris, of NL. Het knockdown-effect van Fmr1 shRNA werd gevalideerd door duidelijke reducties in FMRP-immunoreactiviteit in getransfecteerde NM-neuronen in vergelijking met naburige niet-getransfecteerde neuronen. Het auditieve ganglion op E19 met FMRP-immunoreactiviteit wordt hier weergegeven. Auditieve ganglionneuronen waren niet getransfecteerd.Sommige gliacellen afgeleid van de craniale neurale crest cellen werden getransfecteerd. De representatieve beelden tonen FMRP knock-down in het gehoorkanaal na otocyste transfectie. Auditieve kanalen op E9 vertoonden uitgebreide EGFP-fluorescentie.Op dwarsdoorsnedes bevonden zich EGFP-expressiecellen in de basilaire papilla en het auditieve ganglion. Het knockdown-effect van Fmr1 shRNA werd gevalideerd door verminderde FMRP-immunoreactiviteit in getransfecteerde haarcellen in vergelijking met naburige niet-getransfecteerde haarcellen. Evenzo was FMRP-immunoreactiviteit grotendeels verminderd in getransfecteerde auditieve ganglionneuronen.De centrale projectie van de getransfecteerde auditieve ganglionneuronen werd via de gehoorzenuw met gekarakteriseerde eindbulbterminals naar de hersenstam gevolgd. Tijdens het proberen van deze procedure is het belangrijkste om de plaats en richting van elektroporatie voor selectieve transfectie te regelen. Na deze procedure kan single cell type filling, immunostaining, cell sorting gevolgd door mass spectrum of single-cell sequencing worden uitgevoerd om de veranderingen op morfologische en biochemische niveaus te onthullen.Deze techniek maakt ook selectieve bewerking van andere genen mogelijk met temporele controle en componentspecificiteit in het gehoor voor stamcircuits en kan worden aangepast om het vestibulaire systeem te manipuleren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Elektroporatie gevolgd door primaire neuronale Cultuur voor het bestuderen van Gene Functie in subset van de corticale neuronen

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

TMS: Met behulp van de Theta-Burst protocol bij Mechasnism van plasticiteit Ontdek bij mensen met fragiele X syndroom en autisme

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfectie van Mouse retinale ganglioncellen door In vivo Elektroporatie

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Elektroporatie in Chick middenhersenen voor het bestuderen van gen-functie in dopaminerge Neuron Ontwikkeling

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

In ovo Elektroporatie van miRNA gebaseerde Plasmiden in de ontwikkelingslanden neurale buis en Beoordeling van de fenotypes van Dil Injectie in de Open-boek Voorbereidingen

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Onderzoeken op Wijzigingen van de hippocampus Circuit Functie Na mild traumatisch hersenletsel

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expressie van MicroRNA in ventrale Chick Middenhersenen

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

Een lichtgewicht, hoofdtelefoon-gebaseerd systeem voor het manipuleren van auditieve feedback in Zangvogels

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Detectie van eiwit palmitoylering in gekweekte hippocampale neuronen door immunoprecipitatie en Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

Registratie en analyse van circadiane ritmen bij Running-wheel activiteit in knaagdieren

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...