Name: dissecting cell-autonomous function of fragile x mental retardation protein in an auditory circuit by in ovo electroporation
Uploaded: 2022-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto da: una sovvenzione della National Natural Science Foundation of China (n. 32000697); il Programma di Scienza e Tecnologia di Guangzhou (202102080139); la Fondazione per le scienze naturali del Guangdong (2019A1515110625, 2021A1515010619); i fondi per la ricerca fondamentale delle università centrali (11620324); una borsa di ricerca del Key Laboratory of Regenerative Medicine, Ministero della Pubblica Istruzione, Università di Jinan (No. ZSYXM202107); i fondi per la ricerca fondamentale per le università centrali della Cina (21621054); e la Medical Scientific Research Foundation della provincia cinese del Guangdong (20191118142729581). Ringraziamo il centro medico sperimentale dell'Università di Jinan. Ringraziamo la dottoressa Terra Bradley per l'attenta revisione del manoscritto.

Le uova e gli embrioni di pollo sono stati trattati con cura e rispetto in conformità con i protocolli animali approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Jinan.
1. Preparazione di uova e plasmidi
<ol><li>Preparazione delle uova<ol><li>Procurarsi uova di gallina fresche fecondate (Gallus gallus) dalla South China Agricultural University e conservare a 16 °C prima dell'incubazione. Per una vitalità ottimale, impostare tutte le uova...

<ol>
	<li>Hagerman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+syndrome.">Fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).</li><li>Hinds, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+expression+of+FMR-1+provides+evidence+for+a+functional+role+in+fragile+X+syndrome.">Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome.</a> Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).</li><li>Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome+FMRP+co-localizes+with+regulatory+targets+PSD-95,+GABA+receptors,+CaMKIIalpha,+and+mGluR5+at+fiber+cell+membranes+in+the+eye+lens.">Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens.</a> Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).</li><li>Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+distribution+of+the+fragile+X+mental+retardation+protein+in+the+mouse+brain.">Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).</li><li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism.">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li><li>Bakker, C. E., Oostra, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+fragile+X+syndrome:+insights+from+animal+models.">Understanding fragile X syndrome: insights from animal models.</a> Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).</li><li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li><li>Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+presynaptic+short-term+plasticity+and+information+processing+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).</li><li>Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+target+cell-specific+role+for+presynaptic+Fmr1+in+regulating+glutamate+release+onto+neocortical+fast-spiking+inhibitory+neurons.">A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).</li><li>Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+FMRP+promotes+the+pruning+of+cell-to-cell+connections+among+pyramidal+neurons+in+the+L5A+neocortical+network.">Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network.</a> Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).</li><li>Higashimori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+deletion+of+astroglial+FMRP+dysregulates+glutamate+transporter+GLT1+and+contributes+to+Fragile+X+syndrome+phenotypes+in+vivo.">Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).</li><li>Hodges, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+contributions+to+synaptic+and+learning+abnormalities+in+a+mouse+model+of+Fragile+X+syndrome.">Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome.</a> Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).</li><li>Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Audiogenic+seizures+in+the+Fmr1+knock-out+mouse+are+induced+by+Fmr1+deletion+in+subcortical,+VGlut2-expressing+excitatory+neurons+and+require+deletion+in+the+inferior+colliculus.">Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).</li><li>Bland, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+regulates+the+subcellular+distribution+of+cortical+dendritic+spine+density+in+a+non-cell-autonomous+manner.">FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner.</a> Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+induces+synapse+loss+through+acute+postsynaptic+translational+regulation.">Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+is+required+for+synapse+elimination+by+the+activity-dependent+transcription+factor+MEF2.">Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2.</a> Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).</li><li>Deng, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+regulates+neurotransmitter+release+and+synaptic+information+transmission+by+modulating+action+potential+duration+via+BK+channels.">FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels.</a> Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).</li><li>Yang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+molecular+locus+for+normalizing+dysregulated+GABA+release+from+interneurons+in+the+Fragile+X+brain.">Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain.</a> Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).</li><li>Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+studies+in+fragile+X+syndrome.">Developmental studies in fragile X syndrome.</a> Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).</li><li>Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+FMRP+regulates+synaptogenesis+in+vivo+in+the+developing+cochlear+nucleus.">Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-specific+roles+of+fragile+X+mental+retardation+protein+in+the+development+of+the+hindbrain+auditory+circuit.">Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit.</a> Development. 147 (21), (2020).</li><li>Rubel, E. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+system+development:+primary+auditory+neurons+and+their+targets.">Auditory system development: primary auditory neurons and their targets.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).</li><li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+auditory+brain-stem+nuclei+in+the+chick+hindbrain.">Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain.</a> Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).</li><li>Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+expression+of+Zic+genes+during+vertebrate+inner+ear+development.">Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development.</a> Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+the+chicken+auditory+brainstem.">In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).</li><li>Evsen, L., Doetzlhofer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+the+chicken+auditory+organ+by+in+ovo+micro-electroporation.">Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).</li><li>Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrkB+downregulation+is+required+for+dendrite+retraction+in+developing+neurons+of+chicken+nucleus+magnocellularis.">TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).</li><li>Wang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+environment+inhibits+cranial+neural+crest+survival+by+activating+excessive+autophagy+in+the+chick+embryo.">High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo.</a> Scientific Reports. 5, 18321 (2015).</li><li>Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+fragile+X+mental+retardation+protein+correlates+with+cellular+and+synaptic+properties+in+primary+auditory+neurons+following+afferent+deprivation.">Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet-1+expression+in+the+developing+chicken+inner+ear.">Islet-1 expression in the developing chicken inner ear.</a> Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).</li><li>Carr, C. E., Boudreau, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+auditory+nerve+fibers+in+the+barn+owl.">Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl.</a> Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).</li><li>Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochleovestibular+nerve+development+is+integrated+with+migratory+neural+crest+cells.">Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells.</a> Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).</li><li>Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+signaling+promotes+axon+segregation+in+the+developing+auditory+system.">EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system.</a> Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).</li><li>Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+neurogenesis+in+the+inner+ear+requires+inhibition+of+Sox2+transcription+by+neurogenin1+and+neurod1.">Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1.</a> Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).</li><li>Curnow, E., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+animal+models+for+understanding+FMRP+functions+and+FXS+pathology.">New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology.</a> Cells. 11 (10), 1628 (2022).</li></ol>

Per determinare la funzione autonoma della cellula di FMRP, è necessario manipolare la sua espressione in singoli gruppi cellulari o tipi di cellule. Poiché una delle principali funzioni di FMRP è quella di regolare la formazione sinaptica e la plasticità, manipolare selettivamente ogni componente sinaptica di un determinato circuito è un prerequisito per una piena comprensione del meccanismo FMRP nella comunicazione sinaptica. Utilizzando l'elettroporazione in ovo di embrio...

La sindrome dell'X fragile (FXS) è un disturbo dello sviluppo neurologico caratterizzato da disabilità intellettiva, anomalie sensoriali e comportamenti autistici. Nella maggior parte dei casi, la FXS è causata da una perdita globale della proteina di ritardo mentale dell'X fragile (FMRP; codificata dal gene Fmr1) a partire dalle prime fasi embrionali1. FMRP è una proteina legante l'RNA che è normalmente espressa nella maggior parte dei neuroni e delle cellule gliali nel cervello, così come negli organi sensoriali 2,3,4. Nel cervello dei mammiferi, FMRP è probabilmente associato a centinaia di mRNA che codificano proteine importanti per varie attività neurali5. Studi su animali knockout convenzionali Fmr1 hanno dimostrato che l'espressione di FMRP è particolarmente importante per l'assemblaggio e la plasticità della neurotrasmissione sinaptica6. Diversi modelli di knockout condizionale e a mosaico hanno ulteriormente dimostrato che le azioni e i segnali FMRP variano tra regioni del cervello, tipi di cellule e siti sinaptici durante diversi eventi di sviluppo tra cui proiezione assonale, pattern dendritico e plasticità sinaptica 7,8,9,10,11,12,13,14 . La funzione acuta di FMRP nella regolazione della trasmissione sinaptica è stata studiata mediante somministrazione intracellulare di anticorpi inibitori FMRP o FMRP stesso in fette di cervello o neuroni in coltura15,16,17,18. Questi metodi, tuttavia, non offrono la possibilità di tracciare le conseguenze indotte da espressioni errate di FMRP durante lo sviluppo. Pertanto, lo sviluppo di metodi in vivo per studiare le funzioni autonome cellulari di FMRP è in grande bisogno e dovrebbe aiutare a determinare se le anomalie riportate nei pazienti con FXS sono conseguenze dirette della perdita di FMRP nei neuroni e nei circuiti associati o conseguenze secondarie derivate da cambiamenti a livello di rete durante lo sviluppo19.
Il tronco cerebrale uditivo degli embrioni di pollo offre un modello straordinariamente vantaggioso per analisi funzionali approfondite della regolazione FMRP nello sviluppo di circuiti e sinapsi. Il facile accesso ai cervelli embrionali di pollo e la ben consolidata tecnica di elettroporazione ovo per la manipolazione genetica hanno contribuito notevolmente alla nostra comprensione dello sviluppo del cervello nelle prime fasi embrionali. In uno studio pubblicato di recente, questa tecnica è stata combinata con strumenti molecolari avanzati che consentono il controllo temporale della misespressione di FMRP20,21. Qui, la metodologia è avanzata per indurre manipolazioni selettive dei neuroni presinaptici e postsinaptici separatamente. Questo metodo è stato sviluppato nel circuito uditivo del tronco cerebrale. Il segnale acustico viene rilevato dalle cellule ciliate nell'orecchio interno uditivo e quindi trasmesso al ganglio uditivo (AG; chiamato anche ganglio a spirale nei mammiferi). I neuroni bipolari nell'AG innervano le cellule ciliate con i loro processi periferici e a loro volta inviano una proiezione centrale (il nervo uditivo) al tronco cerebrale dove terminano in due nuclei cocleari primari, il nucleo magnocellularis (NM) e il nucleo angolare (NA). I neuroni nella NM sono strutturalmente e funzionalmente paragonabili alle cellule cespugliose sferiche del nucleo cocleare anteroventrale dei mammiferi. All'interno della NM, sinapsi delle fibre nervose uditive (ANF) sulla somata dei neuroni NM attraverso il grande bulbo terminale dei terminali Held22. Durante lo sviluppo, i neuroni NM derivano dai rombomeri 5 e 6 (r5/6) nel cervello posteriore23, mentre i neuroni AG derivano dai neuroblasti che risiedono nell'otocisti24. Qui, descriviamo la procedura per abbattere selettivamente l'espressione di FMRP nei neuroni AG presinaptici e nei neuroni NM postsinaptici separatamente.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Egg incubation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 &#176;C refrigerator</td>
			<td>MAGAT</td>
			<td></td>
			<td>Used for fertilized egg storage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>SHANGHAI BOXUN</td>
			<td>GZX-9240MBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized eggs</td>
			<td>Farm of South China Agricultural University</td>
			<td></td>
			<td>Eggs must be used in one week for optimal viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1661</td>
			<td>Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi-prep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td>Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Make 7.5M working solution in nuclase-free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation and Doxycycline Administration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>ECM399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL / 5 mL Syringe</td>
			<td>GUANGZHOU KANGFULAI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>CNOPTEC</td>
			<td>SZM-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxcycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td>Use fresh aliquots for each dose and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>BEIBOBOMEI</td>
			<td>RD0910</td>
			<td>0.9-1.1 mm*100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory parafilm</td>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>PM996</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>CHENGDU INSTRUMENT FACTORY</td>
			<td>WD-2</td>
			<td>Pulling condition: 500 &#176;C for 15 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum elctrodes</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum elctrodes</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Dissection and Fixation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td>Tip size: 0.05*0.01 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other surgery tools</td>
			<td>RWD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 &#176;C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW</td>
			<td>01673921</td>
			<td>For black background plates, food-grade carbon powder is applied.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9391</td>
			<td>From bovine skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding microtome</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SM2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150113</td>
			<td>1:500 dilution, RRID: AB_2576208</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150078</td>
			<td>1:500 dilution, RRID: AB_2722519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab285390</td>
			<td>1: 1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>Southern&#160;Biotech</td>
			<td>Sb-0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMRP antibody</td>
			<td>Y. Wang, Florida State University</td>
			<td>#8263</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_2861242</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.3F7</td>
			<td>1:100 dilution, RRID: AB_1157901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4142</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_477272</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parvalbumin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3088</td>
			<td>1:10000 dilution, RRID: AB_477329</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAP25 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab66066</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_2192052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe photoshop</td>
			<td>ADOBE</td>
			<td></td>
			<td>image editing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Image-Pro Plus 7.0</td>
			<td>OlYMPUS</td>
			<td></td>
			<td>commercial image processing software package</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting cell-autonomous function of fragile x mental retardation protein in an auditory circuit by in ovo electroporation

La proteina del ritardo mentale dell'X fragile (FMRP) è una proteina legante l'mRNA che regola la traduzione proteica locale. La perdita o la disfunzione della FMRP porta ad attività neuronali e sinaptiche aberranti nella sindrome dell'X fragile (FXS), che è caratterizzata da disabilità intellettiva, anomalie sensoriali e problemi di comunicazione sociale. Studi sulla funzione FMRP e sulla patogenesi FXS sono stati condotti principalmente con knockout Fmr1 (il gene che codifica per FMRP) in animali transgenici. Qui riportiamo un metodo in vivo per determinare la funzione autonoma cellulare di FMRP durante il periodo di assemblaggio del circuito e formazione sinaptica utilizzando embrioni di pollo. Questo metodo impiega l'elettroporazione specifica per stadio, sito e direzione di un sistema vettoriale inducibile da farmaci contenente Fmr1 small hairpin RNA (shRNA) e un reporter EGFP. Con questo metodo, abbiamo ottenuto il knockdown selettivo FMRP nel ganglio uditivo (AG) e in uno dei suoi bersagli del tronco cerebrale, il nucleo magnocellularis (NM), fornendo così una manipolazione specifica del componente all'interno del circuito AG-NM. Inoltre, il modello a mosaico della trasfezione consente controlli all'interno degli animali e confronti neurone/fibra vicini per una maggiore affidabilità e sensibilità nell'analisi dei dati. Il sistema vettoriale inducibile fornisce il controllo temporale dell'insorgenza dell'editing genico per ridurre al minimo gli effetti accumulati sullo sviluppo. La combinazione di queste strategie fornisce uno strumento innovativo per analizzare la funzione autonoma cellulare di FMRP nello sviluppo sinaptico e circuitale.

Eseguendo l'elettroporazione ovo in diversi siti e in diversi stadi di sviluppo, abbiamo ottenuto il knockdown selettivo FMRP sia nella periferia uditiva che nel tronco cerebrale uditivo.
FMRP knockdown in NM L'RNA a forcina piccola (shRNA) contro il pollo Fmr1 è stato progettato e clonato nel sistema vettoriale Tet-On come descritto in precedenza20. La configurazione per l'elettroporazione in ovo è mostrata nella <strong...

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Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Utilizzando l'elettroporazione in ovo , abbiamo ideato un metodo per trasfettare selettivamente l'orecchio interno uditivo e il nucleo cocleare negli embrioni di pollo per ottenere un knockdown specifico del gruppo cellulare della proteina di ritardo mentale X fragile durante periodi discreti di assemblaggio del circuito.

Dissezione della funzione autonoma delle cellule della proteina del ritardo mentale dell'X fragile in un circuito uditivo mediante elettroporazione in ovo

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to ...

Il nostro protocollo è un metodo in vivo per studiare le funzioni autonome delle cellule di FMRP durante lo sviluppo. Questo può aiutare a comprendere la fisiopatologia specifica del tipo di cellula della sindrome dell'X fragile. Questo metodo impiega l'elettroporazione specifica dello stadio, del sito e della direzione di un sistema vettoriale inducibile da farmaci contenente l'RNA a forcina Fmr1.Con questo metodo, otteniamo il knockdown selettivo FMRP nel circuito uditivo. Questo metodo può anche essere applicato per studiare la funzione di altri geni nel circuito uditivo o nel sistema vestibolare. Inizia posizionando le uova orizzontalmente per posizionare l'embrione sulla parte superiore dell'uovo per una facile manipolazione.Incubare a 38 gradi Celsius per 46-48 ore fino a Hamburger e Hamilton, o stadio HH 12, per la trasfezione del tubo neurale o per 54-56 ore fino a HH 13 per la trasfezione di otocisti . Rimuovere le uova dall'incubatrice, una dozzina di uova alla volta. Tenere le uova fuori dalla loro incubatrice per più di un'ora introduce variazioni di sviluppo e riduce la vitalità.Usa una torcia per proiettare luce dal fondo dell'uovo. La posizione dell'embrione appare come un'area scura sul guscio d'uovo. Segna la posizione dell'embrione sul guscio d'uovo con una matita.Pulire le uova con una garza contenente il 75% di etanolo e praticare un foro nell'estremità appuntita delle uova usando la punta delle forbici. Quindi, rimuovere due millilitri di albumina con una siringa ad ago da 18 gauge. Assicurarsi che il foro sia abbastanza grande da consentire l'inserimento dell'ago.Pulire via l'albumina che perde con una garza e sigillare il foro con nastro trasparente. Coprire la parte superiore delle uova con nastro trasparente, centrando l'area scura segnata dalla matita per ridurre al minimo le crepe e prevenire la caduta di detriti di guscio durante la finestratura. Pulire tutti gli strumenti chirurgici con una garza contenente il 75% di etanolo e pulire l'area coperta di nastro con il 75% di etanolo.Usa un piccolo paio di forbici per tagliare una finestra da uno a due centimetri quadrati attorno alla circonferenza del segno della matita. Tenere le forbici piatte per evitare di danneggiare l'embrione sottostante. Posizionare l'uovo finestrato sotto uno stereomicroscopio con un oculare 10X e zoom 2X.Riempire una siringa da un millilitro con la soluzione di inchiostro e quindi montare un ago da 27 gauge. Piegare l'ago con un angolo di 45 gradi con una pinza. Sotto il microscopio, colpire con attenzione dal bordo dell'area opaqua e inserire l'ago sotto l'embrione.Iniettare circa 50 microlitri di inchiostro, che si diffonderà sotto l'area pellucida, per la visualizzazione dell'embrione. L'inchiostro formerà uno sfondo scuro per la chiara visualizzazione dell'embrione. Tirare i capillari di vetro nelle pipette usando un estrattore di pipette.Sotto un microscopio da dissezione, aprire con attenzione la punta dell'ago capillare a 10-20 micrometri di diametro con una pinza. Conservare le pipette in una scatola fino all'uso. Quindi, riempire una pipetta capillare con 0,5-1 microlitro della miscela plasmidica applicando una pressione negativa attraverso un tubo di gomma all'estremità della pipetta con una siringa.Metti l'uovo al microscopio in modo che l'embrione sia orientato verticalmente con la coda vicino a te. Tenere la pipetta capillare con una mano o con il manipolatore a tre assi e guidare la punta della pipetta sul rombomero da 5 a 6. in una direzione da coda a testa.Colpire delicatamente la punta attraverso la membrana vitellina e nel tubo neurale dorsale, quindi ritirare leggermente la pipetta in modo che la punta sia nel lume del tubo neurale. Iniettare la miscela plasmidica applicando la pressione dell'aria fino a quando il plasmide colorato si diffonde completamente nei rombomeri da 5 a 6 e si estende nei rombomeri 3 e rombomeri 4. Verificare la riuscita dell'iniezione, che si ottiene quando la soluzione plasmidica blu si diffonde rapidamente lungo il tubo neurale senza perdite.Quando si verifica una perdita, il blu svanisce rapidamente. Immediatamente dopo l'iniezione, posizionare un elettrodo bipolare di platino su entrambi i lati del tubo neurale. Eroga due impulsi di 12 volt e una durata di 50 millisecondi con un elettroporatore.Osservare le bolle d'aria alle estremità dell'elettrodo bipolare, con più sul lato negativo. Verificare la corretta elettroporazione, che si ottiene quando la miscela plasmidica colorata entra nel tessuto del tubo neurale vicino al lato positivo dell'elettrodo. Dopo l'elettroporazione, rimuovere con attenzione l'elettrodo bipolare.Coprire la finestra sul guscio d'uovo con un pezzo di pellicola trasparente pretagliata a quadrati da due pollici e spruzzata con etanolo al 75%. Rimetti l'uovo nella sua incubatrice. Pulire l'elettrodo bipolare erogando da 10 a 20 impulsi di 12 volt e 50 millisecondi di durata in soluzione salina prima di procedere all'uovo successivo.Sotto il microscopio, posiziona l'uovo in modo tale che l'embrione sia verticale con la coda vicino a te. Tenere la pipetta capillare e colpire delicatamente l'otocisti destra in direzione dorsolaterale. Iniettare la miscela plasmidica con pressione dell'aria fino a quando l'otocisti è riempita con soluzione blu.Verificare la riuscita dell'iniezione, che si ottiene quando la miscela di plasmide blu è confinata all'interno dell'otocisti e non fuoriesce. Immediatamente dopo l'iniezione, posizionare l'elettrodo bipolare sull'otocisti e posizionare rispettivamente i lati positivo e negativo anteriore e posteriore all'otocisti. Erogare due impulsi di 12 volt e 50 millisecondi con l'elettroporatore.Verificare la corretta elettroporazione, che si ottiene quando la miscela di plasmidi blu entra nel tessuto dell'otocisti vicino al lato positivo dell'elettrodo. Dopo l'elettroporazione, rimuovere con attenzione l'elettrodo bipolare e coprire la finestra sul guscio d'uovo con un film trasparente. Infine, restituire l'uovo all'incubatrice.L'immagine rappresentativa mostra un esempio di terzo giorno embrionale, o E3, dopo la trasfezione del tubo neurologico e il trattamento dox al secondo giorno embrionale, o E2. Le cellule trasfettate con Fmr1 shRNA e EGFP sulla sezione trasversale sono mostrate qui. Le cellule che esprimono EGFP erano confinate a un lato del tubo neurale e del tronco cerebrale. Una sezione trasversale a E15 con nucleo magnocellularis che esprime EGFP, o neuroni NM, sul lato trasfettato è mostrata qui.Sul lato controlaterale, assoni contenenti EGFP sono stati osservati nella porzione ventrale del nucleo laminaris, o NL. L'effetto knockdown dello shRNA Fmr1 è stato convalidato da marcate riduzioni dell'immunoreattività FMRP nei neuroni NM trasfettati rispetto ai neuroni vicini non trasfettati. Il ganglio uditivo a E19 con immunoreattività FMRP è mostrato qui. I neuroni gangliari uditivi non sono stati trasfettati.Alcune cellule gliali derivate dalle cellule della cresta neurale cranica sono state trasfettate. Le immagini rappresentative mostrano l'abbattimento della FMRP nel dotto uditivo dopo la trasfezione dell'otocisti. I condotti uditivi all'E9 hanno mostrato un'ampia fluorescenza EGFP.Sulle sezioni trasversali, le cellule che esprimono EGFP erano localizzate nella papilla basilare e nel ganglio uditivo. L'effetto knockdown dello shRNA Fmr1 è stato convalidato dalla ridotta immunoreattività FMRP nelle cellule ciliate trasfettate rispetto alle cellule ciliate vicine non trasfettate. Allo stesso modo, l'immunoreattività FMRP era ampiamente diminuita nei neuroni gangliari uditivi trasfettati.La proiezione centrale dei neuroni gangliari uditivi trasfettati è stata tracciata al tronco cerebrale attraverso il nervo uditivo con terminali terminali caratterizzati. Durante il tentativo di questa procedura, la cosa più importante è controllare il sito e la direzione dell'elettroporazione per la trasfezione selettiva. Seguendo questa procedura, il riempimento di un singolo tipo di cellula, l'immunocolorazione, la selezione cellulare seguita dallo spettro di massa o il sequenziamento di singole cellule possono essere eseguiti per rivelare i cambiamenti a livello morfologico e biochimico.Questa tecnica consente anche l'editing selettivo di altri geni con controllo temporale e specificità dei componenti nell'orecchio uditivo per i circuiti staminali e può essere modificata per manipolare il sistema vestibolare.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Elettroporazione seguita da primaria Cultura neuronale per studiare la funzione dei geni in sottoinsieme di neuroni corticali

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Ricerca

Neuroscienze

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

TMS: Utilizzo del Theta Burst protocollo Esplora Mechasnism di plasticità in individui con Sindrome X Fragile e autismo

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Trasfezione delle cellule gangliari della retina di topo In vivo Elettroporazione

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In elettroporazione ovo nel mesencefalo Chick per lo Studio la funzione dei geni nello sviluppo dopaminergici Neuron

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

In elettroporazione ovo di miRNA-based plasmidi nel tubo neurale sviluppo e valutazione di fenotipi da Injection DiI in Open-book Preparazioni

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Indagini su Alterazioni della funzione del circuito ippocampale seguito lieve trauma cranico

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In Expression Ovo di MicroRNA in Ventrale Chick Mesencefalo

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

Un leggero, Cuffie-based per la gestione di sistema feedback uditivo in Songbirds

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Rilevamento di palmitoilazione proteina in colture di neuroni ippocampali di immunoprecipitazione e di acil-Biotina Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

Registrazione e analisi dei ritmi circadiani in Running-ruota Attività nei roditori

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...