Name: dissecting cell-autonomous function of fragile x mental retardation protein in an auditory circuit by in ovo electroporation
Uploaded: 2022-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation at JoVE.com

Denna studie stöddes av: ett bidrag från National Natural Science Foundation of China (nr 32000697); Vetenskaps- och teknikprogrammet i Guangzhou (202102080139); Guangdong Natural Science Foundation (2019A1515110625, 2021A1515010619); Grundforskningsfonderna för de centrala universiteten (11620324). ett forskningsbidrag från Key Laboratory of Regenerative Medicine, utbildningsministeriet, Jinan University (nr. ZSYXM202107); Grundforskningsfonderna för Kinas centrala universitet (21621054). och Medical Scientific Research Foundation i Guangdong-provinsen i Kina (20191118142729581). Vi tackar det medicinska experimentella centret vid Jinan University. Vi tackar Dr. Terra Bradley för noggrann redigering av manuskriptet.

Ägg och kycklingembryon hanterades med omsorg och respekt i enlighet med de djurprotokoll som godkänts av Jinan University Animal Care and Use Committee.
1. Ägg- och plasmidberedning
<ol><li>Förberedelse av ägg<ol><li>Få färskt befruktade kycklingägg (Gallus gallus) från South China Agricultural University och förvara vid 16 ° C före inkubation. För optimal livskraft, sätt alla ägg för inkubation inom en vecka efter ankomst.</li>
		<li>Placera äggen...

<ol>
	<li>Hagerman, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+syndrome.">Fragile X syndrome.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17065 (2017).</li><li>Hinds, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+specific+expression+of+FMR-1+provides+evidence+for+a+functional+role+in+fragile+X+syndrome.">Tissue specific expression of FMR-1 provides evidence for a functional role in fragile X syndrome.</a> Nature Genetics. 3 (1), 36-43 (1993).</li><li>Frederikse, P. H., Nandanoor, A., Kasinathan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+Syndrome+FMRP+co-localizes+with+regulatory+targets+PSD-95,+GABA+receptors,+CaMKIIalpha,+and+mGluR5+at+fiber+cell+membranes+in+the+eye+lens.">Fragile X Syndrome FMRP co-localizes with regulatory targets PSD-95, GABA receptors, CaMKIIalpha, and mGluR5 at fiber cell membranes in the eye lens.</a> Neurochemical Research. 40 (11), 2167-2176 (2015).</li><li>Zorio, D. A., Jackson, C. M., Liu, Y., Rubel, E. W., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+distribution+of+the+fragile+X+mental+retardation+protein+in+the+mouse+brain.">Cellular distribution of the fragile X mental retardation protein in the mouse brain.</a> Journal of Comparative Neurology. 525 (4), 818-849 (2017).</li><li>Darnell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+stalls+ribosomal+translocation+on+mRNAs+linked+to+synaptic+function+and+autism.">FMRP stalls ribosomal translocation on mRNAs linked to synaptic function and autism.</a> Cell. 146 (2), 247-261 (2011).</li><li>Bakker, C. E., Oostra, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+fragile+X+syndrome:+insights+from+animal+models.">Understanding fragile X syndrome: insights from animal models.</a> Cytogenetic and Genome Research. 100 (1-4), 111-123 (2003).</li><li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li><li>Deng, P. Y., Sojka, D., Klyachko, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+presynaptic+short-term+plasticity+and+information+processing+in+a+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Abnormal presynaptic short-term plasticity and information processing in a mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 31 (30), 10971-10982 (2011).</li><li>Patel, A. B., Hays, S. A., Bureau, I., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+target+cell-specific+role+for+presynaptic+Fmr1+in+regulating+glutamate+release+onto+neocortical+fast-spiking+inhibitory+neurons.">A target cell-specific role for presynaptic Fmr1 in regulating glutamate release onto neocortical fast-spiking inhibitory neurons.</a> Journal of Neuroscience. 33 (6), 2593-2604 (2013).</li><li>Patel, A. B., Loerwald, K. W., Huber, K. M., Gibson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+FMRP+promotes+the+pruning+of+cell-to-cell+connections+among+pyramidal+neurons+in+the+L5A+neocortical+network.">Postsynaptic FMRP promotes the pruning of cell-to-cell connections among pyramidal neurons in the L5A neocortical network.</a> Journal of Neuroscience. 34 (9), 3413-3418 (2014).</li><li>Higashimori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+deletion+of+astroglial+FMRP+dysregulates+glutamate+transporter+GLT1+and+contributes+to+Fragile+X+syndrome+phenotypes+in+vivo.">Selective deletion of astroglial FMRP dysregulates glutamate transporter GLT1 and contributes to Fragile X syndrome phenotypes in vivo.</a> Journal of Neuroscience. 36 (27), 7079-7094 (2016).</li><li>Hodges, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+contributions+to+synaptic+and+learning+abnormalities+in+a+mouse+model+of+Fragile+X+syndrome.">Astrocytic contributions to synaptic and learning abnormalities in a mouse model of Fragile X syndrome.</a> Biological Psychiatry. 82 (2), 139-149 (2017).</li><li>Gonzalez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Audiogenic+seizures+in+the+Fmr1+knock-out+mouse+are+induced+by+Fmr1+deletion+in+subcortical,+VGlut2-expressing+excitatory+neurons+and+require+deletion+in+the+inferior+colliculus.">Audiogenic seizures in the Fmr1 knock-out mouse are induced by Fmr1 deletion in subcortical, VGlut2-expressing excitatory neurons and require deletion in the inferior colliculus.</a> Journal of Neuroscience. 39 (49), 9852-9863 (2019).</li><li>Bland, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+regulates+the+subcellular+distribution+of+cortical+dendritic+spine+density+in+a+non-cell-autonomous+manner.">FMRP regulates the subcellular distribution of cortical dendritic spine density in a non-cell-autonomous manner.</a> Neurobiology of Disease. 150, 105253 (2021).</li><li>Pfeiffer, B. E., Huber, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+induces+synapse+loss+through+acute+postsynaptic+translational+regulation.">Fragile X mental retardation protein induces synapse loss through acute postsynaptic translational regulation.</a> Journal of Neuroscience. 27 (12), 3120-3130 (2007).</li><li>Pfeiffer, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragile+X+mental+retardation+protein+is+required+for+synapse+elimination+by+the+activity-dependent+transcription+factor+MEF2.">Fragile X mental retardation protein is required for synapse elimination by the activity-dependent transcription factor MEF2.</a> Neuron. 66 (2), 191-197 (2010).</li><li>Deng, P. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMRP+regulates+neurotransmitter+release+and+synaptic+information+transmission+by+modulating+action+potential+duration+via+BK+channels.">FMRP regulates neurotransmitter release and synaptic information transmission by modulating action potential duration via BK channels.</a> Neuron. 77 (4), 696-711 (2013).</li><li>Yang, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+molecular+locus+for+normalizing+dysregulated+GABA+release+from+interneurons+in+the+Fragile+X+brain.">Identification of a molecular locus for normalizing dysregulated GABA release from interneurons in the Fragile X brain.</a> Molecular Psychiatry. 25 (9), 2017-2035 (2020).</li><li>Razak, K. A., Dominick, K. C., Erickson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+studies+in+fragile+X+syndrome.">Developmental studies in fragile X syndrome.</a> Journal of Neurodevelopmental Disorders. 12 (1), 13 (2020).</li><li>Wang, X., Zorio, D. A. R., Schecterson, L., Lu, Y., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postsynaptic+FMRP+regulates+synaptogenesis+in+vivo+in+the+developing+cochlear+nucleus.">Postsynaptic FMRP regulates synaptogenesis in vivo in the developing cochlear nucleus.</a> Journal of Neuroscience. 38 (29), 6445-6460 (2018).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal-specific+roles+of+fragile+X+mental+retardation+protein+in+the+development+of+the+hindbrain+auditory+circuit.">Temporal-specific roles of fragile X mental retardation protein in the development of the hindbrain auditory circuit.</a> Development. 147 (21), (2020).</li><li>Rubel, E. W., Fritzsch, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+system+development:+primary+auditory+neurons+and+their+targets.">Auditory system development: primary auditory neurons and their targets.</a> Annual Review of Neuroscience. 25, 51-101 (2002).</li><li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+auditory+brain-stem+nuclei+in+the+chick+hindbrain.">Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain.</a> Developmental Biology. 224 (2), 138-151 (2000).</li><li>Chervenak, A. P., Hakim, I. S., Barald, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+expression+of+Zic+genes+during+vertebrate+inner+ear+development.">Spatiotemporal expression of Zic genes during vertebrate inner ear development.</a> Developmental Dynamics. 242 (7), 897-908 (2013).</li><li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo.">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li><li>Lu, T., Cohen, A. L., Sanchez, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+ovo+electroporation+in+the+chicken+auditory+brainstem.">In ovo electroporation in the chicken auditory brainstem.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e56628 (2017).</li><li>Evsen, L., Doetzlhofer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+the+chicken+auditory+organ+by+in+ovo+micro-electroporation.">Gene transfer into the chicken auditory organ by in ovo micro-electroporation.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), e53864 (2016).</li><li>Schecterson, L. C., Sanchez, J. T., Rubel, E. W., Bothwell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrkB+downregulation+is+required+for+dendrite+retraction+in+developing+neurons+of+chicken+nucleus+magnocellularis.">TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis.</a> Journal of Neuroscience. 32 (40), 14000-14009 (2012).</li><li>Wang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+glucose+environment+inhibits+cranial+neural+crest+survival+by+activating+excessive+autophagy+in+the+chick+embryo.">High glucose environment inhibits cranial neural crest survival by activating excessive autophagy in the chick embryo.</a> Scientific Reports. 5, 18321 (2015).</li><li>Yu, X., Wang, X., Sakano, H., Zorio, D. A. R., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+fragile+X+mental+retardation+protein+correlates+with+cellular+and+synaptic+properties+in+primary+auditory+neurons+following+afferent+deprivation.">Dynamics of the fragile X mental retardation protein correlates with cellular and synaptic properties in primary auditory neurons following afferent deprivation.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (3), 481-500 (2021).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet-1+expression+in+the+developing+chicken+inner+ear.">Islet-1 expression in the developing chicken inner ear.</a> Journal of Comparative Neurology. 477 (1), 1-10 (2004).</li><li>Carr, C. E., Boudreau, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+projections+of+auditory+nerve+fibers+in+the+barn+owl.">Central projections of auditory nerve fibers in the barn owl.</a> Journal of Comparative Neurology. 314 (2), 306-318 (1991).</li><li>Sandell, L. L., Butler Tjaden, N. E., Barlow, A. J., Trainor, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cochleovestibular+nerve+development+is+integrated+with+migratory+neural+crest+cells.">Cochleovestibular nerve development is integrated with migratory neural crest cells.</a> Developmental Biology. 385 (2), 200-210 (2014).</li><li>Cramer, K. S., Bermingham-McDonogh, O., Krull, C. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+signaling+promotes+axon+segregation+in+the+developing+auditory+system.">EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system.</a> Developmental Biology. 269 (1), 26-35 (2004).</li><li>Evsen, L., Sugahara, S., Uchikawa, M., Kondoh, H., Wu, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progression+of+neurogenesis+in+the+inner+ear+requires+inhibition+of+Sox2+transcription+by+neurogenin1+and+neurod1.">Progression of neurogenesis in the inner ear requires inhibition of Sox2 transcription by neurogenin1 and neurod1.</a> Journal of Neuroscience. 33 (9), 3879-3890 (2013).</li><li>Curnow, E., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+animal+models+for+understanding+FMRP+functions+and+FXS+pathology.">New animal models for understanding FMRP functions and FXS pathology.</a> Cells. 11 (10), 1628 (2022).</li></ol>

För att bestämma FMRP: s cellautonoma funktion är det nödvändigt att manipulera dess uttryck i enskilda cellgrupper eller celltyper. Eftersom en av FMRP: s huvudfunktioner är att reglera synaptisk bildning och plasticitet, är selektiv manipulering av varje synaptisk komponent i en viss krets en förutsättning för en fullständig förståelse av FMRP-mekanismen i synaptisk kommunikation. Med hjälp av ovo-elektroporering av kycklingembryon demonstrerade vi en metod för a...

Bräckligt X-syndrom (FXS) är en neurodevelopmental störning som kännetecknas av intellektuell funktionsnedsättning, sensoriska abnormiteter och autistiska beteenden. I de flesta fall orsakas FXS av en global förlust av bräckligt X-mentalt retardationsprotein (FMRP; kodat av Fmr1-genen) som börjar i tidiga embryonala stadier1. FMRP är ett RNA-bindande protein som normalt uttrycks i de flesta nervceller och gliaceller i hjärnan, liksom i sensoriska organ 2,3,4. I däggdjurshjärnor är FMRP sannolikt associerat med hundratals mRNA som kodar för proteiner som är viktiga för olika neurala aktiviteter5. Studier av konventionella Fmr1-knockoutdjur visade att FMRP-uttryck är särskilt viktigt för montering och plasticitet av synaptisk neurotransmission6. Flera villkorliga och mosaik knockout-modeller har vidare visat att FMRP-åtgärder och signaler varierar mellan hjärnregioner, celltyper och synaptiska platser under flera utvecklingshändelser inklusive axonal projektion, dendritisk mönstring och synaptisk plasticitet 7,8,9,10,11,12,13,14 . Akut funktion av FMRP vid reglering av synaptisk överföring studerades genom intracellulär leverans av hämmande FMRP-antikroppar eller FMRP själv i hjärnskivor eller odlade neuroner15,16,17,18. Dessa metoder erbjuder dock inte möjligheten att spåra FMRP-feluttrycksinducerade konsekvenser under utvecklingen. Således är det i stort behov att utveckla in vivo-metoder för att undersöka FMRP: s cellautonoma funktioner och förväntas hjälpa till att avgöra om de rapporterade avvikelserna hos FXS-patienter är direkta konsekvenser av FMRP-förlust i de associerade neuronerna och kretsarna, eller sekundära konsekvenser härledda från nätverksomfattande förändringar under utveckling19.
Den auditiva hjärnstammen hos kycklingembryon erbjuder en unikt fördelaktig modell för djupgående funktionella analyser av FMRP-reglering i krets- och synapsutveckling. Den enkla tillgången till embryonala kycklinghjärnor och den väletablerade ovo-elektroporationstekniken för genmanipulation har i hög grad bidragit till vår förståelse av hjärnans utveckling i tidiga embryonala stadier. I en nyligen publicerad studie kombinerades denna teknik med avancerade molekylära verktyg som möjliggör tidsmässig kontroll av FMRP-feluttryck20,21. Här är metodiken avancerad för att inducera selektiva manipuleringar av presynaptiska och postsynaptiska neuroner separat. Denna metod utvecklades i den auditiva hjärnstamskretsen. Akustisk signal detekteras av hårceller i det auditiva innerörat och överförs sedan till den auditiva ganglionen (AG; även kallad spiral ganglion hos däggdjur). Bipolära nervceller i AG innerverar hårceller med sina perifera processer och skickar i sin tur en central projektion (hörselnerven) till hjärnstammen där de slutar i två primära cochleära kärnor, kärnan magnocellularis (NM) och kärnan angularis (NA). Neuroner i NM är strukturellt och funktionellt jämförbara med de sfäriska buskiga cellerna i däggdjurets anteroventrala cochleära kärna. Inom NM, hörselnervfibrer (ANFs) synaps på somata av NM-neuroner via den stora endbulben av Held-terminaler22. Under utvecklingen uppstår NM-neuroner från rhombomererna 5 och 6 (r5/6) i bakhjärnan23, medan AG-neuroner härrör från neuroblaster som bor i otocysten24. Här beskriver vi proceduren för att selektivt slå ner FMRP-uttryck i de presynaptiska AG-neuronerna och i de postsynaptiska NM-neuronerna separat.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Egg incubation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 &#176;C refrigerator</td>
			<td>MAGAT</td>
			<td></td>
			<td>Used for fertilized egg storage.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg incubator</td>
			<td>SHANGHAI BOXUN</td>
			<td>GZX-9240MBE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fertilized eggs</td>
			<td>Farm of South China Agricultural University</td>
			<td></td>
			<td>Eggs must be used in one week for optimal viability.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td>G1661</td>
			<td>Make 0.1% working solution in distilled water and autoclave.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid Maxi-prep kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>12162</td>
			<td>Dissolve plasmid DNA in Tris-EDTA (TE) buffer; endotoxin-free preparation kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td>Make 7.5M working solution in nuclase-free water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporation and Doxycycline Administration</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroporator</td>
			<td>BTX</td>
			<td>ECM399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL / 5 mL Syringe</td>
			<td>GUANGZHOU KANGFULAI</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>CNOPTEC</td>
			<td>SZM-42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxcycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9891</td>
			<td>Use fresh aliquots for each dose and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass capillary</td>
			<td>BEIBOBOMEI</td>
			<td>RD0910</td>
			<td>0.9-1.1 mm*100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory parafilm</td>
			<td>PARAFILM</td>
			<td>PM996</td>
			<td>transparent film</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>CHENGDU INSTRUMENT FACTORY</td>
			<td>WD-2</td>
			<td>Pulling condition: 500 &#176;C for 15 s</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum elctrodes</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platinum elctrodes</td>
			<td>Home made</td>
			<td></td>
			<td>0.5 mm diameter, 1.5 mm interval.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber tube</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5177</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Dissection and Fixation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11020-11</td>
			<td>Tip size: 0.05*0.01 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other surgery tools</td>
			<td>RWD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td>Freshly made 4% PFA solution in phosphate-buffered saline can be stored in 4 &#176;C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>DOW</td>
			<td>01673921</td>
			<td>For black background plates, food-grade carbon powder is applied.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sectioning</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>CM1850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9391</td>
			<td>From bovine skin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sliding microtome</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SM2010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunostaining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150113</td>
			<td>1:500 dilution, RRID: AB_2576208</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 555 goat anti-rabbit</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150078</td>
			<td>1:500 dilution, RRID: AB_2722519</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab285390</td>
			<td>1: 1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G mounting medium</td>
			<td>Southern&#160;Biotech</td>
			<td>Sb-0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FMRP antibody</td>
			<td>Y. Wang, Florida State University</td>
			<td>#8263</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_2861242</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Islet-1 antibody</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>39.3F7</td>
			<td>1:100 dilution, RRID: AB_1157901</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurofilament antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N4142</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_477272</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parvalbumin antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3088</td>
			<td>1:10000 dilution, RRID: AB_477329</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAP25 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab66066</td>
			<td>1:1000 dilution, RRID: AB_2192052</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe photoshop</td>
			<td>ADOBE</td>
			<td></td>
			<td>image editing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>SP8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent stereomicroscope</td>
			<td>OLYMPUS</td>
			<td>MVX10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Image-Pro Plus 7.0</td>
			<td>OlYMPUS</td>
			<td></td>
			<td>commercial image processing software package</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissecting cell-autonomous function of fragile x mental retardation protein in an auditory circuit by in ovo electroporation

Fragile X mental retardation protein (FMRP) är ett mRNA-bindande protein som reglerar lokal proteinöversättning. FMRP-förlust eller dysfunktion leder till avvikande neuronala och synaptiska aktiviteter vid bräckligt X-syndrom (FXS), som kännetecknas av intellektuell funktionsnedsättning, sensoriska abnormiteter och sociala kommunikationsproblem. Studier av FMRP-funktion och FXS-patogenes har främst utförts med Fmr1 (genen som kodar för FMRP) knockout hos transgena djur. Här rapporterar vi en in vivo-metod för att bestämma den cellautonoma funktionen hos FMRP under perioden för kretsmontering och synaptisk bildning med kycklingembryon. Denna metod använder scen-, plats- och riktningsspecifik elektroporering av ett läkemedelsinducerbart vektorsystem innehållande Fmr1 litet hårnåls-RNA (shRNA) och en EGFP-reporter. Med denna metod uppnådde vi selektiv FMRP-knockdown i den auditiva ganglionen (AG) och i ett av dess hjärnstamsmål, kärnan magnocellularis (NM), vilket ger en komponentspecifik manipulation inom AG-NM-kretsen. Dessutom tillåter mosaikmönstret för transfektionen kontroller inom djur och närliggande neuron/ fiberjämförelser för förbättrad tillförlitlighet och känslighet vid dataanalys. Det inducerbara vektorsystemet ger tidsmässig kontroll av genredigeringsdebut för att minimera ackumulerande utvecklingseffekter. Kombinationen av dessa strategier ger ett innovativt verktyg för att dissekera FMRP: s cellautonoma funktion i synaptisk och kretsutveckling.

Genom att utföra ovo-elektroporering på olika platser och i olika utvecklingsstadier uppnådde vi selektiv FMRP-knockdown antingen i hörselperiferin eller i den auditiva hjärnstammen.
FMRP knockdown i NM Litet hårnåls-RNA (shRNA) mot kycklingen Fmr1 designades och klonades in i Tet-On-vektorsystemet som beskrivits tidigare20. Inställningen för in ovo-elektroporering visas i figur 1A. ...

Watch this Scientific Journal Video about Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation at JoVE.com

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

Med hjälp av ovo-elektroporering utarbetade vi en metod för att selektivt transfektera det auditiva innerörat och den cochleära kärnan i kycklingembryon för att uppnå en cellgruppsspecifik knockdown av bräckligt X-mental retardationsprotein under diskreta perioder av kretsmontering.

Dissekering av cellautonom funktion av bräckligt X mental retardationsprotein i en hörselkrets genom in ovo-elektroporation

Fragile X mental retardation protein (FMRP) is an mRNA-binding protein that regulates local protein translation. FMRP loss or dysfunction leads to ...

Vårt protokoll är en in vivo-metod för att undersöka FMRP:s cellautonoma funktioner under utveckling. Detta kan hjälpa till att förstå den celltypspecifika patofysiologin vid bräckligt X-syndrom. Denna metod använder steg-, plats- och riktningsspecifik elektroporering av ett läkemedelsinducerbart vektorsystem innehållande Fmr1 litet hårnåls-RNA.Med denna metod uppnår vi den selektiva FMRP-knockdownen i hörselkretsen. Denna metod kan också tillämpas för att undersöka funktionen hos andra gener i hörselkretsen eller det vestibulära systemet. Börja med att placera äggen horisontellt för att placera embryot på toppen av ägget för enkel manipulation.Inkubera vid 38 grader Celsius i 46 till 48 timmar tills Hamburger och Hamilton, eller HH steg 12, för neuralrörstransfektion eller i 54 till 56 timmar tills HH 13 för otocysttransfektion. Ta bort äggen från inkubatorn, ett dussin ägg i taget. Att hålla ägg ur inkubatorn i mer än en timme introducerar utvecklingsvariationer och minskar livskraften.Använd en ficklampa för att kasta ljus från botten av ägget. Placeringen av embryot framträder som ett mörkt område på äggskalet. Markera platsen för embryot på äggskalet med en penna.Torka av äggen med gasväv som innehåller 75% etanol och borra ett hål i äggets spetsiga ände med saxspetsen. Ta sedan bort två milliliter albumin med en 18-gauge nålspruta. Se till att hålet bara är tillräckligt stort för att nålen ska kunna sättas in.Torka bort eventuellt läckande albumin med gasväv och försegla hålet med klar tejp. Täck toppen av äggen med klar tejp, centrera på det pennmarkerade mörka området för att minimera sprickor och förhindra fallande skalskräp under fönster. Torka av alla operationsverktyg med gasväv som innehåller 75% etanol och torka av det tejptäckta området med 75% etanol.Använd en liten sax för att klippa ett fönster på en till två kvadratcentimeter runt pennmärkets omkrets. Håll saxen platt för att undvika att skada embryot under. Placera det fönsterförsedda ägget under ett stereomikroskop med ett 10X ögonstycke och 2X zoom.Fyll en en-milliliters spruta med bläcklösningen och montera sedan en 27-gauge nål. Böj nålen i 45 graders vinkel med pincett. Under mikroskopet, stick försiktigt från kanten av området opaqua och sätt in nålen under embryot.Injicera cirka 50 mikroliter bläck, som kommer att diffundera under området pellucida, för embryovisualisering. Bläcket kommer att bilda en mörk bakgrund för den tydliga visualiseringen av embryot. Dra glaskapillärer i pipetter med en pipettdragare.Under ett dissekerande mikroskop öppnar du försiktigt kapillärnålens spets till 10 till 20 mikrometer i diameter med pincett. Förvara pipetterna i en förvaringslåda tills de används. Fyll sedan en kapillärpipett med 0,5 till 1 mikroliter av plasmidblandningen genom att applicera undertryck genom ett gummirör i slutet av pipetten med en spruta.Placera ägget under mikroskopet så att embryot är vertikalt orienterat med svansen nära dig. Håll kapillärpipetten med en hand eller med den treaxliga manipulatorn och kör pipettens spets till rhombomeren 5 till 6. i en svans-till-huvud-riktning.Stick försiktigt spetsen genom vitellinmembranet och in i dorsala nervröret och dra sedan ut pipetten lite så att spetsen är i neuralrörets lumen. Injicera plasmidblandningen genom att applicera lufttryck tills den tonade plasmiden diffunderar helt i rhombomer 5 till 6 och sträcker sig in i rhombomere 3 och rhombomere 4. Kontrollera om injektionen lyckas, vilket uppnås när den blå plasmidlösningen snabbt diffunderar ner i neuralröret utan att läcka.När läckage inträffar bleknar det blå snabbt. Omedelbart efter injektionen, placera en platina bipolär elektrod på vardera sidan av neuralröret. Leverera två pulser på 12 volt och 50 millisekunders varaktighet med en elektroporator.Observera luftbubblor i ändarna av den bipolära elektroden, med mer på den negativa sidan. Kontrollera om det finns framgångsrik elektroporering, vilket uppnås när den tonade plasmidblandningen kommer in i neuralrörsvävnaden nära elektrodens positiva sida. Efter elektroporering, ta försiktigt bort den bipolära elektroden.Täck fönstret på äggskalet med en bit transparent film förskuren till två-tums rutor och sprayad med 75% etanol. Placera ägget tillbaka i inkubatorn. Rengör den bipolära elektroden genom att leverera 10 till 20 pulser på 12 volt och 50 millisekunder i saltlösning innan du fortsätter till nästa ägg.Under mikroskopet placerar du ägget på ett sådant sätt att embryot är vertikalt med svansen nära dig. Håll kapillärpipetten och stick försiktigt rätt otocyst i dorsolateral riktning. Injicera plasmidblandningen med lufttryck tills otocysten är fylld med blå lösning.Kontrollera om det finns en lyckad injektion, vilket uppnås när den blå plasmidblandningen är begränsad i otocysten och inte läcker. Omedelbart efter injektionen, placera den bipolära elektroden på otocysten och placera de positiva och negativa sidorna främre respektive bakre till otocysten. Leverera två pulser på 12 volt och 50 millisekunders varaktighet med elektroporatorn.Kontrollera om det finns framgångsrik elektroporering, vilket uppnås när den blå plasmidblandningen kommer in i otocystens vävnad nära elektrodens positiva sida. Efter elektroporering, ta försiktigt bort den bipolära elektroden och täck fönstret på äggskalet med en transparent film. Slutligen återför ägget till inkubatorn.Den representativa bilden visar ett exempel på embryonal dag tre, eller E3, efter neurorörstransfektion och doxbehandling vid embryonal dag två, eller E2. Transfekterade celler med Fmr1 shRNA och EGFP på tvärsnittet visas här. EGFP-uttryckande celler var begränsade till ena sidan av nervröret och hjärnstammen. Ett tvärsnitt vid E15 med EGFP-uttryckande kärnmagnocellularis, eller NM-neuroner, på den transfekterade sidan visas här.På den kontralaterala sidan sågs EGFP-innehållande axoner i den ventrala delen av kärnan laminaris eller NL. Knockdown-effekten av Fmr1 shRNA validerades genom markanta minskningar av FMRP-immunreaktivitet i transinfekterade NM-neuroner jämfört med närliggande icke-transfekterade neuroner. Den auditiva ganglionen vid E19 med FMRP-immunreaktivitet visas här. Auditiva ganglionneuroner transfekterades inte.Vissa gliaceller härledda från kraniala neurala vapenceller transfekterades. De representativa bilderna visar FMRP-knock-down i hörselgången efter otocysttransfektion. Hörselkanaler vid E9 uppvisade omfattande EGFP-fluorescens.På tvärgående sektioner var EGFP-uttryckande celler belägna i basilarpapillen och den auditiva ganglionen. Knockdown-effekten av Fmr1 shRNA validerades av minskad FMRP-immunreaktivitet i transfekterade hårceller jämfört med närliggande icke-transfekterade hårceller. På samma sätt minskade FMRP-immunreaktiviteten till stor del i transfekterade auditiva ganglionneuroner.Den centrala projektionen av de transfekterade auditiva ganglionneuronerna spårades till hjärnstammen via hörselnerven med karakteriserade endbulbterminaler. När du försöker denna procedur är det viktigaste att kontrollera platsen och riktningen för elektroporering för selektiv transfektion. Efter denna procedur kan fyllning av enstaka celler, immunfärgning, cellsortering följt med massspektrum eller encellssekvensering utföras för att avslöja förändringarna på morfologiska och biokemiska nivåer.Denna teknik möjliggör också selektiv redigering av andra gener med tidsmässig kontroll och komponentspecificitet i hörselörat för stamkretsar och kan modifieras för att manipulera det vestibulära systemet.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissecting Cell-Autonomous Function of Fragile X Mental Retardation Protein in an Auditory Circuit by In Ovo Electroporation

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

I livmodern elektroporation följt av primär Neuronala Kultur för att studera geners funktion i Delmängd av kortikal Neuroner

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

TMS: Using the Theta-Burst Protocol to Explore Mechanism of Plasticity in Individuals with Fragile X Syndrome and Autism

TMS: Använda Theta-Burst protokollet Utforska Mechasnism av plasticitet hos personer med Fragile X-syndrom och autism

Fragile X Syndrome (FXS), also known as Martin-Bell Syndrome, is a genetic abnormality found on the X chromosome.1,2 Individuals suffering from FXS ...

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

Transfektion av Mouse retinal ganglion celler genom att In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

In ovo Electroporation in Chick Midbrain for Studying Gene Function in Dopaminergic Neuron Development

I ovo elektroporering i Chick mitthjärnan för att studera genfunktion av dopaminerg Neuron utveckling

Dopaminergic neurons located in the ventral midbrain control movement, emotional behavior, and reward mechanisms1-3. The dysfunction of ventral midbrain ...

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

In ovo Elektroporering av miRNA-baserade plasmider i utvecklingsländer neuralröret och bedömning av fenotyper av Dil injektion i öppen bok Förberedelser

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

Investigations on Alterations of Hippocampal Circuit Function Following Mild Traumatic Brain Injury

Undersökningar om ändringar av hippocampus Kretsens funktion Efter Mild traumatisk hjärnskada

Traumatic Brain Injury (TBI) afflicts more than 1.7 million people in the United States each year and even mild TBI can lead to persistent neurological ...

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

In ovo Expression of MicroRNA in Ventral Chick Midbrain

I ovo Uttryck av MikroRNA i ventrala Chick mitthjärnan

Non-coding RNAs are additional players in regulating gene expression. Targeted in ovo electroporation of specific areas provides a unique tool for spatial ...

A Lightweight, Headphones-based System for Manipulating Auditory Feedback in Songbirds

En lätt, hörlurar system för att manipulera Auditiv feedback i Songbirds

Experimental manipulations of sensory feedback during complex behavior have provided valuable insights into the computations underlying motor control and ...

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Detection of Protein Palmitoylation in Cultured Hippocampal Neurons by Immunoprecipitation and Acyl-Biotin Exchange ABE

Detektering av protein palmitoylering i odlade hippocampus neuroner genom immunprecipitation och Acyl-Biotin Exchange (ABE)

Palmitoylation is a post-translational lipid  modification involving the attachment of a 16-carbon saturated fatty acid,  palmitate, to cysteine residues ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

Registrering och analys av dygnsrytmen i Running-wheel aktivitet hos gnagare

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...