Name: dissecting cell-autonomous function of fragile x mental retardation protein in an auditory circuit by in ovo electroporation
Uploaded: 2022-07-06T15:00:00
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Este estudio contó con el apoyo de: una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (Nº 32000697); el Programa de Ciencia y Tecnología de Guangzhou (202102080139); la Fundación de Ciencias Naturales de Guangdong (2019A1515110625, 2021A1515010619); los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales (11620324); una beca de investigación del Laboratorio Clave de Medicina Regenerativa, Ministerio de Educación, Universidad de Jinan (No. ZSYXM202107); los Fondos de Investigación Fundamental para las Universidades Centrales de China (21621054); y la Fundación de Investigación Científica Médica de la provincia china de Guangdong (20191118142729581). Agradecemos al centro médico experimental de la Universidad de Jinan. Agradecemos a la Dra. Terra Bradley por la cuidadosa edición del manuscrito.

Los huevos y los embriones de pollo se manejaron con cuidado y respeto de acuerdo con los protocolos animales aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Jinan.
1. Preparación de huevos y plásmidos
<ol><li>Preparación del huevo<ol><li>Obtenga huevos de gallina fertilizados frescos (Gallus gallus) de la Universidad Agrícola del Sur de China y guárdelos a 16 ° C antes de la incubación. Para una viabilidad óptima, coloque todos lo...

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	<li>Hagerman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+syndrome.">Fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).</li><li>Hinds, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+expression+of+FMR-1+provides+evidence+for+a+functional+role+in+fragile+X+syndrome.">Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome.</a> Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).</li><li>Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome+FMRP+co-localizes+with+regulatory+targets+PSD-95,+GABA+receptors,+CaMKIIalpha,+and+mGluR5+at+fiber+cell+membranes+in+the+eye+lens.">Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens.</a> Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).</li><li>Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+distribution+of+the+fragile+X+mental+retardation+protein+in+the+mouse+brain.">Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).</li><li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism.">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li><li>Bakker, C. E., Oostra, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+fragile+X+syndrome:+insights+from+animal+models.">Understanding fragile X syndrome: insights from animal models.</a> Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).</li><li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li><li>Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+presynaptic+short-term+plasticity+and+information+processing+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).</li><li>Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+FMRP+promotes+the+pruning+of+cell-to-cell+connections+among+pyramidal+neurons+in+the+L5A+neocortical+network.">Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network.</a> Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).</li><li>Higashimori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+deletion+of+astroglial+FMRP+dysregulates+glutamate+transporter+GLT1+and+contributes+to+Fragile+X+syndrome+phenotypes+in+vivo.">Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).</li><li>Hodges, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+contributions+to+synaptic+and+learning+abnormalities+in+a+mouse+model+of+Fragile+X+syndrome.">Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome.</a> Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).</li><li>Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Audiogenic+seizures+in+the+Fmr1+knock-out+mouse+are+induced+by+Fmr1+deletion+in+subcortical,+VGlut2-expressing+excitatory+neurons+and+require+deletion+in+the+inferior+colliculus.">Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).</li><li>Bland, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+regulates+the+subcellular+distribution+of+cortical+dendritic+spine+density+in+a+non-cell-autonomous+manner.">FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner.</a> Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+induces+synapse+loss+through+acute+postsynaptic+translational+regulation.">Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+is+required+for+synapse+elimination+by+the+activity-dependent+transcription+factor+MEF2.">Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2.</a> Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).</li><li>Deng, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+regulates+neurotransmitter+release+and+synaptic+information+transmission+by+modulating+action+potential+duration+via+BK+channels.">FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels.</a> Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).</li><li>Yang, Y. 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W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+system+development:+primary+auditory+neurons+and+their+targets.">Auditory system development: primary auditory neurons and their targets.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).</li><li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+auditory+brain-stem+nuclei+in+the+chick+hindbrain.">Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain.</a> Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).</li><li>Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+expression+of+Zic+genes+during+vertebrate+inner+ear+development.">Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development.</a> Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+the+chicken+auditory+brainstem.">In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).</li><li>Evsen, L., Doetzlhofer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+the+chicken+auditory+organ+by+in+ovo+micro-electroporation.">Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).</li><li>Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrkB+downregulation+is+required+for+dendrite+retraction+in+developing+neurons+of+chicken+nucleus+magnocellularis.">TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).</li><li>Wang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+environment+inhibits+cranial+neural+crest+survival+by+activating+excessive+autophagy+in+the+chick+embryo.">High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo.</a> Scientific Reports. 5, 18321 (2015).</li><li>Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+fragile+X+mental+retardation+protein+correlates+with+cellular+and+synaptic+properties+in+primary+auditory+neurons+following+afferent+deprivation.">Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet-1+expression+in+the+developing+chicken+inner+ear.">Islet-1 expression in the developing chicken inner ear.</a> Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).</li><li>Carr, C. E., Boudreau, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+auditory+nerve+fibers+in+the+barn+owl.">Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl.</a> Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).</li><li>Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochleovestibular+nerve+development+is+integrated+with+migratory+neural+crest+cells.">Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells.</a> Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).</li><li>Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+signaling+promotes+axon+segregation+in+the+developing+auditory+system.">EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system.</a> Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).</li><li>Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+neurogenesis+in+the+inner+ear+requires+inhibition+of+Sox2+transcription+by+neurogenin1+and+neurod1.">Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1.</a> Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).</li><li>Curnow, E., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+animal+models+for+understanding+FMRP+functions+and+FXS+pathology.">New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology.</a> Cells. 11 (10), 1628 (2022).</li></ol>

Para determinar la función autónoma celular de FMRP, es necesario manipular su expresión en grupos celulares individuales o tipos de células. Dado que una de las principales funciones de FMRP es regular la formación sináptica y la plasticidad, la manipulación selectiva de cada componente sináptico de un determinado circuito es un requisito previo para una comprensión completa del mecanismo FMRP en la comunicación sináptica. Usando electroporación in ovo de embriones d...

El síndrome X frágil (SXF) es un trastorno del neurodesarrollo caracterizado por discapacidad intelectual, anomalías sensoriales y comportamientos autistas. En la mayoría de los casos, el SXF es causado por una pérdida global de la proteína X frágil de retraso mental (FMRP; codificada por el gen Fmr1) que comienza en las primeras etapas embrionarias1. FMRP es una proteína de unión al ARN que normalmente se expresa en la mayoría de las neuronas y células gliales en el cerebro, así como en los órganos sensoriales 2,3,4. En los cerebros de mamíferos, la FMRP probablemente está asociada con cientos de ARNm que codifican proteínas que son importantes para diversas actividades neuronales5. Estudios de animales knockout convencionales Fmr1 demostraron que la expresión de FMRP es particularmente importante para el ensamblaje y la plasticidad de la neurotransmisión sináptica6. Varios modelos de knockout condicional y mosaico han demostrado además que las acciones y señales de FMRP varían según las regiones cerebrales, los tipos de células y los sitios sinápticos durante varios eventos de desarrollo, incluida la proyección axonal, el patrón dendrítico y la plasticidad sináptica 7,8,9,10,11,12,13,14 . La función aguda de FMRP en la regulación de la transmisión sináptica fue estudiada por la administración intracelular de anticuerpos inhibidores de FMRP o FMRP en cortes cerebrales o neuronas cultivadas15,16,17,18. Estos métodos, sin embargo, no ofrecen la capacidad de rastrear las consecuencias inducidas por la expresión errónea de FMRP durante el desarrollo. Por lo tanto, el desarrollo de métodos in vivo para investigar las funciones autónomas celulares de FMRP está en gran necesidad, y se espera que ayude a determinar si las anomalías reportadas en pacientes con FXS son consecuencias directas de la pérdida de FMRP en las neuronas y circuitos asociados, o consecuencias secundarias derivadas de cambios en toda la red durante el desarrollo19.
El tronco cerebral auditivo de embriones de pollo ofrece un modelo excepcionalmente ventajoso para análisis funcionales en profundidad de la regulación FMRP en el desarrollo de circuitos y sinapsis. El fácil acceso a los cerebros embrionarios de pollo y la bien establecida técnica de electroporación in ovo para la manipulación genética han contribuido en gran medida a nuestra comprensión del desarrollo cerebral en las primeras etapas embrionarias. En un estudio recientemente publicado, esta técnica se combinó con herramientas moleculares avanzadas que permiten el control temporal de la expresión errónea de FMRP20,21. Aquí, la metodología es avanzada para inducir manipulaciones selectivas de neuronas presinápticas y postsinápticas por separado. Este método fue desarrollado en el circuito auditivo del tronco encefálico. La señal acústica es detectada por las células ciliadas en el oído interno auditivo y luego transportada al ganglio auditivo (AG; también llamado ganglio espiral en mamíferos). Las neuronas bipolares en el AG inervan las células ciliadas con sus procesos periféricos y, a su vez, envían una proyección central (el nervio auditivo) al tronco encefálico donde terminan en dos núcleos cocleares primarios, el núcleo magnocellularis (NM) y el núcleo angularis (NA). Las neuronas en el NM son estructural y funcionalmente comparables a las células esféricas tupidas del núcleo coclear anteroventral de mamíferos. Dentro del NM, las fibras nerviosas auditivas (ANF) hacen sinapsis en el somata de las neuronas NM a través del bulbo terminal grande de los terminales de Held22. Durante el desarrollo, las neuronas NM surgen de los rombómeros 5 y 6 (r5/6) en el cerebro posterior23, mientras que las neuronas AG se derivan de neuroblastos que residen en el otocisto24. Aquí, describimos el procedimiento para derribar selectivamente la expresión de FMRP en las neuronas AG presinápticas y en las neuronas NM postsinápticas por separado.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Egg incubation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 &#176;C refrigerator</td>
			<td>MAGAT</td>
			<td></td>
			<td>Used for fertilized egg storage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>SHANGHAI BOXUN</td>
			<td>GZX-9240MBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized eggs</td>
			<td>Farm of South China Agricultural University</td>
			<td></td>
			<td>Eggs must be used in one week for optimal viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1661</td>
			<td>Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi-prep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td>Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Make 7.5M working solution in nuclase-free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation and Doxycycline Administration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>ECM399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL / 5 mL Syringe</td>
			<td>GUANGZHOU KANGFULAI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>CNOPTEC</td>
			<td>SZM-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxcycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td>Use fresh aliquots for each dose and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>BEIBOBOMEI</td>
			<td>RD0910</td>
			<td>0.9-1.1 mm*100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory parafilm</td>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>PM996</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>CHENGDU INSTRUMENT FACTORY</td>
			<td>WD-2</td>
			<td>Pulling condition: 500 &#176;C for 15 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum elctrodes</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum elctrodes</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Dissection and Fixation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td>Tip size: 0.05*0.01 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other surgery tools</td>
			<td>RWD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 &#176;C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW</td>
			<td>01673921</td>
			<td>For black background plates, food-grade carbon powder is applied.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9391</td>
			<td>From bovine skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding microtome</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SM2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150113</td>
			<td>1:500 dilution, RRID: AB_2576208</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150078</td>
			<td>1:500 dilution, RRID: AB_2722519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab285390</td>
			<td>1: 1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>Southern&#160;Biotech</td>
			<td>Sb-0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMRP antibody</td>
			<td>Y. Wang, Florida State University</td>
			<td>#8263</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_2861242</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.3F7</td>
			<td>1:100 dilution, RRID: AB_1157901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4142</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_477272</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parvalbumin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3088</td>
			<td>1:10000 dilution, RRID: AB_477329</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAP25 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab66066</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_2192052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe photoshop</td>
			<td>ADOBE</td>
			<td></td>
			<td>image editing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Image-Pro Plus 7.0</td>
			<td>OlYMPUS</td>
			<td></td>
			<td>commercial image processing software package</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting cell-autonomous function of fragile x mental retardation protein in an auditory circuit by in ovo electroporation

La proteína de retraso mental X frágil (FMRP) es una proteína de unión al ARNm que regula la traducción local de proteínas. La pérdida o disfunción de FMRP conduce a actividades neuronales y sinápticas aberrantes en el síndrome X frágil (FXS), que se caracteriza por discapacidad intelectual, anomalías sensoriales y problemas de comunicación social. Los estudios de la función de FMRP y la patogénesis del FXS se han realizado principalmente con Fmr1 (el gen que codifica FMRP) knockout en animales transgénicos. Aquí informamos un método in vivo para determinar la función autónoma celular de FMRP durante el período de ensamblaje del circuito y la formación sináptica utilizando embriones de pollo. Este método emplea electroporación específica de etapa, sitio y dirección de un sistema vectorial inducible por fármaco que contiene ARN de horquilla pequeña Fmr1 (shRNA) y un reportero de EGFP. Con este método, logramos una eliminación selectiva de FMRP en el ganglio auditivo (AG) y en uno de sus objetivos del tronco encefálico, el núcleo magnocellularis (NM), proporcionando así una manipulación específica del componente dentro del circuito AG-NM. Además, el patrón de mosaico de la transfección permite controles dentro de los animales y comparaciones de neuronas / fibras vecinas para mejorar la confiabilidad y la sensibilidad en el análisis de datos. El sistema vectorial inducible proporciona control temporal del inicio de la edición de genes para minimizar los efectos acumulativos en el desarrollo. La combinación de estas estrategias proporciona una herramienta innovadora para diseccionar la función autónoma celular de FMRP en el desarrollo sináptico y de circuitos.

Al realizar electroporación in ovo en diferentes sitios y en diferentes etapas de desarrollo, logramos un knockdown selectivo de FMRP en la periferia auditiva o en el tronco cerebral auditivo.
Derribo de FMRP en NM El ARN horquilla pequeño (shRNA) contra el pollo Fmr1 fue diseñado y clonado en el sistema vectorial Tet-On como se describió anteriormente20. La configuración para la electroporación in ovo se muestra en l...

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Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Usando electroporación in ovo , ideamos un método para transfectar selectivamente el oído interno auditivo y el núcleo coclear en embriones de pollo para lograr una eliminación específica del grupo celular de la proteína de retraso mental X frágil durante períodos discretos de ensamblaje del circuito.

Disección de la función autónoma celular de la proteína de retraso mental X frágil en un circuito auditivo mediante electroporación in ovo

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to ...

Nuestro protocolo es un método in vivo para investigar las funciones autónomas celulares de FMRP durante el desarrollo. Esto puede ayudar a comprender la fisiopatología específica del tipo de célula del síndrome X frágil. Este método emplea electroporación específica de etapa, sitio y dirección de un sistema vectorial inducible por fármaco que contiene ARN horquilla pequeño Fmr1.Con este método, conseguimos el knockdown selectivo de FMRP en el circuito auditivo. Este método también se puede aplicar para investigar la función de otros genes en el circuito auditivo o el sistema vestibular. Comience colocando los huevos horizontalmente para colocar el embrión en la parte superior del huevo para facilitar la manipulación.Incubar a 38 grados centígrados durante 46 a 48 horas hasta Hamburger y Hamilton, o HH etapa 12, para la transfección del tubo neural o durante 54 a 56 horas hasta HH 13 para la transfección de otocisto. Retire los huevos de la incubadora, una docena de huevos a la vez. Mantener los huevos fuera de su incubadora durante más de una hora introduce variaciones en el desarrollo y reduce la viabilidad.Use una linterna para proyectar luz desde el fondo del huevo. La ubicación del embrión aparece como un área oscura en la cáscara del huevo. Marque la ubicación del embrión en la cáscara del huevo con un lápiz.Limpie los huevos con una gasa que contenga 75% de etanol y perfore un agujero en el extremo puntiagudo de los huevos con la punta de las tijeras. Luego, retire dos mililitros de albúmina con una jeringa de aguja de calibre 18. Asegúrese de que el orificio solo sea lo suficientemente grande como para permitir la inserción de la aguja.Limpie cualquier albúmina que gotee con una gasa y selle el orificio con cinta adhesiva transparente. Cubra la parte superior de los huevos con cinta adhesiva transparente, centrándose en el área oscura marcada con lápiz para minimizar las grietas y evitar la caída de restos de cáscara durante la ventana. Limpie todas las herramientas de cirugía con una gasa que contenga 75% de etanol y limpie el área cubierta con cinta adhesiva con 75% de etanol.Use un par pequeño de tijeras para cortar una ventana de uno o dos centímetros cuadrados alrededor de la circunferencia de la marca del lápiz. Sostenga las tijeras planas para evitar dañar el embrión debajo. Coloque el huevo con ventana bajo un microscopio estereoscópico con un ocular de 10X y un zoom de 2X.Llene una jeringa de un mililitro con la solución de tinta y luego coloque una aguja de calibre 27. Doble la aguja en un ángulo de 45 grados con fórceps. Bajo el microscopio, asomar cuidadosamente desde el borde del área opaqua e insertar la aguja debajo del embrión.Inyecte alrededor de 50 microlitros de tinta, que se difundirán por debajo del área pelúcida, para la visualización del embrión. La tinta formará un fondo oscuro para la visualización clara del embrión. Tire de los capilares de vidrio en pipetas con un extractor de pipetas.Bajo un microscopio de disección, abra cuidadosamente la punta de la aguja capilar a 10 a 20 micrómetros de diámetro con fórceps. Guarde las pipetas en una caja de almacenamiento hasta su uso. A continuación, llene una pipeta capilar con 0,5 a 1 microlitros de la mezcla de plásmidos aplicando presión negativa a través de un tubo de goma en el extremo de la pipeta con una jeringa.Coloque el huevo bajo el microscopio para que el embrión esté orientado verticalmente con la cola cerca de usted. Sujete la pipeta capilar con una mano o con el manipulador de tres ejes y conduzca la punta de la pipeta hacia el rombomero 5 a 6. en una dirección de cola a cabeza.Empuje suavemente la punta a través de la membrana de vitellina y en el tubo neural dorsal, y luego retire la pipeta un poco para que la punta quede en el lumen del tubo neural. Inyecte la mezcla de plásmidos aplicando presión de aire hasta que el plásmido teñido se difunda completamente en el rombomero 5 a 6 y se extienda en el rombomero 3 y el rombomero 4. Verifique si la inyección es exitosa, lo que se logra cuando la solución de plásmido azul se difunde rápidamente por el tubo neural sin fugas.Cuando se produce una fuga, el azul se desvanece rápidamente. Inmediatamente después de la inyección, coloque un electrodo bipolar de platino a cada lado del tubo neural. Suministre dos pulsos de 12 voltios y 50 milisegundos de duración con un electroporador.Observe burbujas de aire en los extremos del electrodo bipolar, con más en el lado negativo. Verifique la electroporación exitosa, que se logra cuando la mezcla de plásmidos teñidos ingresa al tejido del tubo neural cerca del lado positivo del electrodo. Después de la electroporación, retire con cuidado el electrodo bipolar.Cubra la ventana sobre la cáscara del huevo con un trozo de película transparente precortada en cuadrados de dos pulgadas y rociada con etanol al 75%. Vuelva a colocar el huevo en su incubadora. Limpie el electrodo bipolar administrando de 10 a 20 pulsos de 12 voltios y 50 milisegundos de duración en solución salina antes de proceder al siguiente huevo.Bajo el microscopio, coloque el huevo de tal manera que el embrión esté vertical con la cola cerca de usted. Sostenga la pipeta capilar y empuje suavemente el otocisto derecho en dirección dorsolateral. Inyecte la mezcla de plásmidos con presión de aire hasta que el otocisto se llene con solución azul.Verifique si hay una inyección exitosa, que se logra cuando la mezcla de plásmido azul está confinada dentro del otocisto y no tiene fugas. Inmediatamente después de la inyección, coloque el electrodo bipolar en el otocisto y coloque los lados positivo y negativo anterior y posterior al otocisto, respectivamente. Entrega dos pulsos de 12 voltios y 50 milisegundos de duración con el electroporador.Verifique la electroporación exitosa, que se logra cuando la mezcla de plásmidos azules ingresa al tejido del otocisto cerca del lado positivo del electrodo. Después de la electroporación, retire con cuidado el electrodo bipolar y cubra la ventana con la cáscara del huevo con una película transparente. Finalmente, devuelva el huevo a la incubadora.La imagen representativa muestra un ejemplo del tercer día embrionario, o E3, después de la transfección de neurotubos y el tratamiento con dox en el segundo día embrionario, o E2. Aquí se muestran las células transfectadas con Fmr1 shRNA y EGFP en la sección transversal. Las células que expresan EGFP estaban confinadas a un lado del tubo neural y el tronco encefálico. Aquí se muestra una sección transversal en E15 con el núcleo magnocelular que expresa EGFP, o neuronas NM, en el lado transfectado.En el lado contralateral, se observaron axones que contienen EGFP en la porción ventral del núcleo laminaris, o NL. El efecto de knockdown del shRNA Fmr1 fue validado por marcadas reducciones en la inmunorreactividad FMRP en neuronas NM transfectadas en comparación con las neuronas vecinas no transfectadas. El ganglio auditivo en E19 con inmunorreactividad FMRP se muestra aquí. Las neuronas ganglionares auditivas no fueron transfectadas.Algunas células gliales derivadas de las células de la cresta neural craneal fueron transfectadas. Las imágenes representativas muestran el derribo de FMRP en el conducto auditivo después de la transfección de otocistos. Los conductos auditivos en E9 exhibieron fluorescencia EGFP extensa.En las secciones transversales, las células que expresan EGFP se localizaron en la papila basilar y el ganglio auditivo. El efecto de derribo del shRNA Fmr1 fue validado por la reducción de la inmunorreactividad FMRP en las células ciliadas transfectadas en comparación con las células ciliadas vecinas no transfectadas. Del mismo modo, la inmunorreactividad FMRP disminuyó en gran medida en las neuronas ganglionares auditivas transfectadas.La proyección central de las neuronas ganglionares auditivas transfectadas se rastreó hasta el tronco encefálico a través del nervio auditivo con terminales terminales terminales caracterizadas. Al intentar este procedimiento, lo más importante es controlar el sitio y la dirección de la electroporación para la transfección selectiva. Después de este procedimiento, se puede realizar el llenado de tipo de célula única, la inmunotinción, la clasificación celular seguida de espectro de masas o la secuenciación de una sola célula para revelar los cambios a nivel morfológico y bioquímico.Esta técnica también permite la edición selectiva de otros genes con control temporal y especificidad de componentes en el oído auditivo para circuitos madre y puede modificarse para manipular el sistema vestibular.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

En el útero de electroporación seguido por cultivos neuronales primarias para estudiar la función génica en el subconjunto de neuronas corticales

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Investigación

Neurociencias

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

TMS: Uso del protocolo Theta-Burst para explorar Mechasnism de plasticidad en los individuos con el síndrome de X frágil y el autismo

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

La transfección de células de ratón del ganglio de la retina por In vivo La electroporación

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

En electroporación in ovo en el mesencéfalo polluelo para estudiar la función génica en el desarrollo neuronal dopaminérgica

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

En electroporación in ovo de base miARN plásmidos en el tubo neural en desarrollo y evaluación de fenotipos por inyección de Dil en los preparativos libro abierto

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Las investigaciones sobre alteraciones de la función del circuito del hipocampo después de una lesión cerebral traumática leve

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

En Expression in ovo de microARN en ventral del polluelo Midbrain

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

Un peso ligero, Auriculares basada Sistema de Manipulación de retroalimentación auditiva en Songbirds

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

La detección de palmitoilación proteínas en neuronas del hipocampo cultivadas por inmunoprecipitación e Intercambio Acyl-Biotina (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

Registro y análisis de los ritmos circadianos en funcionamiento las ruedas Actividad en roedores

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...