Name: dissecting cell-autonomous function of fragile x mental retardation protein in an auditory circuit by in ovo electroporation
Uploaded: 2022-07-06T15:00:00
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Diese Studie wurde unterstützt von: einem Stipendium der National Natural Science Foundation of China (Nr. 32000697); das Wissenschafts- und Technologieprogramm von Guangzhou (202102080139); die Guangdong Natural Science Foundation (2019A1515110625, 2021A1515010619); die Grundlagenforschungsfonds für die Zentraluniversitäten (11620324); ein Forschungsstipendium des Key Laboratory of Regenerative Medicine, Ministry of Education, Jinan University (No. ZSYXM202107); die Grundlagenforschungsfonds für die Zentraluniversitäten Chinas (21621054); und die Medical Scientific Research Foundation der chinesischen Provinz Guangdong (20191118142729581). Wir danken dem medizinischen Experimentalzentrum der Jinan Universität. Wir danken Dr. Terra Bradley für die sorgfältige Bearbeitung des Manuskripts.

Eier und Hühnerembryonen wurden mit Sorgfalt und Respekt in Übereinstimmung mit den Tierprotokollen behandelt, die vom Animal Care and Use Committee der Jinan University genehmigt wurden.
1. Ei- und Plasmidzubereitung
<ol><li>Ei-Zubereitung<ol><li>Frisch befruchtete Hühnereier (Gallus gallus) von der South China Agricultural University beziehen und vor der Inkubation bei 16 °C lagern. Um eine optimale Lebensfähigkeit zu erzielen, legen Sie alle Eier innerhalb e...

<ol>
	<li>Hagerman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+syndrome.">Fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).</li><li>Hinds, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+expression+of+FMR-1+provides+evidence+for+a+functional+role+in+fragile+X+syndrome.">Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome.</a> Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).</li><li>Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome+FMRP+co-localizes+with+regulatory+targets+PSD-95,+GABA+receptors,+CaMKIIalpha,+and+mGluR5+at+fiber+cell+membranes+in+the+eye+lens.">Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens.</a> Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).</li><li>Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+distribution+of+the+fragile+X+mental+retardation+protein+in+the+mouse+brain.">Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).</li><li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism.">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li><li>Bakker, C. E., Oostra, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+fragile+X+syndrome:+insights+from+animal+models.">Understanding fragile X syndrome: insights from animal models.</a> Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).</li><li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li><li>Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+presynaptic+short-term+plasticity+and+information+processing+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).</li><li>Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+FMRP+promotes+the+pruning+of+cell-to-cell+connections+among+pyramidal+neurons+in+the+L5A+neocortical+network.">Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network.</a> Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).</li><li>Higashimori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+deletion+of+astroglial+FMRP+dysregulates+glutamate+transporter+GLT1+and+contributes+to+Fragile+X+syndrome+phenotypes+in+vivo.">Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).</li><li>Hodges, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+contributions+to+synaptic+and+learning+abnormalities+in+a+mouse+model+of+Fragile+X+syndrome.">Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome.</a> Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).</li><li>Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Audiogenic+seizures+in+the+Fmr1+knock-out+mouse+are+induced+by+Fmr1+deletion+in+subcortical,+VGlut2-expressing+excitatory+neurons+and+require+deletion+in+the+inferior+colliculus.">Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).</li><li>Bland, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+regulates+the+subcellular+distribution+of+cortical+dendritic+spine+density+in+a+non-cell-autonomous+manner.">FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner.</a> Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+induces+synapse+loss+through+acute+postsynaptic+translational+regulation.">Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+is+required+for+synapse+elimination+by+the+activity-dependent+transcription+factor+MEF2.">Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2.</a> Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).</li><li>Deng, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+regulates+neurotransmitter+release+and+synaptic+information+transmission+by+modulating+action+potential+duration+via+BK+channels.">FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels.</a> Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).</li><li>Yang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+molecular+locus+for+normalizing+dysregulated+GABA+release+from+interneurons+in+the+Fragile+X+brain.">Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain.</a> Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).</li><li>Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+studies+in+fragile+X+syndrome.">Developmental studies in fragile X syndrome.</a> Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).</li><li>Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+FMRP+regulates+synaptogenesis+in+vivo+in+the+developing+cochlear+nucleus.">Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-specific+roles+of+fragile+X+mental+retardation+protein+in+the+development+of+the+hindbrain+auditory+circuit.">Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit.</a> Development. 147 (21), (2020).</li><li>Rubel, E. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+system+development:+primary+auditory+neurons+and+their+targets.">Auditory system development: primary auditory neurons and their targets.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).</li><li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+auditory+brain-stem+nuclei+in+the+chick+hindbrain.">Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain.</a> Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).</li><li>Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+expression+of+Zic+genes+during+vertebrate+inner+ear+development.">Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development.</a> Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+the+chicken+auditory+brainstem.">In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).</li><li>Evsen, L., Doetzlhofer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+the+chicken+auditory+organ+by+in+ovo+micro-electroporation.">Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).</li><li>Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrkB+downregulation+is+required+for+dendrite+retraction+in+developing+neurons+of+chicken+nucleus+magnocellularis.">TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).</li><li>Wang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+environment+inhibits+cranial+neural+crest+survival+by+activating+excessive+autophagy+in+the+chick+embryo.">High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo.</a> Scientific Reports. 5, 18321 (2015).</li><li>Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+fragile+X+mental+retardation+protein+correlates+with+cellular+and+synaptic+properties+in+primary+auditory+neurons+following+afferent+deprivation.">Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet-1+expression+in+the+developing+chicken+inner+ear.">Islet-1 expression in the developing chicken inner ear.</a> Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).</li><li>Carr, C. E., Boudreau, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+auditory+nerve+fibers+in+the+barn+owl.">Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl.</a> Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).</li><li>Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochleovestibular+nerve+development+is+integrated+with+migratory+neural+crest+cells.">Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells.</a> Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).</li><li>Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+signaling+promotes+axon+segregation+in+the+developing+auditory+system.">EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system.</a> Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).</li><li>Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+neurogenesis+in+the+inner+ear+requires+inhibition+of+Sox2+transcription+by+neurogenin1+and+neurod1.">Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1.</a> Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).</li><li>Curnow, E., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+animal+models+for+understanding+FMRP+functions+and+FXS+pathology.">New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology.</a> Cells. 11 (10), 1628 (2022).</li></ol>

Um die zellautonome Funktion von FMRP zu bestimmen, ist es notwendig, seine Expression in einzelnen Zellgruppen oder Zelltypen zu manipulieren. Da eine der Hauptfunktionen von FMRP darin besteht, die synaptische Bildung und Plastizität zu regulieren, ist die selektive Manipulation jeder synaptischen Komponente eines bestimmten Schaltkreises Voraussetzung für ein vollständiges Verständnis des FMRP-Mechanismus in der synaptischen Kommunikation. Unter Verwendung der Ovo-Elektro...

Das Fragile-X-Syndrom (FXS) ist eine neurologische Entwicklungsstörung, die durch geistige Behinderung, sensorische Anomalien und autistisches Verhalten gekennzeichnet ist. In den meisten Fällen wird FXS durch einen globalen Verlust des fragilen X-Mentalretardierungsproteins (FMRP; kodiert durch das Fmr1-Gen) ab frühen embryonalen Stadien1 verursacht. FMRP ist ein RNA-bindendes Protein, das normalerweise in den meisten Neuronen und Gliazellen im Gehirn sowie in Sinnesorganenexprimiert wird 2,3,4. In Säugetiergehirnen ist FMRP wahrscheinlich mit Hunderten von mRNAs assoziiert, die Proteine kodieren, die für verschiedene neuronale Aktivitäten wichtig sind5. Studien an konventionellen Fmr1-Knockout-Tieren zeigten, dass die FMRP-Expression besonders wichtig für den Aufbau und die Plastizität der synaptischen Neurotransmission ist6. Mehrere bedingte und mosaikartige Knockout-Modelle haben weiter gezeigt, dass FMRP-Aktionen und -Signale zwischen Gehirnregionen, Zelltypen und synaptischen Stellen während mehrerer Entwicklungsereignisse variieren, einschließlich axonaler Projektion, dendritischer Musterung und synaptischer Plastizität 7,8,9,10,11,12,13,14 . Die akute Funktion von FMRP bei der Regulierung der synaptischen Übertragung wurde durch intrazelluläre Verabreichung von inhibitorischen FMRP-Antikörpern oder FMRP selbst in Gehirnschnitten oder kultivierten Neuronen untersucht15,16,17,18. Diese Methoden bieten jedoch nicht die Möglichkeit, FMRP-Fehlausdrucksfolgen während der Entwicklung zu verfolgen. Daher ist die Entwicklung von In-vivo-Methoden zur Untersuchung der zellautonomen Funktionen von FMRP von großem Bedarf und soll dazu beitragen, festzustellen, ob die berichteten Anomalien bei FXS-Patienten direkte Folgen des FMRP-Verlusts in den zugehörigen Neuronen und Schaltkreisen oder sekundäre Konsequenzen sind, die sich aus netzwerkweiten Veränderungen während der Entwicklung ergeben19.
Der auditorische Hirnstamm von Hühnerembryonen bietet ein einzigartig vorteilhaftes Modell für eingehende funktionelle Analysen der FMRP-Regulation in der Schaltkreis- und Synapsenentwicklung. Der einfache Zugang zu embryonalen Hühnergehirnen und die etablierte Elektroporationstechnik zur genetischen Manipulation haben wesentlich zu unserem Verständnis der Gehirnentwicklung in frühen embryonalen Stadien beigetragen. In einer kürzlich veröffentlichten Studie wurde diese Technik mit fortschrittlichen molekularen Werkzeugen kombiniert, die eine zeitliche Kontrolle der FMRP-Fehlexpression ermöglichen20,21. Hier wird die Methodik weiterentwickelt, um selektive Manipulationen von präsynaptischen und postsynaptischen Neuronen getrennt voneinander zu induzieren. Diese Methode wurde im auditorischen Hirnstammkreislauf entwickelt. Das akustische Signal wird von Haarzellen im auditorischen Innenohr detektiert und dann an das Hörganglion (AG; bei Säugetieren auch Spiralganglion genannt) weitergeleitet. Bipolare Neuronen in der AG innervieren Haarzellen mit ihren peripheren Fortsätzen und senden wiederum eine zentrale Projektion (den Hörnerv) zum Hirnstamm, wo sie in zwei primären Cochlea-Kernen, dem Nucleus magnocellularis (NM) und dem Nucleus angularis (NA), enden. Neuronen in der NM sind strukturell und funktionell vergleichbar mit den kugelförmigen buschigen Zellen des anteroventralen Cochlea-Kerns von Säugetieren. Innerhalb der NM synapsieren Hörnervenfasern (ANFs) auf den Somata von NM-Neuronen über den großen Endbulb der Held-Terminals22. Während der Entwicklung entstehen NM-Neuronen aus den Rhombomeren 5 und 6 (r5/6) im Hinterhirn23, während AG-Neuronen von Neuroblasten abgeleitet werden, die sich in der Otozyste24 befinden. Hier beschreiben wir das Verfahren zur selektiven Knockdown-FMRP-Expression in den präsynaptischen AG-Neuronen und in den postsynaptischen NM-Neuronen getrennt.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Egg incubation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 &#176;C refrigerator</td>
			<td>MAGAT</td>
			<td></td>
			<td>Used for fertilized egg storage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>SHANGHAI BOXUN</td>
			<td>GZX-9240MBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized eggs</td>
			<td>Farm of South China Agricultural University</td>
			<td></td>
			<td>Eggs must be used in one week for optimal viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1661</td>
			<td>Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi-prep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td>Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Make 7.5M working solution in nuclase-free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation and Doxycycline Administration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>ECM399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL / 5 mL Syringe</td>
			<td>GUANGZHOU KANGFULAI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>CNOPTEC</td>
			<td>SZM-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxcycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td>Use fresh aliquots for each dose and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>BEIBOBOMEI</td>
			<td>RD0910</td>
			<td>0.9-1.1 mm*100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory parafilm</td>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>PM996</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>CHENGDU INSTRUMENT FACTORY</td>
			<td>WD-2</td>
			<td>Pulling condition: 500 &#176;C for 15 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum elctrodes</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum elctrodes</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Dissection and Fixation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td>Tip size: 0.05*0.01 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other surgery tools</td>
			<td>RWD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 &#176;C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW</td>
			<td>01673921</td>
			<td>For black background plates, food-grade carbon powder is applied.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9391</td>
			<td>From bovine skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding microtome</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SM2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150113</td>
			<td>1:500 dilution, RRID: AB_2576208</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150078</td>
			<td>1:500 dilution, RRID: AB_2722519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab285390</td>
			<td>1: 1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>Southern&#160;Biotech</td>
			<td>Sb-0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMRP antibody</td>
			<td>Y. Wang, Florida State University</td>
			<td>#8263</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_2861242</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.3F7</td>
			<td>1:100 dilution, RRID: AB_1157901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4142</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_477272</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parvalbumin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3088</td>
			<td>1:10000 dilution, RRID: AB_477329</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAP25 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab66066</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_2192052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe photoshop</td>
			<td>ADOBE</td>
			<td></td>
			<td>image editing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Image-Pro Plus 7.0</td>
			<td>OlYMPUS</td>
			<td></td>
			<td>commercial image processing software package</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting cell-autonomous function of fragile x mental retardation protein in an auditory circuit by in ovo electroporation

Fragile X mental retardation protein (FMRP) ist ein mRNA-bindendes Protein, das die lokale Proteintranslation reguliert. FMRP-Verlust oder -Dysfunktion führt zu aberranten neuronalen und synaptischen Aktivitäten beim fragilen X-Syndrom (FXS), das durch geistige Behinderung, sensorische Anomalien und soziale Kommunikationsprobleme gekennzeichnet ist. Studien zur FMRP-Funktion und FXS-Pathogenese wurden hauptsächlich mit Fmr1-Knockout (das Gen, das FMRP kodiert) bei transgenen Tieren durchgeführt. Hier berichten wir über eine in vivo Methode zur Bestimmung der zellautonomen Funktion von FMRP während der Zeit des Schaltkreisaufbaus und der synaptischen Bildung mit Hühnerembryonen. Diese Methode verwendet die phasen-, orts- und richtungsspezifische Elektroporation eines medikamenteninduzierbaren Vektorsystems, das Fmr1-kleine Haarnadel-RNA (shRNA) und einen EGFP-Reporter enthält. Mit dieser Methode erreichten wir einen selektiven FMRP-Knockdown im auditorischen Ganglion (AG) und in einem seiner Hirnstammziele, dem Nucleus magnocellularis (NM), wodurch eine komponentenspezifische Manipulation innerhalb des AG-NM-Schaltkreises ermöglicht wurde. Darüber hinaus ermöglicht das Mosaikmuster der Transfektion Kontrollen innerhalb des Tieres und benachbarte Neuron/Faser-Vergleiche für eine erhöhte Zuverlässigkeit und Empfindlichkeit bei der Datenanalyse. Das induzierbare Vektorsystem bietet eine zeitliche Kontrolle des Beginns der Genbearbeitung, um akkumulierende Entwicklungseffekte zu minimieren. Die Kombination dieser Strategien bietet ein innovatives Werkzeug, um die zellautonome Funktion von FMRP in der synaptischen und Schaltungsentwicklung zu analysieren.

Durch die Durchführung der Ovo-Elektroporation an verschiedenen Stellen und in verschiedenen Entwicklungsstadien erreichten wir einen selektiven FMRP-Knockdown entweder in der auditiven Peripherie oder im auditorischen Hirnstamm.
FMRP-Knockdown in NM Kleine Haarnadel-RNA (shRNA) gegen das Huhn Fmr1 wurde entworfen und in das Tet-On-Vektorsystem kloniert, wie zuvor beschrieben20. Der Aufbau für die In-Ovo-Elektroporation ...

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Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Mit Hilfe der In-Ovo-Elektroporation entwickelten wir eine Methode, um das auditorische Innenohr und den Cochlea-Kern in Hühnerembryonen selektiv zu transfizieren, um einen zellgruppenspezifischen Knockdown des fragilen X-Mentalretardationsproteins während diskreter Perioden des Schaltkreisaufbaus zu erreichen.

Sezieren der zellautonomen Funktion des fragilen X-mentalen Retardierungsproteins in einem auditorischen Schaltkreis durch In-Ovo-Elektroporation

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to ...

Unser Protokoll ist eine in vivo Methode, um die zellautonomen Funktionen von FMRP während der Entwicklung zu untersuchen. Dies kann helfen, die zelltypspezifische Pathophysiologie des Fragile-X-Syndroms zu verstehen. Diese Methode verwendet die stufen-, orts- und richtungsspezifische Elektroporation eines medikamenteninduzierbaren Vektorsystems, das Fmr1-RNA mit kleinen Haarnadeln enthält.Mit dieser Methode erreichen wir den selektiven FMRP-Knockdown im Hörkreislauf. Diese Methode kann auch angewendet werden, um die Funktion anderer Gene im Hörkreislauf oder im vestibulären System zu untersuchen. Beginnen Sie, indem Sie die Eier horizontal platzieren, um den Embryo zur einfachen Manipulation auf der Oberseite des Eies zu positionieren.Inkubieren bei 38 Grad Celsius für 46 bis 48 Stunden bis Hamburger und Hamilton, oder HH Stadium 12, für Neuralrohrtransfektion oder für 54 bis 56 Stunden bis HH 13 für Otozystentransfektion. Entfernen Sie die Eier aus dem Inkubator, jeweils ein Dutzend Eier. Eier länger als eine Stunde aus ihrem Inkubator zu halten, führt zu Entwicklungsschwankungen und verringert die Lebensfähigkeit.Verwenden Sie eine Taschenlampe, um Licht von der Unterseite des Eies zu werfen. Die Lage des Embryos erscheint als dunkler Bereich auf der Eierschale. Markieren Sie die Position des Embryos auf der Eierschale mit einem Bleistift.Wischen Sie die Eier mit Gaze ab, die 75% Ethanol enthält, und bohren Sie mit der Scherenspitze ein Loch in das spitze Ende der Eier. Entfernen Sie dann zwei Milliliter Albumin mit einer 18-Gauge-Nadelspritze. Stellen Sie sicher, dass das Loch nur groß genug ist, um das Einführen der Nadel zu ermöglichen.Wischen Sie auslaufendes Albumin mit Gaze ab und verschließen Sie das Loch mit durchsichtigem Klebeband. Bedecken Sie die Oberseite der Eier mit durchsichtigem Klebeband und zentrieren Sie sich auf den bleistiftmarkierten dunklen Bereich, um Risse zu minimieren und herabfallende Schalenablagerungen während des Fensters zu verhindern. Wischen Sie alle chirurgischen Werkzeuge mit Gaze ab, die 75% Ethanol enthält, und wischen Sie den mit Klebeband bedeckten Bereich mit 75% Ethanol ab.Verwenden Sie eine kleine Schere, um ein bis zwei Quadratzentimeter großes Fenster um den Umfang der Bleistiftmarkierung zu schneiden. Halten Sie die Schere flach, um den darunter liegenden Embryo nicht zu beschädigen. Legen Sie das Fensterei unter ein Stereomikroskop mit einem 10-fachen Okular und einem 2-fachen Zoom.Füllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit der Tintenlösung und passen Sie dann eine 27-Gauge-Nadel an. Biegen Sie die Nadel mit einer Pinzette in einen Winkel von 45 Grad. Unter dem Mikroskop vorsichtig vom Rand des Opaqua-Bereichs stechen und die Nadel unter den Embryo einführen.Injizieren Sie etwa 50 Mikroliter Tinte, die unterhalb des Bereichs pellucida diffundiert, um den Embryo sichtbar zu machen. Die Tinte bildet einen dunklen Hintergrund für die klare Visualisierung des Embryos. Glaskapillaren mit einem Pipettenzieher in Pipetten ziehen.Öffnen Sie unter einem Seziermikroskop vorsichtig die Spitze der Kapillarnadel mit einer Pinzette auf 10 bis 20 Mikrometer Durchmesser. Bewahren Sie die Pipetten bis zur Verwendung in einer Aufbewahrungsbox auf. Als nächstes füllen Sie eine Kapillarpipette mit 0,5 bis 1 Mikroliter der Plasmidmischung, indem Sie Unterdruck durch einen Gummischlauch am Ende der Pipette mit einer Spritze anlegen.Legen Sie das Ei unter das Mikroskop, so dass der Embryo vertikal ausgerichtet ist und der Schwanz in Ihrer Nähe ist. Halten Sie die Kapillarpipette mit einer Hand oder mit dem dreiachsigen Manipulator und fahren Sie die Spitze der Pipette zur Raute 5 bis 6. in Tail-to-Head-Richtung.Stecken Sie die Spitze vorsichtig durch die Vitellamembran und in das dorsale Neuralrohr und ziehen Sie dann die Pipette ein wenig zurück, so dass sich die Spitze im Lumen des Neuralrohrs befindet. Das Plasmidgemisch wird durch Anlegen von Luftdruck injiziert, bis das getönte Plasmid vollständig in Rhombomer 5 bis 6 diffundiert und sich in Rhombomer 3 und Rhombomer 4 erstreckt. Überprüfen Sie die erfolgreiche Injektion, die erreicht wird, wenn die blaue Plasmidlösung schnell durch das Neuralrohr diffundiert, ohne zu lecken.Wenn es zu Undichtigkeiten kommt, verblasst das Blau schnell. Unmittelbar nach der Injektion platzieren Sie eine Platin-Bipolarelektrode auf beiden Seiten des Neuralrohrs. Liefern Sie zwei Impulse von 12 Volt und 50 Millisekunden Dauer mit einem Elektroporator.Beobachten Sie Luftblasen an den Enden der bipolaren Elektrode, mit mehr auf der negativen Seite. Überprüfen Sie die erfolgreiche Elektroporation, die erreicht wird, wenn die getönte Plasmidmischung in das Neuralrohrgewebe in der Nähe der positiven Seite der Elektrode gelangt. Entfernen Sie nach der Elektroporation vorsichtig die bipolare Elektrode.Decken Sie das Fenster auf der Eierschale mit einem Stück transparenter Folie ab, die auf zwei Zoll große Quadrate vorgeschnitten und mit 75% Ethanol besprüht wurde. Legen Sie das Ei zurück in den Inkubator. Reinigen Sie die bipolare Elektrode, indem Sie 10 bis 20 Impulse mit 12 Volt und einer Dauer von 50 Millisekunden in Kochsalzlösung abgeben, bevor Sie zum nächsten Ei übergehen.Legen Sie das Ei unter dem Mikroskop so, dass der Embryo vertikal mit dem Schwanz in Ihrer Nähe ist. Halten Sie die Kapillarpipette und stoßen Sie die rechte Otozyste vorsichtig in dorsolaterale Richtung. Injizieren Sie die Plasmidmischung mit Luftdruck, bis die Otozyste mit blauer Lösung gefüllt ist.Überprüfen Sie eine erfolgreiche Injektion, die erreicht wird, wenn die blaue Plasmidmischung in der Otozyste eingeschlossen ist und nicht austritt. Setzen Sie unmittelbar nach der Injektion die bipolare Elektrode auf die Otozyste und positionieren Sie die positive und negative Seite vor bzw. hinter der Otozyste. Liefern Sie zwei Impulse von 12 Volt und 50 Millisekunden Dauer mit dem Elektroporator.Überprüfen Sie die erfolgreiche Elektroporation, die erreicht wird, wenn die blaue Plasmidmischung in das Gewebe der Otozyste in der Nähe der positiven Seite der Elektrode eindringt. Entfernen Sie nach der Elektroporation vorsichtig die bipolare Elektrode und bedecken Sie das Fenster auf der Eierschale mit einer transparenten Folie. Zum Schluss bringen Sie das Ei in den Inkubator zurück.Das repräsentative Bild zeigt ein Beispiel für den embryonalen dritten Tag oder E3 nach Neurotubentransfektion und Doxbehandlung am zweiten embryonalen Tag oder E2. Transfizierte Zellen mit Fmr1 shRNA und EGFP im Querschnitt sind hier dargestellt. EGFP-exprimierende Zellen waren auf eine Seite des Neuralrohrs und des Hirnstamms beschränkt. Ein Querschnitt bei E15 mit EGFP-exprimierenden Nucleus magnocellularis, oder NM-Neuronen, auf der transfizierten Seite ist hier gezeigt.Auf der kontralateralen Seite wurden EGFP-haltige Axone im ventralen Teil des Nucleus laminaris oder NL beobachtet. Der Knockdown-Effekt der Fmr1-shRNA wurde durch eine deutliche Verringerung der FMRP-Immunreaktivität in transfizierten NM-Neuronen im Vergleich zu benachbarten nicht transfizierten Neuronen validiert. Das Gehörganglion an E19 mit FMRP-Immunreaktivität ist hier dargestellt. Auditorische Ganglienneuronen wurden nicht transfiziert.Einige Gliazellen, die von den kranialen Neuralleistenzellen abgeleitet wurden, wurden transfiziert. Die repräsentativen Bilder zeigen FMRP-Knock-down im Gehörgang nach Otozystentransfektion. Gehörgänge an E9 wiesen eine umfangreiche EGFP-Fluoreszenz auf.Auf Querschnitten befanden sich EGFP-exprimierende Zellen in der Basilarpapille und dem Gehörganglion. Der Knockdown-Effekt von Fmr1 shRNA wurde durch reduzierte FMRP-Immunreaktivität in transfizierten Haarzellen im Vergleich zu benachbarten nicht transfizierten Haarzellen validiert. In ähnlicher Weise war die FMRP-Immunreaktivität in transfizierten auditorischen Ganglienneuronen weitgehend verringert.Die zentrale Projektion der transfizierten auditorischen Ganglienneuronen wurde über den Hörnerv mit charakterisierten Endbulb-Terminals zum Hirnstamm verfolgt. Bei diesem Verfahren ist es am wichtigsten, den Ort und die Richtung der Elektroporation für die selektive Transfektion zu kontrollieren. Nach diesem Verfahren kann Einzelzellfüllung, Immunfärbung, Zellsortierung gefolgt von Massenspektrum oder Einzelzellsequenzierung durchgeführt werden, um die Veränderungen auf morphologischer und biochemischer Ebene aufzudecken.Diese Technik ermöglicht auch die selektive Bearbeitung anderer Gene mit zeitlicher Kontrolle und Komponentenspezifität im Hörohr für Stammschaltkreise und kann modifiziert werden, um das vestibuläre System zu manipulieren.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Elektroporation gefolgt von primären neuronalen Kultur für ein Studium Gene Function in Subset von kortikalen Neuronen

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Forschung

Neurowissenschaften

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

TMS: Mit dem Theta-Burst-Protokoll zu Mechasnism der Plastizität in Individuen sich mit Fragile X-Syndrom und Autismus

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Elektroporation in Mittelhirn-Küken für Studien über Genfunktion in dopaminergen Neuronen Entwicklung

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

In ovo Elektroporation von miRNA-basierte Plasmide in der Entwicklung von Neuralrohr und Beurteilung der Phänotypen von DiI Injection in Open-book Vorbereitungen

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Untersuchungen über Veränderungen der hippokampalen Schaltung Funktion Nach Mild Traumatic Brain Injury

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression von microRNA in ventralen Mittelhirn-Küken

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

Ein Leichtes, Kopfhörer-basierte System zur Manipulation Auditory Feedback in Songbirds

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Detektion von Protein Palmitoylierung in kultivierten Hippocampus-Neuronen durch Immunopräzipitation und Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

Aufnahme und Analyse der zirkadianen Rhythmen in Laufen-Rad-Aktivität in Nagetiere

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...