Name: dissecting cell-autonomous function of fragile x mental retardation protein in an auditory circuit by in ovo electroporation
Uploaded: 2022-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation at JoVE.com

Это исследование было поддержано: грантом Национального фонда естественных наук Китая (No 32000697); Научно-техническая программа Гуанчжоу (202102080139); Гуандунский фонд естественных наук (2019A1515110625, 2021A1515010619); Фонды фундаментальных исследований центральных университетов (11620324); Исследовательский грант Ключевой лаборатории регенеративной медицины, Министерство образования, Университет Цзинань (No. ZSYXM202107); Фонды фундаментальных исследований для центральных университетов Китая (21621054); и Фонд медицинских научных исследований китайской провинции Гуандун (20191118142729581). Благодарим медицинский экспериментальный центр Университета Цзинань. Мы благодарим доктора Терру Брэдли за тщательное редактирование рукописи.

Яйца и куриные эмбрионы обрабатывались с осторожностью и уважением в соответствии с протоколами для животных, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Университета Цзинань.
1. Препарат яиц и плазмид
<ol><li>Приготовление яиц<ol><li>Получите свежие ?...

<ol>
	<li>Hagerman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+syndrome.">Fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).</li><li>Hinds, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+expression+of+FMR-1+provides+evidence+for+a+functional+role+in+fragile+X+syndrome.">Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome.</a> Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).</li><li>Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome+FMRP+co-localizes+with+regulatory+targets+PSD-95,+GABA+receptors,+CaMKIIalpha,+and+mGluR5+at+fiber+cell+membranes+in+the+eye+lens.">Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens.</a> Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).</li><li>Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+distribution+of+the+fragile+X+mental+retardation+protein+in+the+mouse+brain.">Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).</li><li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism.">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li><li>Bakker, C. E., Oostra, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+fragile+X+syndrome:+insights+from+animal+models.">Understanding fragile X syndrome: insights from animal models.</a> Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).</li><li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li><li>Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+presynaptic+short-term+plasticity+and+information+processing+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).</li><li>Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+target+cell-specific+role+for+presynaptic+Fmr1+in+regulating+glutamate+release+onto+neocortical+fast-spiking+inhibitory+neurons.">A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).</li><li>Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+FMRP+promotes+the+pruning+of+cell-to-cell+connections+among+pyramidal+neurons+in+the+L5A+neocortical+network.">Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network.</a> Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).</li><li>Higashimori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+deletion+of+astroglial+FMRP+dysregulates+glutamate+transporter+GLT1+and+contributes+to+Fragile+X+syndrome+phenotypes+in+vivo.">Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).</li><li>Hodges, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+contributions+to+synaptic+and+learning+abnormalities+in+a+mouse+model+of+Fragile+X+syndrome.">Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome.</a> Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).</li><li>Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Audiogenic+seizures+in+the+Fmr1+knock-out+mouse+are+induced+by+Fmr1+deletion+in+subcortical,+VGlut2-expressing+excitatory+neurons+and+require+deletion+in+the+inferior+colliculus.">Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).</li><li>Bland, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+regulates+the+subcellular+distribution+of+cortical+dendritic+spine+density+in+a+non-cell-autonomous+manner.">FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner.</a> Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+induces+synapse+loss+through+acute+postsynaptic+translational+regulation.">Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+is+required+for+synapse+elimination+by+the+activity-dependent+transcription+factor+MEF2.">Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2.</a> Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).</li><li>Deng, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+regulates+neurotransmitter+release+and+synaptic+information+transmission+by+modulating+action+potential+duration+via+BK+channels.">FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels.</a> Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).</li><li>Yang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+molecular+locus+for+normalizing+dysregulated+GABA+release+from+interneurons+in+the+Fragile+X+brain.">Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain.</a> Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).</li><li>Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+studies+in+fragile+X+syndrome.">Developmental studies in fragile X syndrome.</a> Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).</li><li>Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+FMRP+regulates+synaptogenesis+in+vivo+in+the+developing+cochlear+nucleus.">Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-specific+roles+of+fragile+X+mental+retardation+protein+in+the+development+of+the+hindbrain+auditory+circuit.">Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit.</a> Development. 147 (21), (2020).</li><li>Rubel, E. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+system+development:+primary+auditory+neurons+and+their+targets.">Auditory system development: primary auditory neurons and their targets.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).</li><li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+auditory+brain-stem+nuclei+in+the+chick+hindbrain.">Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain.</a> Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).</li><li>Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+expression+of+Zic+genes+during+vertebrate+inner+ear+development.">Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development.</a> Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+the+chicken+auditory+brainstem.">In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).</li><li>Evsen, L., Doetzlhofer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+the+chicken+auditory+organ+by+in+ovo+micro-electroporation.">Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).</li><li>Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrkB+downregulation+is+required+for+dendrite+retraction+in+developing+neurons+of+chicken+nucleus+magnocellularis.">TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).</li><li>Wang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+environment+inhibits+cranial+neural+crest+survival+by+activating+excessive+autophagy+in+the+chick+embryo.">High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo.</a> Scientific Reports. 5, 18321 (2015).</li><li>Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+fragile+X+mental+retardation+protein+correlates+with+cellular+and+synaptic+properties+in+primary+auditory+neurons+following+afferent+deprivation.">Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet-1+expression+in+the+developing+chicken+inner+ear.">Islet-1 expression in the developing chicken inner ear.</a> Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).</li><li>Carr, C. E., Boudreau, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+auditory+nerve+fibers+in+the+barn+owl.">Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl.</a> Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).</li><li>Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochleovestibular+nerve+development+is+integrated+with+migratory+neural+crest+cells.">Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells.</a> Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).</li><li>Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+signaling+promotes+axon+segregation+in+the+developing+auditory+system.">EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system.</a> Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).</li><li>Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+neurogenesis+in+the+inner+ear+requires+inhibition+of+Sox2+transcription+by+neurogenin1+and+neurod1.">Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1.</a> Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).</li><li>Curnow, E., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+animal+models+for+understanding+FMRP+functions+and+FXS+pathology.">New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology.</a> Cells. 11 (10), 1628 (2022).</li></ol>

Для определения клеточно-автономной функции FMRP необходимо манипулировать его экспрессией в отдельных клеточных группах или типах клеток. Поскольку одной из основных функций FMRP является регулирование синаптического образования и пластичности, избирательное манипу?...

Синдром хрупкой Х (FXS) — это расстройство нервного развития, характеризующееся умственной отсталостью, сенсорными аномалиями и аутистическим поведением. В большинстве случаев FXS вызван глобальной потерей хрупкого белка умственной отсталости X (FMRP; кодируется геном Fmr1), начиная с ранних эмбриональных стадий1. FMRP представляет собой РНК-связывающий белок, который обычно экспрессируется в большинстве нейронов и глиальных клеток головного мозга, а также ворганах чувств 2,3,4. В мозге млекопитающих FMRP, вероятно, связан с сотнями мРНК, которые кодируют белки, важные для различных нейронных активностей5. Исследования обычных нокаутирующих животных Fmr1 показали, что экспрессия FMRP особенно важна для сборки и пластичности синаптической нейротрансмиссии6. Несколько условных и мозаичных нокаутных моделей дополнительно продемонстрировали, что действия и сигналы FMRP варьируются в разных областях мозга, типах клеток и синаптических участках во время нескольких событий развития, включая аксональную проекцию, дендритный паттерн и синаптическую пластичность 7,8,9,10,11,12,13,14 . Острая функция FMRP в регуляции синаптической передачи изучалась внутриклеточной доставкой ингибирующих антител FMRP или самой FMRP в срезах мозга или культивируемых нейронах 15,16,17,18. Эти методы, однако, не дают возможности отслеживать последствия, вызванные неправильной экспрессией FMRP, во время развития. Таким образом, разработка методов in vivo для исследования клеточно-автономных функций FMRP очень необходима и, как ожидается, поможет определить, являются ли зарегистрированные аномалии у пациентов с FXS прямыми последствиями потери FMRP в ассоциированных нейронах и цепях или вторичными последствиями, полученными из общесетевых изменений во время развития19.
Слуховой ствол мозга куриных эмбрионов предлагает уникально выгодную модель для углубленного функционального анализа регуляции FMRP в цепном и синапсовом развитии. Легкий доступ к эмбриональному куриному мозгу и хорошо зарекомендовавшая себя техника электропорации в ово для генетических манипуляций в значительной степени способствовали нашему пониманию развития мозга на ранних эмбриональных стадиях. В недавно опубликованном исследовании этот метод был объединен с передовыми молекулярными инструментами, которые позволяют временно контролировать неправильную экспрессию FMRP20,21. Здесь усовершенствована методология индуцирования селективных манипуляций с пресинаптическими и постсинаптическими нейронами по отдельности. Этот метод был разработан в слуховой цепи ствола мозга. Акустический сигнал обнаруживается волосковыми клетками в слуховом внутреннем ухе, а затем передается в слуховой ганглий (AG; также называемый спиральным ганглием у млекопитающих). Биполярные нейроны в АГ иннервируют волосковые клетки своими периферическими отростками и, в свою очередь, посылают центральную проекцию (слуховой нерв) в ствол мозга, где они заканчиваются двумя первичными кохлеарными ядрами, ядром magnocellularis (NM) и ядром angularis (NA). Нейроны в НМ структурно и функционально сопоставимы со сферическими кустистыми клетками антеровентрального кохлеарного ядра млекопитающих. В NM, слуховые нервные волокна (ANF) синапс на соматах nm нейронов через большую конечную бульбу Held terminals22. Во время развития нейроны NM возникают из ромбомеров 5 и 6 (r5/6) в заднем мозге23, в то время как нейроны AG получены из нейробластов, находящихся в отоцисте24. Здесь мы описываем процедуру селективного сбивания экспрессии FMRP в пресинаптических нейронах AG и в постсинаптических нейронах NM по отдельности.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Egg incubation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 &#176;C refrigerator</td>
			<td>MAGAT</td>
			<td></td>
			<td>Used for fertilized egg storage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>SHANGHAI BOXUN</td>
			<td>GZX-9240MBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized eggs</td>
			<td>Farm of South China Agricultural University</td>
			<td></td>
			<td>Eggs must be used in one week for optimal viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1661</td>
			<td>Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi-prep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td>Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Make 7.5M working solution in nuclase-free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation and Doxycycline Administration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>ECM399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL / 5 mL Syringe</td>
			<td>GUANGZHOU KANGFULAI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>CNOPTEC</td>
			<td>SZM-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxcycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td>Use fresh aliquots for each dose and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>BEIBOBOMEI</td>
			<td>RD0910</td>
			<td>0.9-1.1 mm*100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory parafilm</td>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>PM996</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>CHENGDU INSTRUMENT FACTORY</td>
			<td>WD-2</td>
			<td>Pulling condition: 500 &#176;C for 15 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum elctrodes</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum elctrodes</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Dissection and Fixation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td>Tip size: 0.05*0.01 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other surgery tools</td>
			<td>RWD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 &#176;C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW</td>
			<td>01673921</td>
			<td>For black background plates, food-grade carbon powder is applied.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9391</td>
			<td>From bovine skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding microtome</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SM2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150113</td>
			<td>1:500 dilution, RRID: AB_2576208</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150078</td>
			<td>1:500 dilution, RRID: AB_2722519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab285390</td>
			<td>1: 1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>Southern&#160;Biotech</td>
			<td>Sb-0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMRP antibody</td>
			<td>Y. Wang, Florida State University</td>
			<td>#8263</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_2861242</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.3F7</td>
			<td>1:100 dilution, RRID: AB_1157901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4142</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_477272</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parvalbumin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3088</td>
			<td>1:10000 dilution, RRID: AB_477329</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAP25 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab66066</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_2192052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe photoshop</td>
			<td>ADOBE</td>
			<td></td>
			<td>image editing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Image-Pro Plus 7.0</td>
			<td>OlYMPUS</td>
			<td></td>
			<td>commercial image processing software package</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting cell-autonomous function of fragile x mental retardation protein in an auditory circuit by in ovo electroporation

Хрупкий белок умственной отсталости X (FMRP) является мРНК-связывающим белком, который регулирует локальную трансляцию белка. Потеря или дисфункция FMRP приводит к аберрантной нейрональной и синаптической активности при синдроме хрупкого X (FXS), который характеризуется умственной отсталостью, сенсорными аномалиями и проблемами социальной коммуникации. Исследования функции FMRP и патогенеза FXS в основном проводились с нокаутом Fmr1 (ген, кодирующий FMRP) у трансгенных животных. Здесь мы сообщаем о методе in vivo для определения клеточно-автономной функции FMRP в период сборки цепи и синаптического образования с использованием куриных эмбрионов. Этот метод использует стадийную, участковую и направленную электропорацию векторной системы, индуцируемой лекарственным средством, содержащей небольшую шпильковую РНК Fmr1 (шРНК) и репортер EGFP. С помощью этого метода мы достигли селективного нокдауна FMRP в слуховом ганглии (AG) и в одной из его мишеней ствола мозга, ядре magnocellularis (NM), тем самым обеспечивая компонентно-специфическую манипуляцию в цепи AG-NM. Кроме того, мозаичный рисунок трансфекции позволяет проводить внутри животных контроль и сравнение соседних нейронов / волокон для повышения надежности и чувствительности при анализе данных. Индуцируемая векторная система обеспечивает временной контроль начала редактирования генов, чтобы свести к минимуму накапливающиеся эффекты развития. Сочетание этих стратегий обеспечивает инновационный инструмент для препарирования клеточно-автономной функции FMRP в синаптическом и схемном развитии.

Выполняя электропорацию ово на разных участках и на разных стадиях развития, мы добились селективного нокдауна FMRP либо на слуховой периферии, либо в слуховом стволе мозга.
Нокдаун FMRP в NM Малая шпилька РНК (шРНК) против курицы Fmr1 была разработана и клон...

Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation at JoVE.com

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Используя электропорацию ово , мы разработали метод селективной трансфекции слухового внутреннего уха и кохлеарного ядра у куриных эмбрионов для достижения специфического для клеточной группы нокдауна хрупкого белка умственной отсталости X в течение дискретных периодов сборки цепи.

Рассечение клеточно-автономной функции хрупкого белка умственной отсталости X в слуховой цепи с помощью электропорации In Ovo

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to ...

Наш протокол представляет собой метод in vivo для исследования клеточно-автономных функций FMRP во время разработки. Это может помочь понять специфическую для типа клетки патофизиологию синдрома хрупкой Х. Этот метод использует стадийную, участковую и направленно-специфическую электропорацию лекарственно-индуцируемой векторной системы, содержащей небольшую РНК Шпильки Fmr1.С помощью этого метода мы достигаем селективного нокдауна FMRP в слуховом контуре. Этот метод также может быть применен для исследования функции других генов в слуховом контуре или вестибулярной системе. Начните с размещения яиц горизонтально, чтобы расположить эмбрион на верхней части яйца для легкой манипуляции.Инкубируют при 38 градусах Цельсия в течение 46-48 часов до Гамбургера и Гамильтона, или стадии HH 12, для трансфекции нервной трубки или в течение 54-56 часов до HH 13 для трансфекции отоцисты. Извлекайте яйца из инкубатора, по дюжине яиц за раз. Удержание яиц вне инкубатора в течение более одного часа приводит к изменениям в развитии и снижает жизнеспособность.Используйте фонарик, чтобы бросить свет со дна яйца. Расположение эмбриона выглядит как темная область на яичной скорлупе. Отметьте расположение эмбриона на яичной скорлупе карандашом.Протрите яйца марлей, содержащей 75% этанола, и просверлите отверстие в заостренном конце яиц кончиком ножниц. Затем удалите два миллилитра альбумина с помощью игольчатого шприца 18-го калибра. Убедитесь, что отверстие достаточно большое, чтобы можно было вставить иглу.Протрите любой протекающий альбумин марлей и заклейте отверстие прозрачной лентой. Накройте верхнюю часть яиц прозрачной лентой, центрируясь на темной области, отмеченной карандашом, чтобы свести к минимуму трещины и предотвратить падение мусора скорлупы во время окна. Протрите все хирургические инструменты марлей, содержащей 75% этанола, и протрите покрытую лентой область 75% этанолом.Используйте небольшую пару ножниц, чтобы вырезать окно площадью от одного до двух квадратных сантиметров по окружности карандашной метки. Держите ножницы плоскими, чтобы не повредить эмбрион под ними. Поместите оконное яйцо под стереомикроскоп с 10-кратным окуляром и 2-кратным зумом.Наполните одномиллилитровой шприц раствором чернил, а затем поместите иглу 27-го калибра. Согните иглу под углом 45 градусов щипцами. Под микроскопом осторожно ткните от края области опакувы и вставьте иглу под эмбрион.Введите около 50 микролитров чернил, которые будут диффундировать ниже области пеллюцида, для визуализации эмбриона. Чернила образуют темный фон для четкой визуализации эмбриона. Втяните стеклянные капилляры в пипетки с помощью съемника пипетки.Под рассекающим микроскопом осторожно откройте кончик капиллярной иглы до 10 – 20 микрометров в диаметре с помощью щипцов. Храните пипетки в ящике для хранения до использования. Затем заполните капиллярную пипетку 0,5-1 микролитром плазмидной смеси, применяя отрицательное давление через резиновую трубку на конце пипетки шприцем.Поместите яйцеклетку под микроскоп так, чтобы эмбрион был вертикально ориентирован с хвостом рядом с вами. Держите капиллярную пипетку одной рукой или трехосевым манипулятором и приведите кончик пипетки к ромбомеру от 5 до 6. в направлении «хвост к голове».Осторожно просуните наконечник через вителлиновую мембрану в дорсальную нервную трубку, а затем немного выньте пипетку, чтобы кончик находился в просвете нервной трубки. Вводят плазмидную смесь, применяя давление воздуха до тех пор, пока тонированная плазмида полностью не диффундирует в ромбомер 5-6 и не распространится на ромбомер 3 и ромбомер 4. Проверьте успешную инъекцию, которая достигается, когда раствор синей плазмиды быстро диффундирует вниз по нервной трубке без утечки.Когда происходит утечка, синий быстро исчезает. Сразу после инъекции поместите платиновый биполярный электрод по обе стороны нервной трубки. Подайте два импульса длительностью 12 вольт и продолжительностью 50 миллисекунд с помощью электропоратора.Наблюдайте пузырьки воздуха на концах биполярного электрода, с большим количеством на отрицательной стороне. Проверьте успешную электропорацию, которая достигается, когда тонированная плазмидная смесь попадает в ткань нервной трубки вблизи положительной стороны электрода. После электропорации осторожно извлеките биполярный электрод.Накройте окно на яичной скорлупе куском прозрачной пленки, предварительно нарезанной на двухдюймовые квадраты и опрысканной 75% этанолом. Поместите яйцо обратно в инкубатор. Очистите биполярный электрод, подав от 10 до 20 импульсов продолжительностью 12 вольт и 50 миллисекунд в физиологическом растворе, прежде чем перейти к следующему яйцу.Под микроскоп поместите яйцеклетку таким образом, чтобы эмбрион находился вертикально с хвостом рядом с вами. Держите капиллярную пипетку и аккуратно ткните правой отоцистой в дорсолатеральном направлении. Вводят плазмидную смесь давлением воздуха до тех пор, пока отоциста не наполнится синим раствором.Проверьте успешную инъекцию, которая достигается, когда синяя плазмидная смесь ограничена отоцистой и не протекает. Сразу после инъекции поместите биполярный электрод на отоцисту и расположите положительную и отрицательную стороны спереди и сзади к отоцисте соответственно. Подайте два импульса длительностью 12 вольт и продолжительностью 50 миллисекунд с помощью электропоратора.Проверьте успешность электропорации, которая достигается, когда смешение синей плазмиды попадает в ткань отоцисты вблизи положительной стороны электрода. После электропорации аккуратно снимите биполярный электрод и накройте окно на яичной скорлупе прозрачной пленкой. Наконец, верните яйцо в инкубатор.Репрезентативное изображение показывает пример эмбрионального третьего дня, или E3, после трансфекции нейротрубки и лечения доксом на эмбриональный день два, или E2. Трансфектированные клетки с fmr1 шРНК и EGFP на поперечном сечении показаны здесь. EGFP-экспрессирующие клетки были ограничены одной стороной нервной трубки и стволом мозга. Поперечное сечение на E15 с EGFP-экспрессирующим ядром magnocellularis, или NM-нейронами, на трансфектированной стороне показано здесь.На контралатеральной стороне EGFP-содержащие аксоны были замечены в вентральной части ядра laminaris, или NL. Эффект нокдауна шРНК Fmr1 был подтвержден выраженным снижением иммунореактивности FMRP в трансфектированных нейронах NM по сравнению с соседними нетрансфектированными нейронами. Слуховой ганглий на E19 с иммунореактивностью FMRP показан здесь. Слуховые ганглиозные нейроны не были трансфектированы.Некоторые глиальные клетки, полученные из клеток черепного нервного гребня, были трансфектированы. Репрезентативные изображения показывают нокдаун FMRP в слуховом протоке после трансфекции отоциста. Слуховые протоки на E9 демонстрировали обширную флуоресценцию EGFP.На поперечных срезах EGFP-экспрессирующие клетки располагались в базилярном сосочке и слуховом ганглии. Эффект нокдауна ШРНК Fmr1 был подтвержден снижением иммунореактивности FMRP в трансфектированных волосковых клетках по сравнению с соседними нетрансфектными волосковыми клетками. Аналогичным образом, иммунореактивность FMRP была в значительной степени снижена в трансфектированных слуховых ганглиозных нейронах.Центральная проекция трансфектированных слуховых ганглиозных нейронов отслеживалась до ствола мозга через слуховой нерв с характерными концевыми окончаниями. При попытке этой процедуры самым важным является контроль места и направления электропорации для селективной трансфекции. После этой процедуры может быть выполнено заполнение одного типа клеток, иммуноокрашивание, сортировка клеток с последующим массовым спектром или секвенирование одиночных клеток для выявления изменений на морфологическом и биохимическом уровнях.Этот метод также позволяет селективно редактировать другие гены с временным контролем и специфичностью компонентов в слуховом ухе для стволовых цепей и может быть модифицирован для манипулирования вестибулярной системой.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

Внутриутробное Электропорация последующей первичной нейронов культуры для изучения функции генов в Подмножество корковых нейронов

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

TMS: Используя тета-съемки протокол к Исследуйте Mechasnism пластичности у лиц с синдромом хрупкой Х и аутизм

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Трансфекция Мышь ганглиозных клеток сетчатки при В естественных условиях Электропорация

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

В ово Электропорация в Chick мозга для изучения функции генов в развитии дофаминергической Нейрон

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

В ово Electroporation микроРНК основе плазмид в развивающихся нервной трубки и оценки фенотипов по DiI инъекций в открытом книгу Препараты

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Исследования О внесении изменений гиппокампа Функция Circuit после легкой черепно-мозговой травмой

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

В ово выражения микроРНК в Брюшной Chick мозга

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

Легкий, наушники-администратора системы для управления Звуковая обратная связь в Певчие птицы

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Обнаружение белка Palmitoylation в культуре нейронов гиппокампа на Иммунопреципитация и ацил-биотин бирже (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

Запись и анализ циркадных ритмов в рабочем колеса деятельность в Грызуны

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...