Name: dissecting cell-autonomous function of fragile x mental retardation protein in an auditory circuit by in ovo electroporation
Uploaded: 2022-07-06T15:00:00
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Este estudo foi apoiado por: uma bolsa da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (No. 32000697); o Programa de Ciência e Tecnologia de Guangzhou (202102080139); a Fundação de Ciências Naturais de Guangdong (2019A1515110625, 2021A1515010619); os Fundos de Investigação Fundamental para as Universidades Centrais (11620324); uma Bolsa de Pesquisa do Laboratório Chave de Medicina Regenerativa, Ministério da Educação, Universidade de Jinan (No. ZSYXM202107); os Fundos de Pesquisa Fundamental para as Universidades Centrais da China (21621054); e a Fundação de Pesquisa Científica Médica da Província de Guangdong, na China (20191118142729581). Agradecemos ao centro médico experimental da Universidade de Jinan. Agradecemos ao Dr. Terra Bradley pela cuidadosa edição do manuscrito.

Ovos e embriões de galinha foram manuseados com cuidado e respeito, de acordo com os protocolos de animais aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais da Universidade de Jinan.
1. Preparação de óvulos e plasmídeos
<ol><li>Preparação de ovos<ol><li>Obter ovos de galinha fertilizados frescos (Gallus gallus) da Universidade Agrícola do Sul da China e armazenar a 16 °C antes da incubação. Para uma viabilidade ideal, coloque todos os ovos para incubaç?...

<ol>
	<li>Hagerman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+syndrome.">Fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).</li><li>Hinds, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+expression+of+FMR-1+provides+evidence+for+a+functional+role+in+fragile+X+syndrome.">Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome.</a> Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).</li><li>Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome+FMRP+co-localizes+with+regulatory+targets+PSD-95,+GABA+receptors,+CaMKIIalpha,+and+mGluR5+at+fiber+cell+membranes+in+the+eye+lens.">Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens.</a> Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).</li><li>Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+distribution+of+the+fragile+X+mental+retardation+protein+in+the+mouse+brain.">Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).</li><li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism.">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li><li>Bakker, C. E., Oostra, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+fragile+X+syndrome:+insights+from+animal+models.">Understanding fragile X syndrome: insights from animal models.</a> Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).</li><li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li><li>Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+presynaptic+short-term+plasticity+and+information+processing+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).</li><li>Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+contributions+to+synaptic+and+learning+abnormalities+in+a+mouse+model+of+Fragile+X+syndrome.">Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome.</a> Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).</li><li>Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Audiogenic+seizures+in+the+Fmr1+knock-out+mouse+are+induced+by+Fmr1+deletion+in+subcortical,+VGlut2-expressing+excitatory+neurons+and+require+deletion+in+the+inferior+colliculus.">Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).</li><li>Bland, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+regulates+the+subcellular+distribution+of+cortical+dendritic+spine+density+in+a+non-cell-autonomous+manner.">FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner.</a> Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+induces+synapse+loss+through+acute+postsynaptic+translational+regulation.">Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+is+required+for+synapse+elimination+by+the+activity-dependent+transcription+factor+MEF2.">Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2.</a> Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).</li><li>Deng, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+regulates+neurotransmitter+release+and+synaptic+information+transmission+by+modulating+action+potential+duration+via+BK+channels.">FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels.</a> Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).</li><li>Yang, Y. 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W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+system+development:+primary+auditory+neurons+and+their+targets.">Auditory system development: primary auditory neurons and their targets.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).</li><li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+auditory+brain-stem+nuclei+in+the+chick+hindbrain.">Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain.</a> Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).</li><li>Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+expression+of+Zic+genes+during+vertebrate+inner+ear+development.">Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development.</a> Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. 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W., Bothwell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrkB+downregulation+is+required+for+dendrite+retraction+in+developing+neurons+of+chicken+nucleus+magnocellularis.">TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).</li><li>Wang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+environment+inhibits+cranial+neural+crest+survival+by+activating+excessive+autophagy+in+the+chick+embryo.">High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo.</a> Scientific Reports. 5, 18321 (2015).</li><li>Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+auditory+nerve+fibers+in+the+barn+owl.">Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl.</a> Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).</li><li>Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochleovestibular+nerve+development+is+integrated+with+migratory+neural+crest+cells.">Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells.</a> Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).</li><li>Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+signaling+promotes+axon+segregation+in+the+developing+auditory+system.">EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system.</a> Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).</li><li>Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+neurogenesis+in+the+inner+ear+requires+inhibition+of+Sox2+transcription+by+neurogenin1+and+neurod1.">Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1.</a> Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).</li><li>Curnow, E., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+animal+models+for+understanding+FMRP+functions+and+FXS+pathology.">New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology.</a> Cells. 11 (10), 1628 (2022).</li></ol>

Para determinar a função autônoma celular da FMRP, é necessário manipular sua expressão em grupos celulares individuais ou tipos de células. Uma vez que uma das principais funções da FMRP é regular a formação sináptica e a plasticidade, manipular seletivamente cada componente sináptico de um determinado circuito é pré-requisito para uma compreensão completa do mecanismo FMRP na comunicação sináptica. Utilizando na ovoporação embriões de galinha, demonstramo...

A síndrome do X Frágil (FXS) é um transtorno do neurodesenvolvimento caracterizado por deficiência intelectual, anormalidades sensoriais e comportamentos autistas. Na maioria dos casos, a FXS é causada por uma perda global de proteína de retardo mental X frágil (FMRP; codificada pelo gene Fmr1) a partir dos estágios embrionários iniciais1. A FMRP é uma proteína ligadora de RNA que normalmente é expressa na maioria dos neurônios e células gliais do cérebro, bem como nos órgãos sensoriais 2,3,4. Em cérebros de mamíferos, a FMRP provavelmente está associada a centenas de mRNAs que codificam proteínas importantes para várias atividades neurais5. Estudos de animais knockout Fmr1 convencionais demonstraram que a expressão de FMRP é particularmente importante para a montagem e plasticidade da neurotransmissão sináptica6. Vários modelos de knockout condicional e mosaico demonstraram ainda que as ações e sinais da FMRP variam entre regiões cerebrais, tipos de células e sítios sinápticos durante vários eventos de desenvolvimento, incluindo projeção axonal, padronização dendrítica e plasticidade sináptica 7,8,9,10,11,12,13,14 . A função aguda da PRFM na regulação da transmissão sináptica foi estudada pela liberação intracelular de anticorpos inibitórios da PRFM ou da própria PRFM em cortes cerebrais ou neurônios cultivados15,16,17,18. Esses métodos, no entanto, não oferecem a capacidade de rastrear as consequências induzidas por erros de expressão da FMRP durante o desenvolvimento. Assim, o desenvolvimento de métodos in vivo para investigar as funções autônomas celulares da FMRP é de grande necessidade e espera-se que ajude a determinar se as anomalias relatadas em pacientes com FXS são consequências diretas da perda de FMRP nos neurônios e circuitos associados, ou consequências secundárias derivadas de mudanças em toda a rede durante o desenvolvimento19.
O tronco encefálico auditivo de embriões de galinha oferece um modelo excepcionalmente vantajoso para análises funcionais aprofundadas da regulação da FMRP no desenvolvimento de circuitos e sinapses. O fácil acesso a cérebros de galinhas embrionárias e a técnica bem estabelecida de eletroporação de ovoterapia para manipulação genética contribuíram grandemente para a nossa compreensão do desenvolvimento cerebral em estágios embrionários iniciais. Em estudo recentemente publicado, essa técnica foi combinada com ferramentas moleculares avançadas que permitem o controle temporal da expressão incorreta daPRFM 20,21. Aqui, a metodologia é avançada para induzir manipulações seletivas de neurônios pré-sinápticos e pós-sinápticos separadamente. Este método foi desenvolvido no circuito auditivo de tronco encefálico. O sinal acústico é detectado pelas células ciliadas no ouvido interno auditivo e, em seguida, transportado para o gânglio auditivo (AG; também chamado de gânglio espiral em mamíferos). Os neurônios bipolares no GA inervam as células ciliadas com seus processos periféricos e, por sua vez, enviam uma projeção central (o nervo auditivo) para o tronco encefálico, onde terminam em dois núcleos cocleares primários, o núcleo magnocelular (NM) e o núcleo angularis (NA). Os neurônios no NM são estrutural e funcionalmente comparáveis às células espessas esféricas do núcleo coclear anteroventral de mamíferos. Dentro do NM, as fibras nervosas auditivas (FANs) fazem sinapse na somata dos neurônios NM através do grande bulbo final dos terminais de Held22. Durante o desenvolvimento, os neurônios NM surgem dos rombomeres 5 e 6 (r5/6) no rombencéfalo23, enquanto os neurônios AG são derivados de neuroblastos residentes no otocisto24. Aqui, descrevemos o procedimento para derrubar seletivamente a expressão de FMRP nos neurônios AG pré-sinápticos e nos neurônios NM pós-sinápticos separadamente.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Egg incubation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 &#176;C refrigerator</td>
			<td>MAGAT</td>
			<td></td>
			<td>Used for fertilized egg storage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>SHANGHAI BOXUN</td>
			<td>GZX-9240MBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized eggs</td>
			<td>Farm of South China Agricultural University</td>
			<td></td>
			<td>Eggs must be used in one week for optimal viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1661</td>
			<td>Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi-prep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td>Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Make 7.5M working solution in nuclase-free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation and Doxycycline Administration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>ECM399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL / 5 mL Syringe</td>
			<td>GUANGZHOU KANGFULAI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>CNOPTEC</td>
			<td>SZM-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxcycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td>Use fresh aliquots for each dose and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>BEIBOBOMEI</td>
			<td>RD0910</td>
			<td>0.9-1.1 mm*100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory parafilm</td>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>PM996</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>CHENGDU INSTRUMENT FACTORY</td>
			<td>WD-2</td>
			<td>Pulling condition: 500 &#176;C for 15 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum elctrodes</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum elctrodes</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Dissection and Fixation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td>Tip size: 0.05*0.01 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other surgery tools</td>
			<td>RWD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 &#176;C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW</td>
			<td>01673921</td>
			<td>For black background plates, food-grade carbon powder is applied.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9391</td>
			<td>From bovine skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding microtome</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SM2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150113</td>
			<td>1:500 dilution, RRID: AB_2576208</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150078</td>
			<td>1:500 dilution, RRID: AB_2722519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab285390</td>
			<td>1: 1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>Southern&#160;Biotech</td>
			<td>Sb-0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMRP antibody</td>
			<td>Y. Wang, Florida State University</td>
			<td>#8263</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_2861242</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.3F7</td>
			<td>1:100 dilution, RRID: AB_1157901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4142</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_477272</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parvalbumin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3088</td>
			<td>1:10000 dilution, RRID: AB_477329</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAP25 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab66066</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_2192052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe photoshop</td>
			<td>ADOBE</td>
			<td></td>
			<td>image editing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Image-Pro Plus 7.0</td>
			<td>OlYMPUS</td>
			<td></td>
			<td>commercial image processing software package</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting cell-autonomous function of fragile x mental retardation protein in an auditory circuit by in ovo electroporation

A proteína de retardo mental do X frágil (FMRP) é uma proteína de ligação ao mRNA que regula a tradução de proteínas locais. A perda ou disfunção da FMRP leva a atividades neuronais e sinápticas aberrantes na síndrome do X frágil (FXS), que é caracterizada por deficiência intelectual, anormalidades sensoriais e problemas de comunicação social. Estudos da função da FMRP e da patogênese da FXS foram conduzidos principalmente com o knockout de Fmr1 (o gene que codifica a FMRP) em animais transgênicos. Aqui relatamos um método in vivo para determinar a função autônoma celular da FMRP durante o período de montagem do circuito e formação sináptica usando embriões de galinha. Este método emprega eletroporação específica de estágio, local e direção de um sistema vetorial induzível por droga contendo Fmr1 small hairpin RNA (shRNA) e um repórter EGFP. Com este método, obteve-se o knockdown seletivo da FMRP no gânglio auditivo (GA) e em um de seus alvos do tronco encefálico, o núcleo magnocelular (NM), proporcionando assim uma manipulação componente-específica dentro do circuito AG-NM. Além disso, o padrão de mosaico da transfecção permite controles dentro de animais e comparações de neurônios / fibras vizinhas para maior confiabilidade e sensibilidade na análise de dados. O sistema vetorial induzível fornece controle temporal do início da edição gênica para minimizar os efeitos acumulados no desenvolvimento. A combinação dessas estratégias fornece uma ferramenta inovadora para dissecar a função autônoma celular da FMRP no desenvolvimento sináptico e de circuitos.

Realizando-se em ovo-eletroporação em diferentes locais e em diferentes estágios de desenvolvimento, obteve-se knockdown seletivo da FMRP tanto na periferia auditiva quanto no tronco encefálico auditivo.
Knockdown da FMRP em NM O pequeno RNA hairpin (shRNA) contra a galinha Fmr1 foi projetado e clonado no sistema vetorial Tet-On conforme descrito anteriormente20. A configuração para eletroporação in ovo é mostrada ...

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Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Usando a eletroporação do ovo , desenvolvemos um método para transfectar seletivamente o ouvido interno auditivo e o núcleo coclear em embriões de galinha para alcançar uma derrubada específica do grupo celular da proteína de retardo mental X frágil durante períodos discretos de montagem do circuito.

Dissecando a Função Autônoma Celular da Proteína de Retardo Mental do X Frágil em um Circuito Auditivo por Eletroporação In Ovo

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to ...

Nosso protocolo é um método in vivo para investigar as funções autônomas celulares da FMRP durante o desenvolvimento. Isso pode ajudar a entender a fisiopatologia específica do tipo celular da síndrome do X frágil. Este método emprega eletroporação específica de estágio, local e direção de um sistema vetorial induzível por droga contendo RNA de grampo de cabelo pequeno Fmr1.Com este método, consegue-se o knockdown seletivo da FMRP no circuito auditivo. Este método também pode ser aplicado para investigar a função de outros genes no circuito auditivo ou no sistema vestibular. Comece colocando os ovos horizontalmente para posicionar o embrião na parte superior do óvulo para facilitar a manipulação.Incubar a 38 graus Celsius por 46 a 48 horas até Hamburger e Hamilton, ou HH estágio 12, para transfecção do tubo neural ou por 54 a 56 horas até HH 13 para transfecção de otocistos. Retire os ovos da incubadora, uma dúzia de ovos de cada vez. Manter os ovos fora de sua incubadora por mais de uma hora introduz variações de desenvolvimento e reduz a viabilidade.Use uma lanterna para lançar luz do fundo do ovo. A localização do embrião aparece como uma área escura na casca do ovo. Marque a localização do embrião na casca do ovo com um lápis.Limpe os ovos com gaze contendo etanol a 75% e faça um furo na extremidade pontiaguda dos ovos usando a ponta da tesoura. Em seguida, remova dois mililitros de albumina com uma seringa de agulha de calibre 18. Certifique-se de que o orifício seja grande o suficiente para permitir a inserção da agulha.Limpe qualquer vazamento de albumina com gaze e sele o orifício com fita adesiva. Cubra a parte superior dos ovos com fita adesiva, centrando-se na área escura marcada com lápis para minimizar rachaduras e evitar a queda de detritos de casca durante a janela. Limpe todas as ferramentas de cirurgia com gaze contendo etanol a 75% e limpe a área coberta de fita com etanol a 75%.Use um pequeno par de tesouras para cortar uma janela de um a dois centímetros quadrados ao redor da circunferência da marca de lápis. Segure a tesoura plana para evitar danificar o embrião por baixo. Coloque o ovo em janela sob um estereomicroscópio com uma ocular de 10X e zoom de 2X.Encha uma seringa de um mililitro com a solução de tinta e, em seguida, encaixe uma agulha de calibre 27. Dobre a agulha para um ângulo de 45 graus com pinças. Sob o microscópio, cutuque cuidadosamente a borda da área opaqua e insira a agulha sob o embrião.Injete cerca de 50 microlitros de tinta, que se difundirão abaixo da área pelúcida, para visualização embrionária. A tinta formará um fundo escuro para a visualização clara do embrião. Puxe os capilares de vidro para as pipetas usando um puxador de pipetas.Sob um microscópio de dissecação, abra cuidadosamente a ponta da agulha capilar a 10 a 20 micrômetros de diâmetro com pinça. Armazene as pipetas em uma caixa de armazenamento até o uso. Em seguida, encha uma pipeta capilar com 0,5 a 1 microlitros da mistura plasmídica aplicando pressão negativa através de um tubo de borracha no final da pipeta com uma seringa.Coloque o ovo sob o microscópio para que o embrião seja orientado verticalmente com a cauda perto de você. Segure a pipeta capilar com uma mão ou com o manipulador de três eixos e conduza a ponta da pipeta até ao rombómero 5 a 6. em uma direção da cauda à cabeça.Cutuque suavemente a ponta através da membrana vitelina e no tubo neural dorsal e, em seguida, retire a pipeta um pouco para que a ponta esteja no lúmen do tubo neural. Injetar a mistura plasmídica aplicando pressão de ar até que o plasmídeo colorido se difunda totalmente em rombômero 5 a 6 e se estenda para o rombômero 3 e o rombomere 4. Verifique se há injeção bem-sucedida, o que é conseguido quando a solução de plasmídeo azul se difunde rapidamente pelo tubo neural sem vazar.Quando ocorre vazamento, o azul desaparece rapidamente. Imediatamente após a injeção, coloque um eletrodo bipolar de platina em ambos os lados do tubo neural. Forneça dois pulsos de 12 volts e 50 milissegundos de duração com um eletroporador.Observe bolhas de ar nas extremidades do eletrodo bipolar, com mais no lado negativo. Verifique se há eletroporação bem-sucedida, que é alcançada quando a mistura de plasmídeos coloridos entra no tecido do tubo neural perto do lado positivo do eletrodo. Após a eletroporação, remova cuidadosamente o eletrodo bipolar.Cubra a janela na casca do ovo com um pedaço de filme transparente pré-cortado em quadrados de duas polegadas e pulverizado com etanol a 75%. Coloque o ovo de volta em sua incubadora. Limpe o eletrodo bipolar entregando 10 a 20 pulsos de 12 volts e 50 milissegundos de duração em solução salina antes de prosseguir para o próximo ovo.Sob o microscópio, coloque o ovo de tal forma que o embrião seja vertical com a cauda perto de você. Segure a pipeta capilar e cutuque suavemente o otocisto direito na direção dorsolateral. Injete a mistura plasmídica com pressão de ar até que o otocisto seja preenchido com solução azul.Verifique se há uma injeção bem-sucedida, que é alcançada quando a mistura de plasmídeo azul está confinada dentro do otocisto e não vaza. Imediatamente após a injeção, coloque o eletrodo bipolar no otocisto e posicione os lados positivo e negativo anterior e posterior ao otocisto, respectivamente. Forneça dois pulsos de 12 volts e 50 milissegundos de duração com o eletroporador.Verifique se há eletroporação bem-sucedida, que é alcançada quando a mistura de plasmídeo azul entra no tecido do otocisto perto do lado positivo do eletrodo. Após a eletroporação, remova cuidadosamente o eletrodo bipolar e cubra a janela na casca do ovo com um filme transparente. Finalmente, devolva o ovo à incubadora.A imagem representativa mostra um exemplo de embrionário do terceiro dia, ou E3, após transfecção de tubo neuro e tratamento dox no segundo dia embrionário, ou E2. Células transfectadas com fmr1 shRNA e EGFP na seção transversal são mostradas aqui. As células que expressam EGFP foram confinadas a um lado do tubo neural e do tronco encefálico. Uma seção transversal em E15 com núcleo magnocelular que expressa EGFP, ou neurônios NM, no lado transfectado é mostrada aqui.No lado contralateral, axônios contendo EGFP foram observados na porção ventral do núcleo laminar, ou NL. O efeito knockdown do shRNA Fmr1 foi validado por reduções acentuadas na imunorreatividade da FMRP em neurônios NM transfectados em comparação com neurônios vizinhos não transfectados. O gânglio auditivo em E19 com imunorreatividade da FMRP é mostrado aqui. Os neurônios ganglionares auditivos não foram transfectados.Algumas células gliais derivadas das células da crista neural craniana foram transfectadas. As imagens representativas mostram o knock-down da FMRP no ducto auditivo após a transfecção do otocisto. Os ductos auditivos em E9 apresentaram extensa fluorescência do EGFP.Nos cortes transversais, as células expressas de EGFP localizavam-se na papila basilar e no gânglio auditivo. O efeito knockdown do shRNA Fmr1 foi validado pela redução da imunorreatividade da FMRP em células ciliadas transfectadas em comparação com células ciliadas vizinhas não transfectadas. Da mesma forma, a imunorreatividade da FMRP foi amplamente diminuída nos neurônios ganglionares auditivos transfectados.A projeção central dos neurônios ganglionares auditivos transfectados foi rastreada até o tronco encefálico através do nervo auditivo com terminais de bulbo final caracterizados. Ao tentar este procedimento, o mais importante é controlar o local e a direção da eletroporação para transfecção seletiva. Após este procedimento, o preenchimento do tipo célula única, a imunocoloração, a classificação celular seguida de espectro de massa ou o sequenciamento de célula única podem ser realizados para revelar as alterações em níveis morfológicos e bioquímicos.Essa técnica também possibilita a edição seletiva de outros genes com controle temporal e especificidade de componentes na orelha auditiva para circuitos de caule e pode ser modificada para manipular o sistema vestibular.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

No útero Eletroporação seguido por Cultura Neuronal primário para estudar a função do gene no subconjunto dos neurônios corticais

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Neurociência

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

TMS: Usando o protocolo Theta-Burst para Explorar Mechasnism de Plasticidade em Indivíduos com Síndrome do X Frágil e Autismo

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfecção de células de camundongo por Ganglionares da Retina In vivo Eletroporação

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

Na eletroporação in ovo em Midbrain pintainho para estudar a função do gene em dopaminérgico Desenvolvimento Neuron

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Em Eletroporação ovo de miRNA-base de plasmídeos no Tubo Neural Desenvolvimento e Avaliação de Fenótipos por Dil Injeção em livro aberto Preparações

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Investigações sobre alterações da função Circuito Hippocampal Após lesão cerebral traumática leve

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

Em Expression in ovo de microRNA em Ventral Pintinho Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

Um leve, sistema de fones baseado para manipular feedback auditivo em Songbirds

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Detecção de palmitoylation proteína em neurônios cultivados por imunoprecipitação e Acil-Biotina Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

Registro e análise dos ritmos circadianos em Running rodas Atividade em Roedores

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...