Name: dissecting cell-autonomous function of fragile x mental retardation protein in an auditory circuit by in ovo electroporation
Uploaded: 2022-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation at JoVE.com

Denne studien ble støttet av: et National Natural Science Foundation of China-stipend (nr. 32000697); vitenskaps- og teknologiprogrammet i Guangzhou (202102080139); Guangdong naturvitenskapelige stiftelse (2019A1515110625, 2021A1515010619); de grunnleggende forskningsfondene for de sentrale universitetene (11620324); et forskningsstipend fra Key Laboratory of Regenerative Medicine, Utdanningsdepartementet, Jinan University (nr. ZSYXM202107); de grunnleggende forskningsfondene for de sentrale universitetene i Kina (21621054); og Medical Scientific Research Foundation i Guangdong-provinsen i Kina (20191118142729581). Vi takker det medisinske eksperimentelle senteret ved Jinan University. Vi takker Dr. Terra Bradley for nøye redigering av manuskriptet.

Egg og kyllingembryoer ble håndtert med forsiktighet og respekt i samsvar med dyreprotokollene godkjent av Jinan University Animal Care and Use Committee.
1. Egg- og plasmidpreparat
<ol><li>Egg forberedelse<ol><li>Få ferske befruktede kyllingegg (Gallus gallus) fra South China Agricultural University og oppbevar ved 16 ° C før inkubasjon. For optimal levedyktighet, sett alle egg til inkubasjon innen en uke etter ankomst.</li>
		<li>Legg egg horisontalt og rug ve...

<ol>
	<li>Hagerman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+syndrome.">Fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).</li><li>Hinds, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+expression+of+FMR-1+provides+evidence+for+a+functional+role+in+fragile+X+syndrome.">Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome.</a> Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).</li><li>Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome+FMRP+co-localizes+with+regulatory+targets+PSD-95,+GABA+receptors,+CaMKIIalpha,+and+mGluR5+at+fiber+cell+membranes+in+the+eye+lens.">Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens.</a> Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).</li><li>Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+distribution+of+the+fragile+X+mental+retardation+protein+in+the+mouse+brain.">Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).</li><li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism.">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li><li>Bakker, C. E., Oostra, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+fragile+X+syndrome:+insights+from+animal+models.">Understanding fragile X syndrome: insights from animal models.</a> Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).</li><li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li><li>Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+presynaptic+short-term+plasticity+and+information+processing+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).</li><li>Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+target+cell-specific+role+for+presynaptic+Fmr1+in+regulating+glutamate+release+onto+neocortical+fast-spiking+inhibitory+neurons.">A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).</li><li>Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+FMRP+promotes+the+pruning+of+cell-to-cell+connections+among+pyramidal+neurons+in+the+L5A+neocortical+network.">Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network.</a> Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).</li><li>Higashimori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+deletion+of+astroglial+FMRP+dysregulates+glutamate+transporter+GLT1+and+contributes+to+Fragile+X+syndrome+phenotypes+in+vivo.">Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).</li><li>Hodges, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+contributions+to+synaptic+and+learning+abnormalities+in+a+mouse+model+of+Fragile+X+syndrome.">Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome.</a> Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).</li><li>Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Audiogenic+seizures+in+the+Fmr1+knock-out+mouse+are+induced+by+Fmr1+deletion+in+subcortical,+VGlut2-expressing+excitatory+neurons+and+require+deletion+in+the+inferior+colliculus.">Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).</li><li>Bland, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+regulates+the+subcellular+distribution+of+cortical+dendritic+spine+density+in+a+non-cell-autonomous+manner.">FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner.</a> Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+induces+synapse+loss+through+acute+postsynaptic+translational+regulation.">Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+is+required+for+synapse+elimination+by+the+activity-dependent+transcription+factor+MEF2.">Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2.</a> Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).</li><li>Deng, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+regulates+neurotransmitter+release+and+synaptic+information+transmission+by+modulating+action+potential+duration+via+BK+channels.">FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels.</a> Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).</li><li>Yang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+molecular+locus+for+normalizing+dysregulated+GABA+release+from+interneurons+in+the+Fragile+X+brain.">Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain.</a> Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).</li><li>Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+studies+in+fragile+X+syndrome.">Developmental studies in fragile X syndrome.</a> Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).</li><li>Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+FMRP+regulates+synaptogenesis+in+vivo+in+the+developing+cochlear+nucleus.">Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-specific+roles+of+fragile+X+mental+retardation+protein+in+the+development+of+the+hindbrain+auditory+circuit.">Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit.</a> Development. 147 (21), (2020).</li><li>Rubel, E. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+system+development:+primary+auditory+neurons+and+their+targets.">Auditory system development: primary auditory neurons and their targets.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).</li><li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+auditory+brain-stem+nuclei+in+the+chick+hindbrain.">Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain.</a> Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).</li><li>Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+expression+of+Zic+genes+during+vertebrate+inner+ear+development.">Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development.</a> Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+the+chicken+auditory+brainstem.">In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).</li><li>Evsen, L., Doetzlhofer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+the+chicken+auditory+organ+by+in+ovo+micro-electroporation.">Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).</li><li>Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrkB+downregulation+is+required+for+dendrite+retraction+in+developing+neurons+of+chicken+nucleus+magnocellularis.">TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).</li><li>Wang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+environment+inhibits+cranial+neural+crest+survival+by+activating+excessive+autophagy+in+the+chick+embryo.">High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo.</a> Scientific Reports. 5, 18321 (2015).</li><li>Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+fragile+X+mental+retardation+protein+correlates+with+cellular+and+synaptic+properties+in+primary+auditory+neurons+following+afferent+deprivation.">Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet-1+expression+in+the+developing+chicken+inner+ear.">Islet-1 expression in the developing chicken inner ear.</a> Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).</li><li>Carr, C. E., Boudreau, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+auditory+nerve+fibers+in+the+barn+owl.">Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl.</a> Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).</li><li>Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochleovestibular+nerve+development+is+integrated+with+migratory+neural+crest+cells.">Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells.</a> Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).</li><li>Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+signaling+promotes+axon+segregation+in+the+developing+auditory+system.">EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system.</a> Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).</li><li>Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+neurogenesis+in+the+inner+ear+requires+inhibition+of+Sox2+transcription+by+neurogenin1+and+neurod1.">Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1.</a> Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).</li><li>Curnow, E., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+animal+models+for+understanding+FMRP+functions+and+FXS+pathology.">New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology.</a> Cells. 11 (10), 1628 (2022).</li></ol>

For å bestemme den celle-autonome funksjonen til FMRP, er det nødvendig å manipulere uttrykket i individuelle cellegrupper eller celletyper. Siden en av hovedfunksjonene til FMRP er å regulere synaptisk formasjon og plastisitet, er selektiv manipulering av hver synaptisk komponent i en bestemt krets en forutsetning for en full forståelse av FMRP-mekanismen i synaptisk kommunikasjon. Ved hjelp av ovo-elektroporering av kyllingembryoer demonstrerte vi en metode for å målret...

Fragilt X-syndrom (FXS) er en nevroutviklingsforstyrrelse preget av intellektuell funksjonshemming, sensoriske abnormiteter og autistisk atferd. I de fleste tilfeller er FXS forårsaket av et globalt tap av skjøre X-mental retardasjonsprotein (FMRP; kodet av Fmr1-genet) som starter i tidlige embryonale stadier1. FMRP er et RNA-bindende protein som normalt uttrykkes i de fleste nevroner og gliaceller i hjernen, samt i sanseorganer 2,3,4. I pattedyrhjerner er FMRP sannsynligvis forbundet med hundrevis av mRNA som koder for proteiner som er viktige for ulike nevrale aktiviteter5. Studier av konvensjonelle Fmr1 knockout-dyr viste at FMRP-uttrykk er spesielt viktig for montering og plastisitet av synaptisk nevrotransmisjon6. Flere betingede og mosaiske knockoutmodeller har videre vist at FMRP-handlinger og signaler varierer på tvers av hjernegrupper, celletyper og synaptiske steder under flere utviklingshendelser, inkludert aksonal projeksjon, dendritisk mønster og synaptisk plastisitet 7,8,9,10,11,12,13,14 . Akutt funksjon av FMRP i regulering av synaptisk overføring ble studert ved intracellulær levering av hemmende FMRP-antistoffer eller FMRP selv i hjerneskiver eller dyrkede nevroner15,16,17,18. Disse metodene gir imidlertid ikke muligheten til å spore FMRP-feiluttrykksinduserte konsekvenser under utvikling. Dermed er det stort behov for å utvikle in vivo-metoder for å undersøke de celle-autonome funksjonene til FMRP, og forventes å bidra til å avgjøre om de rapporterte anomaliene hos FXS-pasienter er direkte konsekvenser av FMRP-tap i de tilknyttede nevronene og kretsene, eller sekundære konsekvenser avledet av nettverksomfattende endringer under utvikling19.
Den auditive hjernestammen til kyllingembryoer tilbyr en unik fordelaktig modell for dyptgående funksjonelle analyser av FMRP-regulering i krets- og synapseutvikling. Den enkle tilgangen til embryonale kyllinghjerner og den veletablerte i ovo elektroporeringsteknikk for genetisk manipulasjon har bidratt sterkt til vår forståelse av hjernens utvikling i tidlige embryonale stadier. I en nylig publisert studie ble denne teknikken kombinert med avanserte molekylære verktøy som tillater temporal kontroll av FMRP feiluttrykk20,21. Her er metodikken avansert for å indusere selektive manipulasjoner av presynaptiske og postsynaptiske nevroner separat. Denne metoden ble utviklet i den auditive hjernestammekretsen. Akustisk signal oppdages av hårceller i det hørbare indre øret og overføres deretter til den hørbare ganglion (AG; også kalt spiralganglion hos pattedyr). Bipolare nevroner i AG innerverer hårceller med sine perifere prosesser og sender i sin tur en sentral projeksjon (hørselsnerven) til hjernestammen hvor de avsluttes i to primære cochleakjerner, kjernen magnocellularis (NM) og nucleus angularis (NA). Nevroner i NM er strukturelt og funksjonelt sammenlignbare med de sfæriske buskcellene i pattedyrets anteroventrale cochleakjerne. Innenfor NM, auditive nervefibre (ANFs) synapse på somata av NM nevroner via den store endbulb av Held terminaler22. Under utviklingen oppstår NM-nevroner fra rhombomeres 5 og 6 (r5/6) i bakhjernen23, mens AG-nevroner er avledet fra neuroblaster bosatt i otocyst24. Her beskriver vi prosedyren for selektivt å slå ned FMRP-uttrykk i de presynaptiske AG-nevronene og i de postsynaptiske NM-nevronene separat.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Egg incubation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 &#176;C refrigerator</td>
			<td>MAGAT</td>
			<td></td>
			<td>Used for fertilized egg storage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>SHANGHAI BOXUN</td>
			<td>GZX-9240MBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized eggs</td>
			<td>Farm of South China Agricultural University</td>
			<td></td>
			<td>Eggs must be used in one week for optimal viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1661</td>
			<td>Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi-prep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td>Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Make 7.5M working solution in nuclase-free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation and Doxycycline Administration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>ECM399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL / 5 mL Syringe</td>
			<td>GUANGZHOU KANGFULAI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>CNOPTEC</td>
			<td>SZM-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxcycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td>Use fresh aliquots for each dose and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>BEIBOBOMEI</td>
			<td>RD0910</td>
			<td>0.9-1.1 mm*100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory parafilm</td>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>PM996</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>CHENGDU INSTRUMENT FACTORY</td>
			<td>WD-2</td>
			<td>Pulling condition: 500 &#176;C for 15 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum elctrodes</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum elctrodes</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Dissection and Fixation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td>Tip size: 0.05*0.01 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other surgery tools</td>
			<td>RWD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 &#176;C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW</td>
			<td>01673921</td>
			<td>For black background plates, food-grade carbon powder is applied.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9391</td>
			<td>From bovine skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding microtome</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SM2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150113</td>
			<td>1:500 dilution, RRID: AB_2576208</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150078</td>
			<td>1:500 dilution, RRID: AB_2722519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab285390</td>
			<td>1: 1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>Southern&#160;Biotech</td>
			<td>Sb-0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMRP antibody</td>
			<td>Y. Wang, Florida State University</td>
			<td>#8263</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_2861242</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.3F7</td>
			<td>1:100 dilution, RRID: AB_1157901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4142</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_477272</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parvalbumin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3088</td>
			<td>1:10000 dilution, RRID: AB_477329</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAP25 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab66066</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_2192052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe photoshop</td>
			<td>ADOBE</td>
			<td></td>
			<td>image editing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Image-Pro Plus 7.0</td>
			<td>OlYMPUS</td>
			<td></td>
			<td>commercial image processing software package</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting cell-autonomous function of fragile x mental retardation protein in an auditory circuit by in ovo electroporation

Fragile X mental retardation protein (FMRP) er et mRNA-bindende protein som regulerer lokal proteinoversettelse. FMRP-tap eller dysfunksjon fører til avvikende nevronale og synaptiske aktiviteter i fragilt X-syndrom (FXS), som er preget av intellektuell funksjonshemming, sensoriske abnormiteter og sosiale kommunikasjonsproblemer. Studier av FMRP-funksjon og FXS-patogenese er primært utført med Fmr1 (genet som koder for FMRP) knockout hos transgene dyr. Her rapporterer vi en in vivo-metode for å bestemme den celle-autonome funksjonen til FMRP i perioden med kretsmontering og synaptisk dannelse ved bruk av kyllingembryoer. Denne metoden benytter scene-, steds- og retningsspesifikk elektroporering av et legemiddelinduserbart vektorsystem som inneholder Fmr1 lite hårnåls-RNA (shRNA) og en EGFP-reporter. Med denne metoden oppnådde vi selektiv FMRP-knockdown i den auditive ganglion (AG) og i et av hjernestammemålene, kjernen magnocellularis (NM), og dermed gi en komponentspesifikk manipulasjon i AG-NM-kretsen. I tillegg tillater mosaikkmønsteret til transfeksjonen kontroller innen dyr og nærliggende nevron / fiber sammenligninger for økt pålitelighet og følsomhet i dataanalyse. Det induserbare vektorsystemet gir tidsmessig kontroll av genredigeringsstart for å minimere akkumulerende utviklingseffekter. Kombinasjonen av disse strategiene gir et innovativt verktøy for å dissekere den celle-autonome funksjonen til FMRP i synaptisk og kretsutvikling.

Ved å utføre i ovo-elektroporering på forskjellige steder og på forskjellige utviklingsstadier, oppnådde vi selektiv FMRP-knockdown enten i den hørbare periferien eller i den auditive hjernestammen.
FMRP knockdown i NM Liten hårnål RNA (shRNA) mot kyllingen Fmr1 ble designet og klonet inn i Tet-On vektorsystemet som beskrevet tidligere20. Oppsettet for in ovo elektroporering er vist i figur 1A</...

Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation at JoVE.com

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Ved hjelp av ovo-elektroporering utviklet vi en metode for selektivt å transfektere det hørbare indre øret og cochleakjernen i kyllingembryoer for å oppnå en cellegruppespesifikk knockdown av skjørt X-mentalt retardasjonsprotein i diskrete perioder med kretsmontering.

Dissekere celle-autonom funksjon av skjøre X mental retardasjon protein i en auditiv krets ved i ovo elektroporering

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to ...

Vår protokoll er en in vivo-metode for å undersøke de celle-autonome funksjonene til FMRP under utvikling. Dette kan bidra til å forstå den celletypespesifikke patofysiologien ved fragilt X-syndrom. Denne metoden benytter scene-, steds- og retningsspesifikk elektroporering av et legemiddelinduserbart vektorsystem som inneholder Fmr1 lite hårnåls-RNA.Med denne metoden oppnår vi den selektive FMRP-knockdown i hørselskretsen. Denne metoden kan også brukes til å undersøke funksjonen til andre gener i hørselskretsen eller vestibulærsystemet. Begynn med å plassere eggene horisontalt for å plassere embryoet på toppen av egget for enkel manipulering.Inkuber ved 38 grader Celsius i 46 til 48 timer til Hamburger og Hamilton, eller HH trinn 12, for nevralrørtransfeksjon eller i 54 til 56 timer til HH 13 for otocyst transfeksjon. Fjern eggene fra inkubatoren, et dusin egg om gangen. Å holde egg ute av inkubatoren i mer enn en time introduserer utviklingsvariasjoner og reduserer levedyktigheten.Bruk en lommelykt til å kaste lys fra bunnen av egget. Plasseringen av embryoet vises som et mørkt område på eggeskallet. Merk plasseringen av embryoet på eggeskallet med en blyant.Tørk eggene med gasbind som inneholder 75% etanol og bor et hull i den spisse enden av eggene ved hjelp av saksespissen. Fjern deretter to milliliter albumin med en 18-gauge nålsprøyte. Forsikre deg om at hullet bare er stort nok til at nålen kan settes inn.Tørk bort lekkende albumin med gasbind og tett hullet med klar tape. Dekk toppen av eggene med klar tape, sentrert på det blyantmerkede mørke området for å minimere sprekker og forhindre fallende skallrester under vindu. Tørk alle kirurgiske verktøy med gasbind som inneholder 75% etanol og tørk det tapedekkede området med 75% etanol.Bruk en liten saks til å klippe et vindu på en til to kvadratcentimeter rundt omkretsen av blyantmerket. Hold saksen flat for å unngå å skade embryoet under. Plasser vindusegget under et stereomikroskop med et 10X øyestykke og 2X zoom.Fyll en milliliter sprøyte med blekkoppløsningen og monter deretter en 27-gauge nål. Bøy nålen til en 45 graders vinkel med tang. Under mikroskopet, stikk forsiktig fra kanten av området opaqua og stikk nålen under embryoet.Injiser rundt 50 mikroliter blekk, som vil diffundere under området pellucida, for embryovisualisering. Blekket vil danne en mørk bakgrunn for den klare visualiseringen av embryoet. Trekk glasskapillærene inn i pipetter ved hjelp av en pipettetrekker.Under et dissekeringsmikroskop åpner du forsiktig spissen av kapillærnålen til 10 til 20 mikrometer i diameter med tang. Oppbevar pipettene i en oppbevaringsboks til bruk. Fyll deretter en kapillærpipette med 0,5 til 1 mikroliter av plasmidblandingen ved å påføre undertrykk gjennom et gummirør på enden av pipetten med en sprøyte.Plasser egget under mikroskopet slik at embryoet er vertikalt orientert med halen nær deg. Hold kapillærpipetten med en hånd eller med den treaksede manipulatoren og kjør pipettens spiss til rhombomere 5 til 6. i en hale-til-hode-retning.Stikk spissen forsiktig gjennom vitellinmembranen og inn i det dorsale nevrale røret, og trekk deretter pipetten litt slik at spissen er i lumen i nevrale røret. Injiser plasmidblandingen ved å påføre lufttrykk til det tonede plasmidet diffunderer helt inn i rhombomere 5 til 6 og strekker seg inn i rhombomere 3 og rhombomere 4. Se etter vellykket injeksjon, som oppnås når den blå plasmidoppløsningen raskt diffunderer ned i nevrale røret uten å lekke.Når lekkasje oppstår, blekner det blå raskt. Umiddelbart etter injeksjonen, plasser en platina bipolar elektrode på hver side av nevrale røret. Lever to pulser på 12 volt og 50 millisekunder varighet med en elektroporator.Vær oppmerksom på luftbobler i enden av den bipolare elektroden, med mer på den negative siden. Kontroller for vellykket elektroporering, som oppnås når den tonede plasmidblandingen kommer inn i nevralrørsvevet nær den positive siden av elektroden. Etter elektroporering, fjern forsiktig den bipolare elektroden.Dekk vinduet på eggeskallet med et stykke gjennomsiktig film forhåndskuttet til to-tommers firkanter og sprayet med 75% etanol. Plasser egget tilbake i inkubatoren. Rengjør den bipolare elektroden ved å levere 10 til 20 pulser av 12 volt og 50 millisekunder varighet i saltvann før du fortsetter til neste egg.Under mikroskopet, plasser egget på en slik måte at embryoet er vertikalt med halen nær deg. Hold kapillærpipetten og stikk forsiktig høyre otocyst i dorsolateral retning. Injiser plasmidblandingen med lufttrykk til otocysten er fylt med blå løsning.Sjekk for en vellykket injeksjon, som oppnås når den blå plasmidblandingen er begrenset i otocysten og ikke lekker. Umiddelbart etter injeksjonen, plasser den bipolare elektroden på otocysten og plasser de positive og negative sidene henholdsvis fremre og bakre til otocysten. Lever to pulser på 12 volt og 50 millisekunder varighet med elektroporatoren.Kontroller for vellykket elektroporering, som oppnås når den blå plasmidblandingen kommer inn i otocystens vev nær den positive siden av elektroden. Etter elektroporering fjerner du forsiktig den bipolare elektroden og dekker vinduet på eggeskallet med en gjennomsiktig film. Til slutt, returner egget til inkubatoren.Det representative bildet viser et eksempel på embryonal dag tre, eller E3, etter nevrorørtransfeksjon og doxbehandling på embryonal dag to, eller E2. Transfiserte celler med Fmr1 shRNA og EGFP på tverrsnittet er vist her. EGFP-uttrykkende celler var begrenset til den ene siden av nevrale røret og hjernestammen. Et tverrsnitt ved E15 med EGFP-uttrykkende nucleus magnocellularis, eller NM-nevroner, på den transfiserte siden er vist her.På kontralateral side ble EGFP-holdige aksoner sett i den ventrale delen av kjernen laminaris, eller NL. Knockdown-effekten av Fmr1 shRNA ble validert av markerte reduksjoner i FMRP-immunoreaktivitet i transfiserte NM-nevroner sammenlignet med nærliggende ikke-transfekterte nevroner. Den auditive ganglion på E19 med FMRP immunoreaktivitet er vist her. Auditive ganglionneuroner ble ikke transfisert.Noen gliaceller avledet fra kraniale nevrale kamceller ble transfisert. De representative bildene viser FMRP-knock-down i hørselskanalen etter otocysttransfeksjon. Hørselskanaler ved E9 viste omfattende EGFP-fluorescens.På tverrgående seksjoner var EGFP-uttrykkende celler lokalisert i basilarpapillen og den hørbare ganglionen. Knockdown-effekten av Fmr1 shRNA ble validert ved redusert FMRP-immunreaktivitet i transfiserte hårceller sammenlignet med nærliggende ikke-transfiserte hårceller. På samme måte ble FMRP-immunoreaktiviteten i stor grad redusert i transfiserte auditive ganglion-nevroner.Den sentrale projeksjonen av de transfiserte auditive ganglion-nevronene ble sporet til hjernestammen via hørselsnerven med karakteriserte endbulbterminaler. Mens du prøver denne prosedyren, er det viktigste å kontrollere stedet og retningen av elektroporering for selektiv transfeksjon. Etter denne prosedyren kan enkeltcelletypefylling, immunostaining, cellesortering fulgt med massespektrum eller enkeltcellesekvensering utføres for å avsløre endringene på morfologiske og biokjemiske nivåer.Denne teknikken muliggjør også selektiv redigering av andre gener med temporal kontroll og komponentspesifisitet i det hørbare øret for stammekretser og kan modifiseres for å manipulere det vestibulære systemet.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

I ovo electroporation i Chick midbrain for å studere gen-funksjon i dopaminerg Neuron Development

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

I ovo Electroporation av miRNA-baserte Plasmids i Utvikling Neural Tube og vurdering av fenotyper av Dii Injeksjon i åpen bok Forberedelser

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Undersøkelser på Endringer i Hippocampus Circuit Funksjon Etter mild traumatisk hjerneskade

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

I ovo Expression av mikroRNA i ventral Chick midthjernen

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

En lett, hodetelefoner-basert system for å manipulere Auditiv tilbakemelding i Songbirds

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Påvisning av Protein palmitoylation i Cultured hippocampus neurons ved Immunoutfellingsanalyse og Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...