Name: assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice
Uploaded: 2022-11-11T13:20:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessment of Thermal Damage from Robot-Drilled Craniotomy for Cranial Window Surgery in Mice at JoVE.com

Este estudio fue apoyado en parte por los premios de revisión de mérito GRANT12418820 (Capadona) y GRANTI01RX003420 (Shoffstall / Capadona), y el Premio al Científico de Carrera de Investigación # GRANT12635707 (Capadona) del Servicio de Investigación y Desarrollo de Rehabilitación del Departamento de Asuntos de Veteranos de los Estados Unidos (EE. Además, este trabajo también fue apoyado en parte por el Instituto Nacional de Salud, el Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares GRANT12635723 (Capadona) y el Instituto Nacional de Imágenes Biomédicas y Bioingeniería, T32EB004314, (Capadona / Kirsch). Este material se basa en el trabajo apoyado por la National Science Foundation Graduate Research Fellowship bajo la subvención No. GRANT12635723. Cualquier opinión, hallazgo, conclusión o recomendación expresada en este material son las de los autores y no reflejan necesariamente los puntos de vista de la National Science Foundation.

Todos los procedimientos y prácticas de cuidado de animales fueron revisados, aprobados y realizados de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico del Departamento de Asuntos de Veteranos Louis Stokes Cleveland.
1. Configuración del hardware del robot quirúrgico
<ol><li>Antes de la cirugía, siga el manual y la guía del robot quirúrgico (consulte la Tabla de materiales) para configurar el hardware y el software....

<ol>
	<li>Kilic, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cranial+windows+for+long+term+multimodal+neurovascular+imaging+in+mice.">Chronic cranial windows for long term multimodal neurovascular imaging in mice.</a> Frontiers in Physiology. 11, 612678 (2020).</li><li>Goldey, G. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+for+thermal+damage+to+the+blood-brain+barrier+during+craniotomy:+implications+for+intracortical+recording+microelectrodes.">Potential for thermal damage to the blood-brain barrier during craniotomy: implications for intracortical recording microelectrodes.</a> Journal of Neural Engineering. 15 (3), 034001 (2018).</li><li>Saunders, N. R., Dziegielewska, K. M., Mollgard, K., Habgood, M. 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D., Zhang, J., Feng, H., Gong, S., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+transgenesis+in+a+single+locus+with+independent+regulation+for+multiple+fluorophores.">Mouse transgenesis in a single locus with independent regulation for multiple fluorophores.</a> PLoS One. 7 (7), 40511 (2012).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+fractalkine+receptor+CX(3)CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion.">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Molecular and Cellular Biology. 20 (3), 4106-4114 (2000).</li><li>Kiyatkin, E. A., Sharma, H. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temperature+dependence+of+the+deformation+of+bone.">The temperature dependence of the deformation of bone.</a> Journal of Biomechanics. 1 (4), 323-329 (1968).</li><li>Hrapkiewicz, K., Medina, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Clinical Laboratory Animal Medicine, second ed. , (2007).</li><li>McLean, R., Moritz, A. R., Roos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+thermal+Injury.+VI.+Hyperpotassemia+caused+by+cutaneous+exposure+to+excessive+heat.">Studies of thermal Injury. VI. Hyperpotassemia caused by cutaneous exposure to excessive heat.</a> Journal of Clinical Investigations. 26 (3), 497-504 (1947).</li><li>Kyweriga, M., Sun, J., Wang, S., Kline, R., Mohajerani, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+lateral+craniotomy+procedure+for+mesoscale+wide-field+optical+imaging+of+brain+activity.">A large lateral craniotomy procedure for mesoscale wide-field optical imaging of brain activity.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e52642 (2017).</li></ol>

El uso del tinte EB y las imágenes es sencillo, rápido y útil para evaluar el daño vascular en el cerebro para nuevos métodos y técnicas. Ya sea utilizando un robot quirúrgico o confirmando los métodos que se realizan actualmente en el laboratorio, es importante validar los métodos quirúrgicos para aislar los efectos de los tratamientos experimentales frente al impacto quirúrgico y mejorar el bienestar animal. Una configuración de termopar también es útil para evaluar los métodos de perforación para garan...

Las ventanas craneales se han utilizado ubicuamente en los campos de la neurociencia, la ingeniería neuronal y la biología para permitir la visualización directa y la obtención de imágenes de la corteza en animales vivos 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . La poderosa combinación de ratones transgénicos e imágenes multifotónicas ha proporcionado información extremadamente valiosa sobre la actividad del circuito y otras ideas biológicas en el cerebro in vivo 12,13,14,15,16,17,18. Los microscopios en miniatura montados en el cráneo han ampliado aún más estas capacidades para permitir grabaciones en animales despiertos que se mueven libremente19. El proceso de creación de una ventana craneal requiere perforación eléctrica para adelgazar o eliminar completamente el hueso craneal para producir craneotomías lo suficientemente grandes como para asegurar una pieza transparente de vidrio sobre la corteza20. El polidimetilsiloxano (PDMS) y otros polímeros también han sido probados como materiales de ventana craneal 9,21. En última instancia, la ventana craneal ideal es aquella que no altera ni interfiere con la actividad endógena normal debajo. Sin embargo, es comúnmente aceptado que la perforación de la ventana craneal agrava el tejido subyacente, lo que lleva a daños en el cerebro, alteración del medio ambiente y meninges hasta el punto de ocluir la profundidad de la imagen multifotónica22. La neuroinflamación resultante tiene una amplia gama de efectos que van desde la permeabilidad de la barrera hematoencefálica (BHE) hasta la activación y el reclutamiento de células gliales alrededor del sitio del implante23. Por lo tanto, la caracterización de métodos de perforación de ventanas craneales más seguros y reproducibles es crucial para una calidad de imagen consistente y reducir los factores de confusión.
Mientras que se tiene cuidado de minimizar el trauma en el tejido subyacente, el acto de perforar el hueso tiene el potencial de causar perturbaciones térmicas y mecánicas al cerebro24,25. El trauma mecánico por penetración accidental del taladro en la duramadre puede inducir diversos grados de lesión cortical24. En un estudio de Shoffstall et al.25, el calor de la perforación ósea resultó en un aumento de la permeabilidad BBB, como lo indica la presencia de colorante Evans Blue (EB) en el parénquima cerebral 25. El colorante EB, inyectado por vía intravenosa, se une a la albúmina circulante en el torrente sanguíneo y, por lo tanto, normalmente no cruza una barrera hematoencefálica saludable en concentraciones apreciables. Como resultado, el colorante EB se utiliza comúnmente como un marcador sensible de la permeabilidad BBB26,27. Si bien su estudio no midió directamente el impacto de la permeabilidad de la BHE en las secuelas biológicas posteriores en estudio, estudios previos han correlacionado la permeabilidad de la BHE con una mayor respuesta neuroinflamatoria a microelectrodos implantados crónicamente y alteraciones en la función motora28.
Dependiendo de los objetivos del estudio, la magnitud del daño térmico y mecánico puede contribuir a una fuente de error experimental, afectando negativamente el rigor y la reproducibilidad del estudio. Hay docenas de métodos citados para producir ventanas craneales, cada uno utilizando diferentes equipos de perforación, velocidades, técnicas y usuarios 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11. Shoffstall et al.25 informaron que la variación observada en los resultados de calentamiento se atribuyó a la variabilidad en la fuerza aplicada, la velocidad de avance y el ángulo de aplicación del taladro, entre otros aspectos que no pueden controlarse cuando se perfora a mano 25. Existe la creencia de que los sistemas de perforación automatizados y otros equipos estereotáxicos pueden mejorar la reproducibilidad y la consistencia de los resultados, pero los estudios de métodos publicados no han evaluado rigurosamente la temperatura o la permeabilidad de la barrera hematoencefálica como uno de los resultados. Por lo tanto, existe la necesidad de métodos más reproducibles y consistentemente aplicados para producir ventanas craneales, así como métodos rigurosamente aplicados para evaluar el impacto de la perforación de ventanas craneales en el tejido neural subyacente.
El objetivo de este estudio es determinar y desarrollar métodos de perforación consistentes y seguros para ventanas craneales. El tamaño de la craneotomía para la instalación de la ventana craneal es significativamente mayor que las craneotomías estándar para microelectrodos implantados en el cerebro. Tales craneotomías no pueden completarse con un solo orificio de rebaba cuando se utiliza equipo estándar, introduciendo así más variabilidad de la técnica intercirujano cuando se realiza a mano20. Los robots de perforación quirúrgica se han introducido en el campo, pero no han sido ampliamente adoptados 1,6,29. La automatización de la perforación ofrece control sobre las variables que contribuyen a la variación observada de ensayo a ensayo, lo que sugiere que el uso del equipo puede reducir los efectos inter e intracirujanos. Esto es de particular interés dada la dificultad añadida de la craneotomía más grande necesaria para la colocación de la ventana craneal. Si bien se podría suponer que hay beneficios claros para el control proporcionado por la automatización de la perforación, ha habido poca evaluación de la implementación de estos equipos. Aunque no se han observado lesiones visibles5, se desea la prueba de mayor sensibilidad con EB.
Aquí, la permeabilidad BBB se mide utilizando un robot de perforación quirúrgica disponible comercialmente con el software correspondiente, que permite la programación de coordenadas estereotáxicas, planificación / mapeo de craneotomía y una selección de estilos de perforación ("punto por punto" vs "horizontal"), refiriéndose a la trayectoria enrutada de la broca. Inicialmente, se perforan ocho puntos de "semilla" (Figura 1A), delineando la ventana craneal. A partir de aquí, el espacio entre las semillas se corta utilizando el método de perforación "punto por punto" u "horizontal". "Punto por punto" realiza cortes verticales de orificios piloto (similares a una prensa de perforación CNC), mientras que "horizontal" realiza cortes horizontales a lo largo de la circunferencia de la ventana craneal que delinea el orificio (similar a un enrutador CNC). El resultado para ambos métodos es un pedazo de cráneo que se puede quitar para revelar la ventana craneal. Para aislar el daño de la perforación, la ventana craneal no se retira físicamente, a fin de evitar cualquier daño adicional. Se utiliza una combinación de colorante EB junto con imágenes fluorescentes para medir la permeabilidad BBB después de realizar craneotomías en ratones, y un termopar insertado se utiliza para medir directamente la temperatura de la superficie cerebral durante la perforación (Figura 1B, C). Observaciones anteriores indicaron que la perforación pulsada encendido / apagado con intervalos de 2 s fue suficiente para mitigar el calentamiento de la perforación25, y por lo tanto se incorpora al enfoque experimental para el robot quirúrgico.
La intención del trabajo presentado es demostrar métodos para evaluar el daño térmico de la perforación de craneotomía. Si bien los métodos se presentan en el contexto de la perforación automatizada, dichos métodos también se pueden aplicar a los esquemas de perforación manual. Estos métodos se pueden utilizar para validar el uso de equipos y / o esquemas de perforación antes de adoptarlos como procedimiento estándar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64188/64188fig01.jpg"> Figura 1: Esquema experimental de tuberías. Esquema que demuestra el proceso al que se sometieron los animales para el procedimiento de cuantificación de EB después de la ventana craneal. (A) Configuración esquemática del ratón con el marco estereotáxico y el taladro quirúrgico del robot. Un ejemplo de ventana craneal se muestra sobre la corteza motora con puntos semilla (verde) y puntos de borde (azul). (B) La configuración de perfusión incluye inyectar 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS) en todo el animal para eliminar cualquier sangre, seguida de la extracción del cerebro. (C) Luego, el cerebro se coloca en la cámara del sistema de imágenes fluorescentes EB para realizar imágenes fluorescentes en el tinte Evans Blue. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64188/64188fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x Phosphate Buffered Saline 
			Type: Reagent</td>
			<td>VWR</td>
			<td>MRGF-6235</td>
			<td>For Evans Blue dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aura Software 
			Type: Tool</td>
			<td>Spectral Instruments Imaging</td>
			<td></td>
			<td>Open access imaging processing software for Lumina imaging sytems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine 
			Type: Drug</td>
			<td>Sourced from Animal Facility</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbide Drill Bit, 0.6mm (Robot Drill) 
			Type: Tool</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>58640-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carprofen 
			Type: Drug</td>
			<td>Sourced from Animal Facility</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cefazolin 
			Type: Drug</td>
			<td>Sourced from Animal Facility</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Evans Blue Dye 
			Type: Reagent</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>E2129</td>
			<td>Reconstituted in 1x phosphate-buffered saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 
			Type: Drug</td>
			<td>Sourced from Animal Facility</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS Lumina II 
			Type: Tool</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>CLS136334</td>
			<td>IVIS Lumina III currently in place of Lumina II on the market</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jenco Linearizing Thermometer 
			Type: Tool</td>
			<td>Jenco</td>
			<td>765JF</td>
			<td>For Thermocouple setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketamine 
			Type: Drug</td>
			<td>Sourced from Animal Facility</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LivingImage 
			Type: Tool</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>Software for IVIS Lumina III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marcaine 
			Type: Drug</td>
			<td>Sourced from Animal Facility</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurostar Software 
			Type: Tool</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>Comes with surgical robot purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Physiosuite with MouseSTAT&#174; Pulse Oximeter &#38; Heart Rate Monitor 
			Type: Tool</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>PS-03</td>
			<td>Used to monitor vitals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrismPlus mice 
			Type: Animal</td>
			<td>Jackson Labortory</td>
			<td>031478, RRID:IMSR_JAX:031478, Male, ~8 months old</td>
			<td>Animals used for the study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stoelting Drill and Injection Robot for Motorized Stereotaxic Instruments 
			Type: Tool</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>58640</td>
			<td>Main robotic drill with stereotaxic frame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocouple 
			Type: Tool</td>
			<td>TC Direct</td>
			<td>206-557</td>
			<td>For Thermocouple setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USB-6008 Multifunction I/O DAQ 
			Type: Tool</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>USB-6008</td>
			<td>For Thermocouple setup</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine 
			Type: Drug</td>
			<td>Sourced from Animal Facility</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of thermal damage from robot-drilled craniotomy for cranial window surgery in mice

La cirugía de ventana craneal permite la obtención de imágenes del tejido cerebral en ratones vivos con el uso de multifotones u otras técnicas de imagen intravital. Sin embargo, cuando se realiza cualquier craneotomía a mano, a menudo hay daño térmico al tejido cerebral, que es inherentemente variable de cirugía a cirugía y puede depender de la técnica individual del cirujano. La implementación de un robot quirúrgico puede estandarizar la cirugía y conducir a una disminución del daño térmico asociado con la cirugía. En este estudio, se probaron tres métodos de perforación robótica para evaluar el daño térmico: horizontal, punto por punto y pulsado punto por punto. La perforación horizontal utiliza un esquema de perforación continua, mientras que punto por punto perfora varios agujeros que abarcan la ventana craneal. El pulsado punto por punto agrega un esquema de perforación "2 s encendido, 2 s apagado" para permitir el enfriamiento entre perforaciones. Las imágenes fluorescentes del tinte Evans Blue (EB) inyectado por vía intravenosa miden el daño al tejido cerebral, mientras que un termopar colocado debajo del sitio de perforación mide el daño térmico. Los resultados del termopar indican una disminución significativa en el cambio de temperatura en el grupo pulsado punto por punto (6.90 °C ± 1.35 °C) en comparación con los grupos horizontal (16.66 °C ± 2.08 °C) y punto por punto (18.69 °C ± 1.75 °C). Del mismo modo, el grupo pulsado punto por punto también mostró significativamente menos presencia de EB después de la perforación de la ventana craneal en comparación con el método horizontal, lo que indica menos daño a los vasos sanguíneos en el cerebro. Por lo tanto, un método de perforación pulsado punto por punto parece ser el esquema óptimo para reducir el daño térmico. Un taladro robótico es una herramienta útil para ayudar a minimizar el entrenamiento, la variabilidad y reducir el daño térmico. Con el uso cada vez mayor de imágenes multifotónicas en los laboratorios de investigación, es importante mejorar el rigor y la reproducibilidad de los resultados. Los métodos abordados aquí ayudarán a informar a otros sobre cómo utilizar mejor estos robots quirúrgicos para avanzar aún más en el campo.

Evaluación térmica El potencial de daño térmico se evaluó midiendo el cambio en la temperatura desde la línea de base debido a la perforación utilizando métodos horizontales (Figura 2A), punto por punto (Figura 2B) y pulsados punto por punto (Figura 2C). La figura 2D muestra la configuración experimental para obtener datos térmicos. Se utilizó un tamaño de muestra de N = ...

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Assessment of Thermal Damage from Robot-Drilled Craniotomy for Cranial Window Surgery in Mice

Las ventanas craneales se han convertido en una técnica quirúrgica implementada ubicuamente para permitir imágenes intravitales en ratones transgénicos. Este protocolo describe el uso de un robot quirúrgico que realiza perforaciones óseas semiautomáticas de ventanas craneales y puede ayudar a reducir la variabilidad de cirujano a cirujano y mitigar parcialmente el daño de la barrera térmica hematoencefálica.

Evaluación del daño térmico de la craneotomía perforada por robot para la cirugía de ventana craneal en ratones

Cranial window surgery allows for the imaging of brain tissue in live mice with the use of multiphoton or other intravital imaging techniques. However, ...

Este protocolo proporciona un método para evaluar el daño vascular como resultado de la perforación de la ventana craneal. Un robot quirúrgico ofrece consistencias mejoradas en todos los procedimientos al tiempo que reduce la cantidad de entrenamiento para aprender la técnica. Durante este procedimiento, utilizamos inyecciones craneales que pueden ser muy desafiantes.Recomendamos un entrenamiento extensivo para aquellos nuevos en la técnica. Para comenzar, configure el sistema como se describe en el manuscrito y realice la calibración del marco siguiendo el manual del robot quirúrgico. Navegue hasta el software quirúrgico y cree un nuevo proyecto seleccionando comenzar con un proyecto limpio.A continuación, establezca el sujeto como ratón en la parte superior para designar el atlas de coordenadas de perforación que se utilizará. A continuación, seleccione iniciar nuevo proyecto y haga clic en planificación en la esquina inferior izquierda para navegar a la pantalla de planificación de coordenadas de perforación. Cree el esquema de perforación para la técnica de ventana craneal que se realizará haciendo clic en cualquier parte del atlas estereotáxico.Use bregma como referencia e ingrese las coordenadas para la corteza motora como se describe en el manuscrito. Pulse Intro en el teclado para actualizar las coordenadas seleccionadas. Haga clic en almacenar destino para guardar estas coordenadas e introducir un nombre adecuado.Luego haga clic en el botón de mover en la parte inferior izquierda para navegar de regreso a la pantalla principal de perforación. Haga clic en herramientas, luego en proyectar y guardar como opción para reutilizar este proyecto de plantilla para proyectos posteriores, ya que conservará automáticamente las coordenadas de perforación. Primero, administre inyecciones subcutáneas de antibióticos, cefazolina, analgésico, carprofeno y buprenorfina al ratón anestesiado.A continuación, coloque el ratón en una almohadilla térmica y mantenga la anestesia con 0.5% a 2% isoflurano por inhalación a través de un cono nasal. Monte al animal en el marco estereotáxico del robot quirúrgico utilizando barras para los oídos suministradas y evalúe rutinariamente los signos vitales y la profundidad anestésica a través del pellizco del dedo del pie. Luego frote el área quirúrgica con gluconato de clorhexidina y isopropanol al 70% para la esterilización.Y coloque una envoltura de plástico estéril sobre el ratón y el marco estereotáctico para mantener la esterilidad durante la cirugía. Usando una hoja de bisturí, realice una incisión de una pulgada en la línea media del cráneo, comenzando en la parte posterior de los ojos, seque y limpie el cráneo con peróxido de hidrógeno al 3% con aplicadores con punta de algodón. Para preparar la cola para una inyección fácil, limpie con alcohol.Usando el pulgar y el índice, doble la cola para exponer la vena de la cola en la parte superior de la curva de la cola. Inserte la jeringa paralela a la vena e inyecte lentamente el volumen de azul Evans. Una vez inyectado, espere cinco minutos para permitir que circule Evans blue.Una inyección exitosa se verifica inmediatamente cuando las extremidades del ratón y la ventana quirúrgica se vuelven azules. Una vez que el cráneo esté preparado para la perforación, navegue de nuevo al software quirúrgico y haga clic en herramientas. Luego seleccione proyecto, seguido de nuevo, y seleccione un proyecto de plantilla en el menú desplegable para elegir un proyecto de plantilla.Seleccione los mismos elementos de protocolo. Haga clic en planificación, luego seleccione los parámetros de perforación para transferir a este nuevo proyecto y haga clic en iniciar nuevo proyecto. A continuación, corrija el taladro y el marco para tener en cuenta la inclinación y la escala del cráneo del ratón del animal actual haciendo clic en herramientas, y seleccione corregir para inclinación y escala para abrir la pantalla de correcciones.En la parte superior de la pantalla, asegúrese de que el taladro esté activo haciendo clic en el botón de taladro rojo claro Después de realizar la corrección, salga de la ventana de corrección haciendo clic en cerrar en la parte inferior central de la pantalla y navegue hasta la pantalla de perforación haciendo clic en herramientas y luego seleccionando taladro para comenzar el procedimiento de perforación. Confirme el sitio de perforación seleccionando la ventana de forma de craneotomía en la parte superior de la pantalla, seguido de ver los detalles del objetivo de perforación en el menú desplegable a continuación. Para llevar a cabo la perforación por pulsos manual, desactive la función de parada automática desmarcando la casilla de verificación junto a la opción de parada automática en el menú de perforación, que permite controlar cuándo el taladro está apagado para el pulso.En el menú de perforación, seleccione 100 micrómetros como avance de la profundidad de perforación. Abra el menú del sitio de perforación y navegue hasta el primer sitio de perforación. Utilice el botón de avance o los controles manuales para bajar el taladro hasta que toque el cráneo y presione la superficie de ajuste una vez que la broca llegue al cráneo.Una vez listo, haga clic en avanzar para comenzar la perforación. Y después de que el taladro haya avanzado 100 micrómetros, presione Escape dos veces para detener el taladro. Después de dos segundos, repita este ciclo para la profundidad del cráneo.Para cada semilla y punto de borde durante la perforación, asegúrese de ajustar la duramadre usando el botón en el menú de perforación una vez que se haya alcanzado la duramadre. Mida los cambios en la temperatura del cráneo y el cerebro utilizando un termopar en combinación con los tres esquemas de perforación diferentes conectados a un sistema de adquisición de datos, que permite que la medición se lea en MATLAB. Monte un ratón cadáver en el marco estereotáxico y la configuración del taladro robótico.Perfore manualmente un pequeño orificio aproximadamente a dos milímetros de distancia de donde se hará la ventana craneal en el costado del cráneo, lo que permite que el termopar se deslice en su posición debajo de donde se produce la perforación de la ventana craneal. Comience el proceso de perforación para cada uno de los tres esquemas como se demostró anteriormente, lo que resulta en picos debido al cambio de temperatura, lo que indica que el calentamiento ocurre cerca del cerebro a medida que el taladro atraviesa el cráneo. El potencial de daño térmico se evaluó midiendo el cambio de temperatura desde la línea de base debido a la perforación utilizando métodos horizontales, punto por punto y pulsados punto por punto.Tanto los esquemas de perforación horizontal como punto por punto muestran diferencias no significativas en los cambios térmicos. Sin embargo, cambiar a un método pulsado punto por punto resultó en un calentamiento significativamente menor del cerebro que la perforación horizontal y punto por punto. La perforación de borde horizontal tomó 300 segundos, mientras que la perforación de borde punto por punto tomó 200 segundos.El método de pulso tomó el más largo con la perforación de semillas y bordes, tomando aproximadamente 500 segundos cada uno. Para monitorear la relación entre el esquema de perforación y el daño vascular, se realizaron imágenes fluorescentes azules de Evans. Se observó que la perforación a través de corte horizontal y punto por punto era perjudicial para la vasculatura en el cerebro.En comparación con los grupos de control, el método pulsado punto por punto tuvo menos daño localizado en la semilla y el punto de borde, pero aún tenía presencia visible de azul Evans dentro de la ventana craneal. Al perforar manualmente, es crucial verificar la craneotomía después de avanzar el taladro para asegurarse de que no se rompa la duramadre. Además de las ventanas craneales, se puede usar un robot quirúrgico para craneotomías estándar para mejorar los resultados quirúrgicos.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Intravital Microscopy of the Mouse Brain Microcirculation using a Closed Cranial Window

Microscopia intravital de la microcirculación del cerebro del ratón con una ventana craneal cerrado

This experimental model was designed to assess the mouse pial microcirculation during acute and chronic, physiological and pathophysiological hemodynamic, ...

Investigación

Neurociencias

Assessment of Morphine-induced Hyperalgesia and Analgesic Tolerance in Mice Using Thermal and Mechanical Nociceptive Modalities

Evaluación de la hiperalgesia inducida por la morfina y analgésicos Tolerancia en ratones utilizando térmicas y mecánicas Modalidades nociceptivos

Opioid-induced hyperalgesia and tolerance severely impact the clinical efficacy of opiates as pain relievers in animals and humans. The molecular ...

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Lateral Chronic Cranial Window Preparation Enables In Vivo Observation Following Distal Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Ventana lateral crónica craneal Preparación Activa<em&gt; En Vivo</em&gt; Observación Siguiendo distal de la arteria cerebral media oclusión en ratones

Focal cerebral ischemia (i.e., ischemic stroke) may cause major brain injury, leading to a severe loss of neuronal function and consequently to a host of ...

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Evaluación de la complejidad dendrítica del hipocampo en ratones envejecidos utilizando el método de Golgi-Cox

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal (PHASOR): A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezo High Accuracy Surgical Osteal Removal PHASOR: A Technique for Improved Cranial Window Surgery in Mice

Piezoeléctrico de alta precisión ósea la extirpación quirúrgica (fasor): Una técnica mejorada ventana craneal cirugía en ratones

Multiphoton microscopy has been widely adapted for imaging neurons in vivo. Repeated imaging requires implantation of a cranial window or repeated ...

Craniotomy Procedure for Visualizing Neuronal Activities in Hippocampus of Behaving Mice

Procedimiento De Craneotomía Para La Visualización De Las Actividades Neuronales En El Hipocampo De Comportarse Ratones

Imaging neuronal activities at single-cell resolution in awake behaving animals is a very powerful approach for the investigation of neural circuit ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Implantación de una ventana craneal para imágenes repetidas in vivo en ratones despiertos

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Assessment of Sensory Thresholds in Dogs Using Mechanical and Hot Thermal Quantitative Sensory Testing

Evaluación de umbrales sensoriales en perros mediante pruebas sensoriales cuantitativas mecánicas y térmicas calientes

Quantitative sensory testing (QST) is used to evaluate the function of the somatosensory system in dogs by assessing the response to applied mechanical ...

Dosage-Adjusted Resistance Training in Mice with a Reduced Risk of Muscle Damage

Entrenamiento de resistencia ajustado a la dosis en ratones con un riesgo reducido de daño muscular

Progressive resistance training (PRT), which involves performing muscle contractions against progressively greater external loads, can increase muscle ...

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

In Vivo Wide-Field and Two-Photon Calcium Imaging from a Mouse Using a Large Cranial Window

In vivo Imágenes de calcio de campo amplio y dos fotones de un ratón usando una ventana craneal grande

Wide-field calcium imaging from the mouse&#39;s neocortex allows one to observe cortex-wide neural activity related to various brain functions. On the ...