Name: assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice
Uploaded: 2022-11-11T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Thermal Damage from Robot-Drilled Craniotomy for Cranial Window Surgery in Mice at JoVE.com

Diese Studie wurde zum Teil durch die Merit Review Awards GRANT12418820 (Capadona) und GRANTI01RX003420 (Shoffstall/Capadona) sowie den Research Career Scientist Award # GRANT12635707 (Capadona) des United States (US) Department of Veterans Affairs Rehabilitation Research and Development Service unterstützt. Darüber hinaus wurde diese Arbeit teilweise auch vom National Institute of Health, dem National Institute of Neurological Disorders and Stroke GRANT12635723 (Capadona) und dem National Institute for Biomedical Imaging and Bioengineering, T32EB004314, (Capadona/Kirsch) unterstützt. Dieses Material basiert auf Arbeiten, die durch das Graduiertenforschungsstipendium der National Science Foundation unter der Fördernummer GRANT12635723 unterstützt wurden. Alle Meinungen, Erkenntnisse, Schlussfolgerungen oder Empfehlungen, die in diesem Material geäußert werden, sind die der Autoren und spiegeln nicht unbedingt die Ansichten der National Science Foundation wider.

Alle Verfahren und Tierpflegepraktiken wurden vom Louis Stokes Cleveland Department of Veterans Affairs Medical Center Institutional Animal Care and Use Committee überprüft, genehmigt und durchgeführt.
1. Einrichtung der Hardware des Operationsroboters
<ol><li>Befolgen Sie vor der Operation das Handbuch und die Anleitung des Operationsroboters (siehe Materialtabelle), um die Hardware und Software einzurichten. Führen Sie die Rahmenkalibrierung wie im Han...

<ol>
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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+thermal+damage+to+the+blood-brain+barrier+during+craniotomy:+implications+for+intracortical+recording+microelectrodes.">Potential for thermal damage to the blood-brain barrier during craniotomy: implications for intracortical recording microelectrodes.</a> Journal of Neural Engineering. 15 (3), 034001 (2018).</li><li>Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. 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Hyperpotassemia caused by cutaneous exposure to excessive heat.</a> Journal of Clinical Investigations. 26 (3), 497-504 (1947).</li><li>Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+lateral+craniotomy+procedure+for+mesoscale+wide-field+optical+imaging+of+brain+activity.">A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e52642 (2017).</li></ol>

Die Verwendung von EB-Farbstoff und Bildgebung ist einfach, schnell und nützlich, um Gefäßschäden im Gehirn für neue Methoden und Techniken zu bewerten. Unabhängig davon, ob ein chirurgischer Roboter verwendet wird oder um die Bestätigung von Methoden, die derzeit im Labor durchgeführt werden, ist es wichtig, chirurgische Methoden zu validieren, um die Auswirkungen experimenteller Behandlungen im Vergleich zu chirurgischen Auswirkungen zu isolieren und das Tierwohl zu verbessern. Ein Thermoelement-Setup ist auch ...

Schädelfenster sind in den Neurowissenschaften, der Neurotechnik und der Biologie allgegenwärtig geworden, um eine direkte Visualisierung und Bildgebung des Kortex bei lebenden Tieren zu ermöglichen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Die leistungsstarke Kombination aus transgenen Mäusen und Multiphotonen-Bildgebung hat äußerst wertvolle Einblicke in die Schaltkreisaktivität und andere biologische Erkenntnisse im In-vivo-Gehirn geliefert 12,13,14,15,16,17,18. Miniaturmikroskope, die am Schädel montiert sind, haben diese Möglichkeiten weiter erweitert, um Aufnahmen bei wachen, sich frei bewegenden Tieren zu ermöglichen19. Der Prozess der Herstellung eines Schädelfensters erfordert ein Power-Drilling, um den Schädelknochen zu verdünnen oder vollständig zu entfernen, um Kraniotomien zu erzeugen, die groß genug sind, um ein transparentes Stück Glas über dem Kortex zu befestigen20. Polydimethylsiloxan (PDMS) und andere Polymere wurden ebenfalls als Schädelfenstermaterialien getestet 9,21. Letztendlich ist das ideale kraniale Fenster eines, das die normale endogene Aktivität darunter nicht verändert oder stört. Es ist jedoch allgemein anerkannt, dass das Bohren von Schädelfenstern das darunter liegende Gewebe verschlimmert, was zu einer Schädigung des Gehirns, einer Störung der Umgebung und einer Beeinträchtigung der Hirnhäute bis zu dem Punkt führt, an dem die Abbildungstiefe von Multiphotonen verdecktwird 22. Die daraus resultierende Neuroinflammation hat ein breites Spektrum an Auswirkungen, die von der Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke (BHS) bis hin zur Aktivierung und Rekrutierung von Gliazellen um die Implantatstelle reichen23. Daher ist die Charakterisierung sichererer und reproduzierbarerer Schädelfensterbohrmethoden von entscheidender Bedeutung für eine gleichbleibende Bildqualität und die Reduzierung von Störfaktoren.
Während darauf geachtet wird, das Trauma des darunter liegenden Gewebes zu minimieren, hat das Bohren des Knochens das Potenzial, sowohl thermische als auch mechanische Störungen des Gehirns zu verursachen24,25. Ein mechanisches Trauma durch versehentliches Eindringen des Bohrers in die Dura kann darüber hinaus zu unterschiedlich starken kortikalen Verletzungen führen24. In einer Studie von Shoffstall et al.25 führte die Hitze des Knochenbohrens zu einer erhöhten BHS-Permeabilität, was durch das Vorhandensein des Farbstoffs Evans Blue (EB) im Hirnparenchymangezeigt wurde 25. Intravenös injizierter EB-Farbstoff bindet an zirkulierendes Albumin im Blutkreislauf und überquert daher normalerweise nicht in nennenswerten Konzentrationen eine gesunde BHS. Aus diesem Grund wird der EB-Farbstoff häufig als empfindlicher Marker für die BBB-Permeabilitätverwendet 26,27. Während ihre Studie den Einfluss der BHS-Permeabilität auf nachfolgende biologische Folgeerkrankungen nicht direkt gemessen hat, haben frühere Studien die BHS-Permeabilität mit einer erhöhten neuroinflammatorischen Reaktion auf chronisch implantierte Mikroelektroden und Veränderungen der motorischen Funktion korreliert28.
Abhängig von den Zielen der Studie kann das Ausmaß der thermischen und mechanischen Schädigung eine Quelle für experimentelle Fehler darstellen, die sich negativ auf die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Studie auswirken. Es gibt Dutzende von zitierten Methoden zur Herstellung von Schädelfenstern, die jeweils unterschiedliche Bohrgeräte, Geschwindigkeiten, Techniken und Benutzer verwenden 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Shoffstall et al.25 berichteten, dass die beobachtete Variation der Erwärmungsergebnisse auf die Variabilität der vom Bohrer ausgeübten Kraft, der Vorschubgeschwindigkeit und des Anwendungswinkels zurückgeführt wurde, neben anderen Aspekten, die beim Bohren von Hand nicht kontrolliert werden können 25. Es wird angenommen, dass automatisierte Bohrsysteme und andere stereotaktische Geräte die Reproduzierbarkeit und die Konsistenz der Ergebnisse verbessern können, aber veröffentlichte Methodenstudien haben die Temperatur oder die BHS-Permeabilität als eines der Ergebnisse nicht rigoros bewertet. Daher besteht ein Bedarf an reproduzierbareren und konsequent angewandten Methoden zur Herstellung von Schädelfenstern sowie an Methoden, die rigoros angewendet werden, um die Auswirkungen von Schädelfensterbohrungen auf das darunter liegende Nervengewebe zu bewerten.
Der Fokus dieser Studie liegt auf der Ermittlung und Entwicklung konsistenter und sicherer Bohrmethoden für Schädelfenster. Die Größe der Kraniotomie bei der Installation von Schädelfenstern ist deutlich größer als bei Standard-Kraniotomien für mikroelektroden, die dem Gehirn implantiert werden. Solche Kraniotomien können nicht mit einem einzigen Bohrloch durchgeführt werden, wenn Standardgeräte verwendet werden, was zu einer größeren Variabilität der Technik zwischen den Chirurgen führt, wenn sie von Hand durchgeführt werden20. Chirurgische Bohrroboter wurden in der Praxis eingeführt, aber nicht weit verbreitet 1,6,29. Die Automatisierung des Bohrens bietet Kontrolle über Variablen, die zur beobachteten Variation von Versuch zu Versuch beitragen, was darauf hindeutet, dass der Einsatz der Geräte inter- und intrachirurgische Effekte reduzieren kann. Dies ist von besonderem Interesse, wenn man bedenkt, dass die größere Kraniotomie, die für die Platzierung des Schädelfensters erforderlich ist, zusätzlich schwierig ist. Während man davon ausgehen könnte, dass die Steuerung durch die Automatisierung des Bohrens klare Vorteile mit sich bringt, wurde die Implementierung dieser Geräte bisher kaum bewertet. Obwohl keine sichtbaren Läsionen beobachtet wurden5, ist der Test mit höherer Sensitivität mit EB erwünscht.
Hier wird die BHS-Permeabilität mit einem handelsüblichen chirurgischen Bohrroboter mit entsprechender Software gemessen, die die Programmierung stereotaktischer Koordinaten, die Kraniotomieplanung/-kartierung und eine Auswahl von Bohrstilen ("Punkt-für-Punkt" vs. "horizontal") in Bezug auf den gerouteten Weg des Bohrmeißels ermöglicht. Zunächst werden acht "Seed"-Punkte gebohrt (Abbildung 1A), die das Schädelfenster umreißen. Von hier aus wird der Raum zwischen den Samen entweder mit der "Punkt-für-Punkt"- oder "horizontalen" Drillmethode ausgeschnitten. "Punkt-für-Punkt" führt vertikale Pilotlochschnitte durch (ähnlich wie bei einer CNC-Bohrmaschine), während "horizontal" horizontale Schnitte entlang des Umfangs des Schädelfensters ausführt, die das Loch umreißen (ähnlich wie bei einem CNC-Fräser). Das Ergebnis für beide Methoden ist ein Stück Schädel, das entfernt werden kann, um das Schädelfenster freizulegen. Um Schäden durch Bohrungen zu vermeiden, wird das Schädelfenster nicht physisch entfernt, um zusätzliche Schäden zu vermeiden. Eine Kombination aus EB-Farbstoff in Verbindung mit Fluoreszenzbildgebung wird verwendet, um die BHS-Permeabilität nach der Durchführung von Kraniotomien bei Mäusen zu messen, und ein eingesetztes Thermoelement wird verwendet, um die Temperatur der Gehirnoberfläche während des Bohrens direkt zu messen (Abbildung 1B, C). Frühere Beobachtungen deuteten darauf hin, dass das gepulste Ein- und Ausschalten des Bohrens mit Intervallen von 2 s ausreicht, um die Erwärmung des Bohrers25 zu verringern, und daher in den experimentellen Ansatz für den Operationsroboter einbezogen wird.
Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, Methoden zur Beurteilung thermischer Schäden durch Kraniotomiebohrungen zu demonstrieren. Während die Methoden im Kontext des automatisierten Bohrens vorgestellt werden, können solche Methoden auch auf manuelle Bohrschemata angewendet werden. Diese Methoden können verwendet werden, um die Verwendung von Geräten und/oder Bohrschemata zu validieren, bevor sie als Standardverfahren übernommen werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64188/64188fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der experimentellen Pipeline. Schematische Darstellung des Prozesses, dem die Tiere nach dem kranialen Fensterverfahren zur EB-Quantifizierung unterzogen wurden. (A) Schematischer Aufbau der Maus mit dem stereotaktischen Rahmen und dem chirurgischen Roboterbohrer. Ein Beispiel für ein kraniales Fenster ist über dem motorischen Kortex mit Startpunkten (grün) und Kantenpunkten (blau) dargestellt. (B) Der Perfusionsaufbau umfasst die Injektion von 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) in das gesamte Tier, um Blut zu entfernen, gefolgt von der Extraktion des Gehirns. (C) Das Gehirn wird dann in die Kammer des EB-Fluoreszenzbildgebungssystems gegeben, um eine Fluoreszenzbildgebung mit dem Farbstoff Evans Blue durchzuführen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64188/64188fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline 
			Type: Reagent</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MRGF-6235</td>
			<td>For Evans Blue dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aura Software 
			Type: Tool</td>
			<td>Spectral Instruments Imaging</td>
			<td></td>
			<td>Open access imaging processing software for Lumina imaging sytems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine 
			Type: Drug</td>
			<td>Sourced from Animal Facility</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbide Drill Bit, 0.6mm (Robot Drill) 
			Type: Tool</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>58640-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen 
			Type: Drug</td>
			<td>Sourced from Animal Facility</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin 
			Type: Drug</td>
			<td>Sourced from Animal Facility</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue Dye 
			Type: Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E2129</td>
			<td>Reconstituted in 1x phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 
			Type: Drug</td>
			<td>Sourced from Animal Facility</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina II 
			Type: Tool</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td>IVIS Lumina III currently in place of Lumina II on the market</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jenco Linearizing Thermometer 
			Type: Tool</td>
			<td>Jenco</td>
			<td>765JF</td>
			<td>For Thermocouple setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 
			Type: Drug</td>
			<td>Sourced from Animal Facility</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LivingImage 
			Type: Tool</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Software for IVIS Lumina III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marcaine 
			Type: Drug</td>
			<td>Sourced from Animal Facility</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurostar Software 
			Type: Tool</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Comes with surgical robot purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiosuite with MouseSTAT&#174; Pulse Oximeter &#38; Heart Rate Monitor 
			Type: Tool</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>PS-03</td>
			<td>Used to monitor vitals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrismPlus mice 
			Type: Animal</td>
			<td>Jackson Labortory</td>
			<td>031478, RRID:IMSR_JAX:031478, Male, ~8 months old</td>
			<td>Animals used for the study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stoelting Drill and Injection Robot for Motorized Stereotaxic Instruments 
			Type: Tool</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>58640</td>
			<td>Main robotic drill with stereotaxic frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple 
			Type: Tool</td>
			<td>TC Direct</td>
			<td>206-557</td>
			<td>For Thermocouple setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-6008 Multifunction I/O DAQ 
			Type: Tool</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>USB-6008</td>
			<td>For Thermocouple setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 
			Type: Drug</td>
			<td>Sourced from Animal Facility</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice

Die Schädelfensterchirurgie ermöglicht die Bildgebung von Hirngewebe bei lebenden Mäusen unter Verwendung von Multiphotonen oder anderen intravitalen Bildgebungsverfahren. Bei der Durchführung einer Kraniotomie von Hand kommt es jedoch häufig zu einer thermischen Schädigung des Hirngewebes, die von Natur aus von Chirurgie zu Operation variiert und von der Technik des einzelnen Chirurgen abhängen kann. Die Implementierung eines chirurgischen Roboters kann die Chirurgie standardisieren und zu einer Verringerung der mit der Operation verbundenen thermischen Schäden führen. In dieser Studie wurden drei Methoden des Roboterbohrens getestet, um thermische Schäden zu bewerten: horizontal, Punkt für Punkt und gepulst Punkt für Punkt. Beim Horizontalbohren wird ein kontinuierliches Bohrschema verwendet, während bei Punkt-für-Punkt-Bohrungen mehrere Löcher gebohrt werden, die das Schädelfenster umfassen. Die gepulste Punkt-für-Punkt-Bohrung fügt ein Bohrschema "2 s an, 2 s aus" hinzu, um eine Abkühlung zwischen den Bohrungen zu ermöglichen. Die Fluoreszenzbildgebung des intravenös injizierten Farbstoffs Evans Blue (EB) misst die Schädigung des Hirngewebes, während ein Thermoelement, das unter der Bohrstelle platziert ist, die thermische Schädigung misst. Die Thermoelementergebnisse deuten auf eine signifikante Abnahme der Temperaturänderung in der gepulsten Punkt-für-Punkt-Gruppe (6,90 °C ± 1,35 °C) im Vergleich zu den horizontalen (16,66 °C ± 2,08 °C) und Punkt-für-Punkt-Gruppen (18,69 °C ± 1,75 °C) hin. In ähnlicher Weise zeigte auch die gepulste Punkt-für-Punkt-Gruppe nach der kranialen Fensterbohrung im Vergleich zur horizontalen Methode eine signifikant geringere EB-Präsenz, was auf eine geringere Schädigung der Blutgefäße im Gehirn hinweist. Daher scheint ein gepulstes Punkt-für-Punkt-Bohrverfahren das optimale Schema zur Reduzierung thermischer Schäden zu sein. Ein Roboterbohrer ist ein nützliches Werkzeug, um das Training und die Variabilität zu minimieren und thermische Schäden zu reduzieren. Mit dem zunehmenden Einsatz von Multiphotonen-Bildgebung in Forschungslaboren ist es wichtig, die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu verbessern. Die hier angesprochenen Methoden werden dazu beitragen, andere darüber zu informieren, wie diese chirurgischen Roboter besser eingesetzt werden können, um das Feld weiter voranzubringen.

Thermische Auswertung Das Potenzial für thermische Schäden wurde bewertet, indem die Temperaturänderung gegenüber der Basislinie aufgrund von Bohrungen mit horizontalen (Abbildung 2A), Punkt-für-Punkt- (Abbildung 2B) und gepulsten Punkt-für-Punkt-Methoden (Abbildung 2C) gemessen wurde. Abbildung 2D zeigt den Versuchsaufbau zur Gewinnung thermischer Daten. Für die thermische Au...

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Assessment of Thermal Damage from Robot-Drilled Craniotomy for Cranial Window Surgery in Mice

Schädelfenster sind zu einer allgegenwärtig eingesetzten Operationstechnik geworden, um eine intravitale Bildgebung bei transgenen Mäusen zu ermöglichen. Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines chirurgischen Roboters, der halbautomatische Knochenbohrungen von Schädelfenstern durchführt und dazu beitragen kann, die Variabilität von Chirurg zu Chirurg zu verringern und die Schädigung der thermischen Blut-Hirn-Schranke teilweise zu mildern.

Abschätzung der thermischen Schädigung durch robotergebohrte Kraniotomie bei der kranialen Fensterchirurgie bei Mäusen

Cranial window surgery allows for the imaging of brain tissue in live mice with the use of multiphoton or other intravital imaging techniques. However, ...

Dieses Protokoll bietet eine Methode zur Beurteilung von Gefäßschäden als Folge von Schädelfensterbohrungen. Ein chirurgischer Roboter bietet eine verbesserte Konsistenz bei allen Eingriffen und reduziert gleichzeitig den Schulungsaufwand für das Erlernen der Technik. Während dieses Verfahrens verwendeten wir kraniale Injektionen, die sehr schwierig sein können.Wir empfehlen ein umfangreiches Training für diejenigen, die neu in der Technik sind. Richten Sie zunächst das System wie im Manuskript beschrieben ein und führen Sie die Rahmenkalibrierung gemäß dem Handbuch des Operationsroboters durch. Navigieren Sie zur chirurgischen Software und erstellen Sie ein neues Projekt, indem Sie Mit einem sauberen Projekt beginnen auswählen.Stellen Sie dann oben das Motiv als Maus ein, um den zu verwendenden Bohrkoordinatenatlas zu bestimmen. Wählen Sie als Nächstes Neues Projekt starten und klicken Sie in der unteren linken Ecke auf Planung, um zum Bildschirm für die Bohrkoordinatenplanung zu navigieren. Erstellen Sie das Bohrschema für die durchzuführende Schädelfenstertechnik, indem Sie auf eine beliebige Stelle im stereotaktischen Atlas klicken.Verwenden Sie bregma als Referenz und geben Sie die Koordinaten für den motorischen Kortex ein, wie im Manuskript beschrieben. Drücken Sie die Eingabetaste auf der Tastatur, um die ausgewählten Koordinaten zu aktualisieren. Klicken Sie auf Ziel speichern, um diese Koordinaten zu speichern und einen geeigneten Namen einzugeben.Klicken Sie dann unten links auf die Schaltfläche "Verschieben", um zurück zum Hauptbohrbildschirm zu navigieren. Klicken Sie auf Werkzeuge, dann auf Projizieren und speichern unter, um dieses Vorlagenprojekt für spätere Projekte wiederzuverwenden, da die Bohrkoordinaten automatisch beibehalten werden. Verabreichen Sie der anästhesierten Maus zunächst subkutane Injektionen von Antibiotika, Cefazolin, Analgetika, Carprofen und Buprenorphin.Als nächstes legen Sie die Maus auf ein Heizkissen und halten Sie die Anästhesie mit 0,5 % bis 2 % Isofluran durch Inhalation durch einen Nasenkegel aufrecht. Befestigen Sie das Tier mit den mitgelieferten Ohrbügeln auf dem stereotaktischen Rahmen des Operationsroboters und beurteilen Sie routinemäßig die Vitalwerte und die Anästhesietiefe durch Zehenkneifen. Schrubben Sie dann den Operationsbereich zur Sterilisation mit Chlorhexidingluconat und 70%igem Isopropanol.Legen Sie eine sterile Plastikfolie über die Maus und den stereotaktischen Rahmen, um die Sterilität während der Operation zu erhalten. Führen Sie mit einer Skalpellklinge einen Einschnitt von einem Zoll an der Mittellinie des Schädels durch, beginnend im hinteren Bereich der Augen, trocknen Sie den Schädel ab und reinigen Sie ihn mit 3%igem Wasserstoffperoxid mit Applikatoren mit Wattespitze. Um den Schwanz für eine einfache Injektion vorzubereiten, wischen Sie ihn mit Alkohol ab.Beugen Sie mit Daumen und Zeigefinger den Schwanz, um die Schwanzvene über der Schwanzbiegung freizulegen. Führen Sie die Spritze parallel zur Vene ein und injizieren Sie langsam das Volumen von Evansblau. Warten Sie nach der Injektion fünf Minuten, damit Evans-Blau zirkulieren kann.Eine erfolgreiche Injektion wird sofort überprüft, wenn sich die Extremitäten und das Operationsfenster der Maus blau färben. Sobald der Schädel für das Bohren vorbereitet ist, navigieren Sie zurück zur chirurgischen Software und klicken Sie auf Werkzeuge. Wählen Sie dann Projekt aus, gefolgt von neu, und wählen Sie ein Vorlagenprojekt aus dem Dropdown-Menü aus, um ein Vorlagenprojekt auszuwählen.Wählen Sie die gleichen Protokollelemente aus. Klicken Sie auf Planung, wählen Sie dann die Bohrparameter aus, die auf dieses neue Projekt übertragen werden sollen, und klicken Sie auf Neues Projekt starten. Korrigieren Sie als Nächstes die Bohrung und den Rahmen, um die Neigung und Skalierung des Mausschädels des aktuellen Tieres zu berücksichtigen, indem Sie auf Werkzeuge klicken, und wählen Sie Neigung und Skalierung korrigieren aus, um den Korrekturbildschirm zu öffnen.Stellen Sie am oberen Bildschirmrand sicher, dass der Bohrer aktiv ist, indem Sie auf die hellrote Bohrschaltfläche klicken. Nachdem die Korrektur durchgeführt wurde, verlassen Sie das Korrekturfenster, indem Sie unten in der Mitte des Bildschirms auf Schließen klicken, und navigieren Sie zum Bohrbildschirm, indem Sie auf Werkzeuge klicken und dann Bohren auswählen, um den Bohrvorgang zu starten. Bestätigen Sie die Bohrstelle, indem Sie oben auf dem Bildschirm das Fenster für die Kraniotomieform auswählen und anschließend die Details des Bohrziels in der Dropdown-Liste unten anzeigen. Um manuelles Impulsbohren durchzuführen, deaktivieren Sie die Auto-Stopp-Funktion, indem Sie das Kontrollkästchen neben der Auto-Stopp-Option im Bohrmenü deaktivieren, mit dem Sie steuern können, wann der Bohrer für das Pulsieren ausgeschaltet ist.Wählen Sie im Bohrmenü 100 Mikrometer als Bohrtiefenvorschub aus. Öffnen Sie das Bohrstellenmenü und navigieren Sie zur ersten Bohrstelle. Verwenden Sie die Vorschubtaste oder die manuellen Bedienelemente, um den Bohrer abzusenken, bis er den Schädel berührt, und drücken Sie auf die eingestellte Oberfläche, sobald der Bohrer den Schädel erreicht.Wenn Sie fertig sind, klicken Sie auf Vorwärts, um mit der Bohrung zu beginnen. Und nachdem der Bohrer 100 Mikrometer vorgerückt ist, drücken Sie zweimal die Esc-Taste, um den Bohrer zu stoppen. Wiederholen Sie diesen Zyklus nach zwei Sekunden für die Tiefe des Schädels.Stellen Sie sicher, dass Sie für jeden Saat- und Kantenpunkt während der Aussaat die Dura über die Schaltfläche im Bohrmenü einstellen, sobald die Dura erreicht ist. Messen Sie die Temperaturänderungen des Schädels und des Gehirns mit einem Thermoelement in Kombination mit den drei verschiedenen Bohrschemata, die mit einem Datenerfassungssystem verbunden sind, das das Einlesen der Messung in MATLAB ermöglicht. Montieren Sie eine Kadavermaus auf dem stereotaktischen Rahmen und dem Roboterbohrer.Bohren Sie manuell ein kleines Loch etwa zwei Millimeter entfernt von der Stelle, an der das Schädelfenster gemacht werden soll, in die Seite des Schädels, wodurch das Thermoelement in Position geschoben werden kann, unter der das Bohren des Schädelfensters erfolgt. Beginnen Sie den Bohrvorgang für jedes der drei Schemata wie zuvor gezeigt, was zu Spitzen aufgrund von Temperaturänderungen führt, was darauf hindeutet, dass die Erwärmung in der Nähe des Gehirns auftritt, wenn der Bohrer durch den Schädel geht. Das Potenzial für thermische Schäden wurde bewertet, indem die Temperaturänderung gegenüber der Basislinie aufgrund von Bohrungen mit horizontalen, Punkt-für-Punkt- und gepulsten Punkt-für-Punkt-Methoden gemessen wurde.Sowohl die horizontalen als auch die Punkt-für-Punkt-Bohrschemata zeigen nicht signifikante Unterschiede in den thermischen Änderungen. Die Umstellung auf eine gepulste Punkt-für-Punkt-Methode führte jedoch zu einer deutlich geringeren Erwärmung des Gehirns als sowohl horizontales als auch Punkt-für-Punkt-Bohren. Das horizontale Kantenbohren dauerte 300 Sekunden, das Punkt-für-Punkt-Kantenbohren 200 Sekunden.Die Pulsmethode dauerte mit Saat- und Kantensaat am längsten und dauerte jeweils etwa 500 Sekunden. Um den Zusammenhang zwischen dem Bohrschema und der Gefäßschädigung zu überwachen, wurde eine Evans-Blaufluoreszenzbildgebung durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass das Bohren durch horizontales und punktuelles Schneiden die Gefäße im Gehirn schädigt.Im Vergleich zu den Kontrollgruppen wies die gepulste Punkt-für-Punkt-Methode eine geringere lokale Schädigung am Seed- und Randpunkt auf, wies aber immer noch eine sichtbare Evans-Blau-Präsenz innerhalb des Schädelfensters auf. Beim manuellen Bohren ist es wichtig, die Kraniotomie nach dem Vorschieben des Bohrers zu überprüfen, um sicherzustellen, dass die Dura nicht durchbrochen wird. Zusätzlich zu den Schädelfenstern kann ein Operationsroboter für Standard-Kraniotomien eingesetzt werden, um die Operationsergebnisse zu verbessern.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Intravitalmikroskopie von Gehirn der Maus Mikrozirkulation mit einem Closed Cranial Fenster

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Forschung

Neurowissenschaften

Assessment of Morphine-induced Hyperalgesia and Analgesic Tolerance in Mice Using Thermal and Mechanical Nociceptive Modalities

Bewertung von Morphin-induzierte Hyperalgesie und Schmerztoleranz in Mäuse mit Thermal-und Maschinen Nozizeptive Modalitäten

Opioid-induced hyperalgesia and tolerance severely impact the clinical efficacy of opiates as pain relievers in animals and humans. The molecular ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Chronic Cranial Fenster Vorbereitung Ermöglicht<em&gt; In Vivo</em&gt; Beobachtung Nach Artery Occlusion Distal cerebri bei Mäusen

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Bewertung der Hippocampalen Dendritischen Komplexität bei gealterten Mäusen unter Verwendung der Golgi-Cox-Methode

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezo-hohe Genauigkeit chirurgische Osteal Entfernung (PHASOR): Eine Technik für verbesserte kranialen Fenster Chirurgie bei Mäusen

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Kraniotomie-Verfahren zur Visualisierung neuronaler Aktivitäten im Hippocampus von sich benehmenden Mäusen

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation eines kranialen Fensters für wiederholte In-vivo-Bildgebung bei wachen Mäusen

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Assessment of Sensory Thresholds in Dogs Using Mechanical and Hot Thermal Quantitative Sensory Testing

Beurteilung sensorischer Schwellenwerte bei Hunden mittels mechanischer und heißer thermischer quantitativer sensorischer Tests

Quantitative sensory testing (QST) is used to evaluate the function of the somatosensory system in dogs by assessing the response to applied mechanical ...

Dosage-Adjusted Resistance Training in Mice with a Reduced Risk of Muscle Damage

Dosiertes Widerstandstraining bei Mäusen mit reduziertem Risiko für Muskelschäden

Progressive resistance training (PRT), which involves performing muscle contractions against progressively greater external loads, can increase muscle ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

Im lebenden Organismus Weitfeld- und Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung einer Maus mit einem großen Schädelfenster

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...