Name: dissecting cell-autonomous function of fragile x mental retardation protein in an auditory circuit by in ovo electroporation
Uploaded: 2022-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation at JoVE.com

Cette étude a été financée par: une subvention de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 32000697); le Programme de science et de technologie de Guangzhou (202102080139); la Fondation des sciences naturelles du Guangdong (2019A1515110625, 2021A1515010619); les Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (11620324); a Research Grant of Key Laboratory of Regenerative Medicine, Ministère de l’éducation, Université de Jinan (No. ZSYXM202107); les Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales de Chine (21621054); et la Fondation pour la recherche scientifique médicale de la province chinoise du Guangdong (20191118142729581). Nous remercions le centre expérimental médical de l’Université de Jinan. Nous remercions le Dr Terra Bradley pour la révision minutieuse du manuscrit.

Les œufs et les embryons de poulet ont été manipulés avec soin et respect conformément aux protocoles sur les animaux approuvés par le Comité de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Jinan.
1. Préparation d’oeufs et de plasmides
<ol><li>Préparation des œufs<ol><li>Procurez-vous des œufs de poule frais fécondés (Gallus gallus) de l’Université agricole de Chine méridionale et conservez-les à 16 °C avant l’incubation. Pour une...

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	<li>Hagerman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+syndrome.">Fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).</li><li>Hinds, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+expression+of+FMR-1+provides+evidence+for+a+functional+role+in+fragile+X+syndrome.">Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome.</a> Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).</li><li>Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome+FMRP+co-localizes+with+regulatory+targets+PSD-95,+GABA+receptors,+CaMKIIalpha,+and+mGluR5+at+fiber+cell+membranes+in+the+eye+lens.">Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens.</a> Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).</li><li>Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+distribution+of+the+fragile+X+mental+retardation+protein+in+the+mouse+brain.">Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).</li><li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism.">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li><li>Bakker, C. E., Oostra, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+fragile+X+syndrome:+insights+from+animal+models.">Understanding fragile X syndrome: insights from animal models.</a> Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).</li><li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li><li>Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+presynaptic+short-term+plasticity+and+information+processing+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).</li><li>Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+target+cell-specific+role+for+presynaptic+Fmr1+in+regulating+glutamate+release+onto+neocortical+fast-spiking+inhibitory+neurons.">A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).</li><li>Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+FMRP+promotes+the+pruning+of+cell-to-cell+connections+among+pyramidal+neurons+in+the+L5A+neocortical+network.">Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network.</a> Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).</li><li>Higashimori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+deletion+of+astroglial+FMRP+dysregulates+glutamate+transporter+GLT1+and+contributes+to+Fragile+X+syndrome+phenotypes+in+vivo.">Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).</li><li>Hodges, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+contributions+to+synaptic+and+learning+abnormalities+in+a+mouse+model+of+Fragile+X+syndrome.">Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome.</a> Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).</li><li>Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Audiogenic+seizures+in+the+Fmr1+knock-out+mouse+are+induced+by+Fmr1+deletion+in+subcortical,+VGlut2-expressing+excitatory+neurons+and+require+deletion+in+the+inferior+colliculus.">Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).</li><li>Bland, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+regulates+the+subcellular+distribution+of+cortical+dendritic+spine+density+in+a+non-cell-autonomous+manner.">FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner.</a> Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+induces+synapse+loss+through+acute+postsynaptic+translational+regulation.">Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+is+required+for+synapse+elimination+by+the+activity-dependent+transcription+factor+MEF2.">Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2.</a> Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).</li><li>Deng, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+regulates+neurotransmitter+release+and+synaptic+information+transmission+by+modulating+action+potential+duration+via+BK+channels.">FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels.</a> Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).</li><li>Yang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+molecular+locus+for+normalizing+dysregulated+GABA+release+from+interneurons+in+the+Fragile+X+brain.">Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain.</a> Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).</li><li>Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+studies+in+fragile+X+syndrome.">Developmental studies in fragile X syndrome.</a> Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).</li><li>Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+FMRP+regulates+synaptogenesis+in+vivo+in+the+developing+cochlear+nucleus.">Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-specific+roles+of+fragile+X+mental+retardation+protein+in+the+development+of+the+hindbrain+auditory+circuit.">Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit.</a> Development. 147 (21), (2020).</li><li>Rubel, E. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+system+development:+primary+auditory+neurons+and+their+targets.">Auditory system development: primary auditory neurons and their targets.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).</li><li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+auditory+brain-stem+nuclei+in+the+chick+hindbrain.">Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain.</a> Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).</li><li>Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+expression+of+Zic+genes+during+vertebrate+inner+ear+development.">Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development.</a> Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+the+chicken+auditory+brainstem.">In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).</li><li>Evsen, L., Doetzlhofer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+the+chicken+auditory+organ+by+in+ovo+micro-electroporation.">Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).</li><li>Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrkB+downregulation+is+required+for+dendrite+retraction+in+developing+neurons+of+chicken+nucleus+magnocellularis.">TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).</li><li>Wang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+environment+inhibits+cranial+neural+crest+survival+by+activating+excessive+autophagy+in+the+chick+embryo.">High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo.</a> Scientific Reports. 5, 18321 (2015).</li><li>Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+fragile+X+mental+retardation+protein+correlates+with+cellular+and+synaptic+properties+in+primary+auditory+neurons+following+afferent+deprivation.">Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet-1+expression+in+the+developing+chicken+inner+ear.">Islet-1 expression in the developing chicken inner ear.</a> Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).</li><li>Carr, C. E., Boudreau, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+auditory+nerve+fibers+in+the+barn+owl.">Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl.</a> Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).</li><li>Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochleovestibular+nerve+development+is+integrated+with+migratory+neural+crest+cells.">Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells.</a> Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).</li><li>Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+signaling+promotes+axon+segregation+in+the+developing+auditory+system.">EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system.</a> Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).</li><li>Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+neurogenesis+in+the+inner+ear+requires+inhibition+of+Sox2+transcription+by+neurogenin1+and+neurod1.">Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1.</a> Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).</li><li>Curnow, E., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+animal+models+for+understanding+FMRP+functions+and+FXS+pathology.">New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology.</a> Cells. 11 (10), 1628 (2022).</li></ol>

Pour déterminer la fonction autonome cellulaire de la FMRP, il est nécessaire de manipuler son expression dans des groupes cellulaires individuels ou des types de cellules. Étant donné que l’une des principales fonctions de la FMRP est de réguler la formation synaptique et la plasticité, la manipulation sélective de chaque composant synaptique d’un certain circuit est une condition préalable à une compréhension complète du mécanisme FMRP dans la communication synaptique. E...

Le syndrome de l’X fragile (FXS) est un trouble neurodéveloppemental caractérisé par une déficience intellectuelle, des anomalies sensorielles et des comportements autistiques. Dans la plupart des cas, le FXS est causé par une perte globale de la protéine de retard mental de l’X fragile (FMRP; codée par le gène Fmr1) à partir des premiers stades embryonnaires1. La FMRP est une protéine de liaison à l’ARN qui est normalement exprimée dans la plupart des neurones et des cellules gliales du cerveau, ainsi que dans les organes sensoriels 2,3,4. Dans le cerveau des mammifères, le FMRP est probablement associé à des centaines d’ARNm qui codent des protéines importantes pour diverses activités neuronales5. Des études sur des animaux knockout Fmr1 conventionnels ont démontré que l’expression de la FMRP est particulièrement importante pour l’assemblage et la plasticité de la neurotransmission synaptique6. Plusieurs modèles d’élimination conditionnelle et mosaïque ont en outre démontré que les actions et les signaux FMRP varient selon les régions du cerveau, les types de cellules et les sites synaptiques au cours de plusieurs événements de développement, y compris la projection axonale, la structuration dendritique et la plasticité synaptique 7,8,9,10,11,12,13,14 . La fonction aiguë de la FMRP dans la régulation de la transmission synaptique a été étudiée par administration intracellulaire d’anticorps inhibiteurs de la FMRP ou de la FMRP elle-même dans des tranches de cerveau ou des neurones en culture 15,16,17,18. Ces méthodes, cependant, n’offrent pas la possibilité de suivre les conséquences induites par la mauvaise expression du FMRP pendant le développement. Ainsi, le développement de méthodes in vivo pour étudier les fonctions autonomes cellulaires de la FMRP est très nécessaire et devrait aider à déterminer si les anomalies signalées chez les patients FXS sont des conséquences directes de la perte de FMRP dans les neurones et les circuits associés, ou des conséquences secondaires dérivées de changements à l’échelle du réseau au cours du développement19.
Le tronc cérébral auditif des embryons de poulet offre un modèle particulièrement avantageux pour des analyses fonctionnelles approfondies de la régulation FMRP dans le développement des circuits et des synapses. L’accès facile aux cerveaux de poulet embryonnaires et la technique d’électroporation in ovo bien établie pour la manipulation génétique ont grandement contribué à notre compréhension du développement du cerveau aux stades embryonnaires précoces. Dans une étude récemment publiée, cette technique a été combinée avec des outils moléculaires avancés qui permettent le contrôle temporel de la mauvaise expression du FMRP20,21. Ici, la méthodologie est avancée pour induire des manipulations sélectives des neurones présynaptiques et postsynaptiques séparément. Cette méthode a été développée dans le circuit auditif du tronc cérébral. Le signal acoustique est détecté par les cellules ciliées de l’oreille interne auditive, puis transmis au ganglion auditif (AG; également appelé ganglion en spirale chez les mammifères). Les neurones bipolaires de l’AG innervent les cellules ciliées avec leurs processus périphériques et envoient à leur tour une projection centrale (le nerf auditif) au tronc cérébral où ils se terminent par deux noyaux cochléaires primaires, le noyau magnocellulaire (NM) et le noyau angularis (NA). Les neurones de la NM sont structurellement et fonctionnellement comparables aux cellules sphériques touffues du noyau cochléaire antéroventral des mammifères. Dans le NM, les fibres nerveuses auditives (ANF) synapsent sur le somata des neurones NM via le grand bulbe terminal des terminaux Held22. Au cours du développement, les neurones NM proviennent des rhombomères 5 et 6 (r5/6) dans le cerveau postérieur23, tandis que les neurones AG sont dérivés de neuroblastes résidant dans l’otocyste24. Ici, nous décrivons la procédure pour renverser sélectivement l’expression FMRP dans les neurones AG présynaptiques et dans les neurones NM postsynaptiques séparément.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Egg incubation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 &#176;C refrigerator</td>
			<td>MAGAT</td>
			<td></td>
			<td>Used for fertilized egg storage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>SHANGHAI BOXUN</td>
			<td>GZX-9240MBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized eggs</td>
			<td>Farm of South China Agricultural University</td>
			<td></td>
			<td>Eggs must be used in one week for optimal viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1661</td>
			<td>Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi-prep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td>Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Make 7.5M working solution in nuclase-free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation and Doxycycline Administration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>ECM399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL / 5 mL Syringe</td>
			<td>GUANGZHOU KANGFULAI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>CNOPTEC</td>
			<td>SZM-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxcycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td>Use fresh aliquots for each dose and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>BEIBOBOMEI</td>
			<td>RD0910</td>
			<td>0.9-1.1 mm*100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory parafilm</td>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>PM996</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>CHENGDU INSTRUMENT FACTORY</td>
			<td>WD-2</td>
			<td>Pulling condition: 500 &#176;C for 15 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum elctrodes</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum elctrodes</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Dissection and Fixation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td>Tip size: 0.05*0.01 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other surgery tools</td>
			<td>RWD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 &#176;C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW</td>
			<td>01673921</td>
			<td>For black background plates, food-grade carbon powder is applied.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9391</td>
			<td>From bovine skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding microtome</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SM2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150113</td>
			<td>1:500 dilution, RRID: AB_2576208</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150078</td>
			<td>1:500 dilution, RRID: AB_2722519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab285390</td>
			<td>1: 1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>Southern&#160;Biotech</td>
			<td>Sb-0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMRP antibody</td>
			<td>Y. Wang, Florida State University</td>
			<td>#8263</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_2861242</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.3F7</td>
			<td>1:100 dilution, RRID: AB_1157901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4142</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_477272</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parvalbumin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3088</td>
			<td>1:10000 dilution, RRID: AB_477329</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAP25 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab66066</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_2192052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe photoshop</td>
			<td>ADOBE</td>
			<td></td>
			<td>image editing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Image-Pro Plus 7.0</td>
			<td>OlYMPUS</td>
			<td></td>
			<td>commercial image processing software package</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting cell-autonomous function of fragile x mental retardation protein in an auditory circuit by in ovo electroporation

La protéine de retard mental de l’X fragile (FMRP) est une protéine de liaison à l’ARNm qui régule la traduction locale des protéines. La perte ou le dysfonctionnement de la FMRP entraîne des activités neuronales et synaptiques aberrantes dans le syndrome de l’X fragile (FXS), qui se caractérise par une déficience intellectuelle, des anomalies sensorielles et des problèmes de communication sociale. Les études de la fonction FMRP et de la pathogenèse FXS ont principalement été menées avec Fmr1 (le gène codant pour FMRP) knockout chez des animaux transgéniques. Nous rapportons ici une méthode in vivo pour déterminer la fonction autonome cellulaire de la FMRP pendant la période d’assemblage du circuit et de formation synaptique à l’aide d’embryons de poulet. Cette méthode utilise l’électroporation spécifique au stade, au site et à la direction d’un système vectoriel inductible par médicament contenant un petit ARN en épingle à cheveux Fmr1 (shRNA) et un rapporteur EGFP. Avec cette méthode, nous avons obtenu un knockdown FMRP sélectif dans le ganglion auditif (AG) et dans l’une de ses cibles du tronc cérébral, le noyau magnocellularis (NM), fournissant ainsi une manipulation spécifique au composant dans le circuit AG-NM. De plus, le motif en mosaïque de la transfection permet des contrôles intra-animaux et des comparaisons neurones/fibres voisines pour une fiabilité et une sensibilité accrues dans l’analyse des données. Le système de vecteurs inductibles fournit un contrôle temporel de l’apparition de l’édition de gènes afin de minimiser l’accumulation d’effets sur le développement. La combinaison de ces stratégies fournit un outil innovant pour disséquer la fonction autonome cellulaire de la FMRP dans le développement synaptique et de circuits.

En effectuant une électroporation in ovo à différents sites et à différents stades de développement, nous avons obtenu un knockdown FMRP sélectif soit dans la périphérie auditive, soit dans le tronc cérébral auditif.
FMRP knockdown en NM Un petit ARN en épingle à cheveux (shRNA) contre le poulet Fmr1 a été conçu et cloné dans le système vectoriel Tet-On comme décrit précédemment20. La configuration de l’élect...

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Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

En utilisant l’électroporation in ovo , nous avons conçu une méthode pour transfecter sélectivement l’oreille interne auditive et le noyau cochléaire dans des embryons de poulet afin d’obtenir une élimination spécifique du groupe cellulaire de la protéine de retard mental fragile X pendant des périodes discrètes d’assemblage du circuit.

Dissection de la fonction autonome cellulaire de la protéine de retard mental de l’X fragile dans un circuit auditif par électroporation in ovo

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to ...

Notre protocole est une méthode in vivo pour étudier les fonctions autonomes cellulaires de la FMRP pendant le développement. Cela peut aider à comprendre la physiopathologie spécifique au type cellulaire du syndrome de l’X fragile. Cette méthode utilise l’électroporation spécifique au stade, au site et à la direction d’un système vectoriel inductible par médicament contenant de l’ARN en épingle à cheveux Fmr1.Avec cette méthode, nous obtenons le knockdown FMRP sélectif dans le circuit auditif. Cette méthode peut également être appliquée pour étudier la fonction d’autres gènes dans le circuit auditif ou le système vestibulaire. Commencez par placer les œufs horizontalement pour positionner l’embryon sur le dessus de l’œuf pour faciliter la manipulation.Incuber à 38 degrés Celsius pendant 46 à 48 heures jusqu’à Hamburger et Hamilton, ou HH stade 12, pour la transfection du tube neural ou pendant 54 à 56 heures jusqu’à HH 13 pour la transfection d’otocystes. Retirez les œufs de l’incubateur, une douzaine d’œufs à la fois. Garder les œufs hors de leur incubateur pendant plus d’une heure introduit des variations de développement et réduit la viabilité.Utilisez une lampe de poche pour projeter la lumière du fond de l’œuf. L’emplacement de l’embryon apparaît comme une zone sombre sur la coquille de l’œuf. Marquez l’emplacement de l’embryon sur la coquille de l’œuf avec un crayon.Essuyez les œufs avec de la gaze contenant 75% d’éthanol et percez un trou dans l’extrémité pointue des œufs à l’aide de la pointe des ciseaux. Ensuite, retirez deux millilitres d’albumine avec une seringue à aiguille de calibre 18. Assurez-vous que le trou est juste assez grand pour permettre l’insertion de l’aiguille.Essuyez toute fuite d’albumine avec de la gaze et scellez le trou avec du ruban adhésif transparent. Couvrez le dessus des œufs avec du ruban adhésif transparent, en vous concentrant sur la zone sombre marquée au crayon pour minimiser les fissures et empêcher les débris de coquille de tomber pendant la fenêtrage. Essuyez tous les outils chirurgicaux avec de la gaze contenant 75% d’éthanol et essuyez la zone recouverte de ruban adhésif avec 75% d’éthanol.Utilisez une petite paire de ciseaux pour couper une fenêtre d’un à deux centimètres carrés autour de la circonférence de la marque de crayon. Tenez les ciseaux à plat pour éviter d’endommager l’embryon en dessous. Placez l’œuf fenêtré sous un stéréomicroscope avec un oculaire 10X et un zoom 2X.Remplissez une seringue d’un millilitre avec la solution d’encre, puis ajustez une aiguille de calibre 27. Pliez l’aiguille à un angle de 45 degrés avec une pince. Sous le microscope, piquez soigneusement le bord de la zone opaqua et insérez l’aiguille sous l’embryon.Injectez environ 50 microlitres d’encre, qui diffuseront sous la zone pellucide, pour la visualisation de l’embryon. L’encre formera un fond sombre pour la visualisation claire de l’embryon. Tirez les capillaires en verre dans les pipettes à l’aide d’un extracteur de pipettes.Sous un microscope à dissection, ouvrez soigneusement la pointe de l’aiguille capillaire à 10 à 20 micromètres de diamètre avec une pince. Conserver les pipettes dans une boîte de rangement jusqu’à utilisation. Ensuite, remplissez une pipette capillaire avec 0,5 à 1 microlitre du mélange plasmidique en appliquant une pression négative à travers un tube en caoutchouc à l’extrémité de la pipette avec une seringue.Placez l’œuf sous le microscope de sorte que l’embryon soit orienté verticalement avec la queue près de vous. Tenez la pipette capillaire d’une main ou avec le manipulateur à trois axes et enfoncez l’extrémité de la pipette jusqu’au rhombomère 5 à 6. dans une direction de queue à tête.Poussez doucement l’embout à travers la membrane vitelline et dans le tube neural dorsal, puis retirez un peu la pipette pour que l’embout soit dans la lumière du tube neural. Injecter le mélange plasmidique en appliquant une pression d’air jusqu’à ce que le plasmide teinté diffuse complètement dans le rhombomère 5 à 6 et s’étende dans le rhombomère 3 et le rhombomère 4. Vérifiez la réussite de l’injection, qui est obtenue lorsque la solution plasmidique bleue diffuse rapidement dans le tube neural sans fuite.En cas de fuite, le bleu s’estompe rapidement. Immédiatement après l’injection, placez une électrode bipolaire en platine de chaque côté du tube neural. Délivrez deux impulsions de 12 volts et une durée de 50 millisecondes avec un électroporateur.Observez les bulles d’air aux extrémités de l’électrode bipolaire, avec plus du côté négatif. Vérifiez que l’électroporation est réussie, ce qui est obtenu lorsque le mélange plasmidique teinté pénètre dans le tissu du tube neural près du côté positif de l’électrode. Après l’électroporation, retirez délicatement l’électrode bipolaire.Couvrir la fenêtre sur la coquille d’œuf avec un morceau de film transparent prédécoupé en carrés de deux pouces et pulvérisé avec de l’éthanol à 75%. Replacez l’œuf dans son incubateur. Nettoyez l’électrode bipolaire en délivrant 10 à 20 impulsions de 12 volts et une durée de 50 millisecondes dans une solution saline avant de passer à l’œuf suivant.Au microscope, placez l’œuf de manière à ce que l’embryon soit vertical avec la queue près de vous. Tenez la pipette capillaire et piquez doucement l’otocyste droit dans la direction dorsolatérale. Injecter le mélange plasmidique avec la pression de l’air jusqu’à ce que l’otocyste soit rempli de solution bleue.Vérifiez une injection réussie, qui est obtenue lorsque le mélange plasmidique bleu est confiné dans l’otocyste et ne fuit pas. Immédiatement après l’injection, placez l’électrode bipolaire sur l’otocyste et positionnez les côtés positif et négatif antérieur et postérieur à l’otocyste, respectivement. Délivrez deux impulsions de 12 volts et une durée de 50 millisecondes avec l’électroporateur.Vérifiez que l’électroporation est réussie, ce qui est obtenu lorsque le mélange plasmidique bleu pénètre dans le tissu de l’otocyste près du côté positif de l’électrode. Après l’électroporation, retirez soigneusement l’électrode bipolaire et couvrez la fenêtre de la coquille d’œuf avec un film transparent. Enfin, remettez l’œuf dans l’incubateur.L’image représentative montre un exemple de troisième jour embryonnaire, ou E3, après la transfection du tube neurologique et le traitement dox au deuxième jour embryonnaire, ou E2. Les cellules transfectées avec Fmr1 shRNA et EGFP sur la section transversale sont montrées ici. Les cellules exprimant l’EGFP ont été confinées à un côté du tube neural et du tronc cérébral. Une coupe efficace à E15 avec le noyau magnocellularis, ou neurones NM, exprimant l’EGFP, du côté transfecté est montrée ici.Du côté controlatéral, des axones contenant de l’EGFP ont été observés dans la partie ventrale du noyau laminaire, ou NL. L’effet knockdown de Fmr1 shRNA a été validé par des réductions marquées de l’immunoréactivité FMRP dans les neurones NM transfectés par rapport aux neurones voisins non transfectés. Le ganglion auditif à E19 avec immunoréactivité FMRP est montré ici. Les neurones ganglionnaires auditifs n’ont pas été transfectés.Certaines cellules gliales dérivées des cellules de la crête neurale crânienne ont été transfectées. Les images représentatives montrent le FMRP knockdown dans le conduit auditif après la transfection d’otocystes. Les conduits auditifs à E9 présentaient une fluorescence EGFP étendue.Sur les coupes transversales, les cellules exprimant l’EGFP étaient situées dans la papille basilaire et le ganglion auditif. L’effet knockdown de Fmr1 shRNA a été validé par une réduction de l’immunoréactivité FMRP dans les cellules ciliées transfectées par rapport aux cellules ciliées non transfectées voisines. De même, l’immunoréactivité de la FMRP a été largement diminuée dans les neurones ganglionnaires auditifs transfectés.La projection centrale des neurones ganglionnaires auditifs transfectés a été suivie jusqu’au tronc cérébral via le nerf auditif avec des terminaisons caractérisées. En essayant cette procédure, le plus important est de contrôler le site et la direction de l’électroporation pour la transfection sélective. Après cette procédure, le remplissage de type unicellulaire, l’immunomarquage, le tri cellulaire suivi d’un spectre de masse ou le séquençage unicellulaire peuvent être effectués pour révéler les changements aux niveaux morphologique et biochimique.Cette technique permet également l’édition sélective d’autres gènes avec contrôle temporel et spécificité des composants dans l’oreille auditive pour les circuits souches et peut être modifiée pour manipuler le système vestibulaire.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero électroporation suivie par la culture neuronale primaire pour étudier la fonction des gènes dans un sous-ensemble des neurones corticaux

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Recherche

Neurosciences

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

TMS: Utilisation du protocole Theta-Burst à explorer Mechasnism de la plasticité chez les individus atteints du syndrome du X fragile et autisme

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

La transfection des cellules ganglionnaires de la rétine de la souris par In vivo L&#39;électroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

En électroporation in ovo dans Mésencéphale Poussin pour étudier la fonction des gènes dans le développement neurone dopaminergique

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

En électroporation in ovo de miARN à base de plasmides dans le tube neural développement et l&#39;évaluation des phénotypes par injection dans Dil livre ouvert préparatifs

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Enquêtes sur les altérations de la fonction hippocampique Circuit suite de traumatisme craniocérébral léger

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Dans Expression in ovo de microARN dans ventrale Poussin mésencéphale

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

Un léger Casque-based System pour manipuler Rétroaction sonore chez les oiseaux chanteurs

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Détection de la palmitoylation des protéines dans les neurones de l&#39;hippocampe en culture par immunoprécipitation et Acyl-biotine Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

Enregistrement et analyse des rythmes circadiens dans la course roue-activité chez les rongeurs

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...