Name: rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos
Uploaded: 2022-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos at JoVE.com

تم تقديم الدعم البحثي من خلال زمالة قسم الدراسات العليا في UCR إلى SAB ، وزمالة برنامج تدريب NRSA T32 (T32ES018827) إلى SAB ، ومنحة المعاهد الوطنية للصحة (R01ES027576) ومشروع هاتش المعهد الوطني للأغذية والزراعة التابع لوزارة الزراعة الأمريكية (1009609) إلى DCV.

تم التعامل مع المربين البالغين ومعالجتهم وفقا لبروتوكول استخدام الحيوانات المعتمد من لجنة رعاية واستخدام الحيوانات المؤسسية (IACUC) (# 20180063) في جامعة كاليفورنيا ، ريفرسايد.
1. جمع أجنة الزرد والتعرض الكيميائي
<ol><li>أضف مصائد تربية داخل الخزان إلى الخزانات التي تحتوي ع...

<ol>
	<li>Zhang, H. -. Y., Xiong, J., Qi, B. -. L., Feng, Y. -. Q., Yuan, B. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+existence+of+5-hydroxymethylcytosine+and+5-formylcytosine+in+both+DNA+and+RNA+in+mammals.">The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals.</a> Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+determination+of+the+oxidation+products+of+5-methylcytosine+in+RNA.">Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA.</a> Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).</li><li>Avila-Barnard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tris(1,3-dichloro-2-propyl)+phosphate+disrupts+the+trajectory+of+cytosine+methylation+within+developing+zebrafish+embryos.">Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos.</a> Environmental Research. 211, 113078 (2022).</li><li>Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+zebrafish+embryos+to+reveal+disruptions+in+dorsoventral+patterning.">Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning.</a> Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).</li><li>Vliet, S. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal-to-zygotic+transition+as+a+potential+target+for+niclosamide+during+early+embryogenesis.">Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).</li><li>Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+alterations+in+DNA+methylation+precede+Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced+delays+in+zebrafish+epiboly.">Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly.</a> Environmental Science &amp; Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).</li><li>Dasgupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interplay+among+nuclear+receptor+ligands,+cytosine+methylation,+and+the+metabolome+in+driving+tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced+epiboly+defects+in+zebrafish.">Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish.</a> Environmental Science &amp; Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).</li><li>McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+zebrafish+embryogenesis+is+susceptible+to+developmental+TDCPP+exposure.">Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure.</a> Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).</li><li>Geiman, T. M., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+early+development.">DNA methylation in early development.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).</li><li>Wossidlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming.">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).</li><li>Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation-mediated+epigenetic+control.">DNA methylation-mediated epigenetic control.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).</li><li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy.">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).</li><li>Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cytosine+methylation+at+a+glance.">Mammalian cytosine methylation at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).</li><li>Baylin, S. B., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+exploring+the+cancer+epigenome-biological+and+translational+implications.">A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).</li><li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+chromatin-unraveling+the+tangled+web.">DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web.</a> Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).</li><li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+human+disease.">DNA methylation and human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).</li><li>Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+DNA+methylation+in+mammalian+development+and+disease.">The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).</li><li>Yuan, B. -. F., Feng, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+analysis+of+5-methylcytosine+and+its+oxidation+products.">Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products.</a> Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).</li><li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos.">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li></ol>

خلال هذا البروتوكول ، هناك بعض الخطوات الحاسمة. أولا ، عند إزالة الأجنة ، من المهم توجيه الإبرة بعيدا عن أنسجة كيس الجنين / كيس الصفار / كتلة الخلية ، لأن هذه الأجزاء من الجنين النامي هشة للغاية ويسهل ثقبها. ثانيا ، عند نقل الأجنة المصنفة إلى آبار فردية ، استخدم ماصة زجاجية لنقل الأجنة لأنها ...

تؤدي التعديلات الأنزيمية إلى المثيلة النشطة وإزالة ميثيل السيتوزين إلى 5-ميثيل سيتوزين (5-mC) والأكسدة اللاحقة ل 5-mC إلى 5-hydroxymethylcytosine و 5-formylcytosine و 5-carboxylcytosine 1,2. Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate (TDCIPP) هو مثبط للهب يستخدم على نطاق واسع في الولايات المتحدة وقد ثبت سابقا أنه يغير مسار مثيلة السيتوزين بعد التعرض الجنيني المبكر من 0.75 ساعة بعد الإخصاب (HPF) من خلال المعدة المبكرة (6 HPF) 3،4،5،6،7،8 . داخل الفقاريات ، تعتبر 5-mC ومشتقاتها المعدلة ضرورية لتنظيم التطور الجنيني المبكر9. يؤدي إخصاب الجنين إلى إزالة ميثيل الحمض النووي الأبوي ، يليه تدهور mRNA الأمومي ، وتنشيط الجينوم الزيجوتي ، وإعادة مثيلة الجينومالزيجوتي 9. تشمل العمليات ذات الصلة بيولوجيا التي تستخدم مثيلة السيتوزين تعديل الهستون ، وتوظيف آلات النسخ ، ومثيلة الحمض النووي الريبي ، وإعادة البرمجة اللاجينية ، وتحديد بنية الكروماتين10,11. يتم الحفاظ على مثيلة السيتوزين أيضا بين أنواع الفقاريات ، مما يؤكد أهمية فهم والتحقيق في كيفية تأثير مثيلة السيتوزين الشاذة على مسار تطور الكائن الحي11. علاوة على ذلك ، فإن التطور في الرحم حساس لتعرض الأمهات ولديه القدرة على التسبب في نتائج سلبية مثل العواقب المظهرية الفورية ، والآثار طويلة المدى على قابلية البالغين للأمراض ، والآثار عبر الأجيال للعلامات اللاجينية الموروثة12،13،14.
كانت الامتدادات الطويلة لأزواج السيتوزين والجوانين ، أو جزر CpG ، هي البؤر الأساسية للباحثين الذين يهدفون إلى توصيف ديناميكيات مثيلة السيتوزين عبر الجينوم15،16،17. تمثل الاستراتيجيات القائمة على ثنائي الكبريتيت مثل تسلسل ثنائي كبريتيت الجينوم الكامل ، وتسلسل ثنائي الكبريتيت منخفض التمثيل ، وتسلسل أمبليكون ثنائي الكبريتيت المعيار الذهبي لاستجواب مثيلة السيتوزين بدقة زوج القاعدة. ومع ذلك ، فإن النهج القائمة على التسلسل باهظة التكلفة ، وبالتالي ، تمنع القدرة على مراقبة مثيلة السيتوزين عبر مراحل النمو ، والتركيزات المتعددة لكل مادة كيميائية ، وتكرار الأجنة لكل علاج. بالإضافة إلى ذلك ، لا توفر الأساليب القائمة على التسلسل معلومات حول التوطين المكاني ، وهو أمر بالغ الأهمية لفهم أنواع الخلايا والمناطق التي يحتمل أن تتأثر داخل الجنين النامي. وبالمثل ، فإن مقايسات مثيلة الحمض النووي العالمية مثل تحليل التقييد المعتمد على المثيلة ، والمقايسات المناعية المرتبطة بالإنزيم 5-mC (ELISAs) ، و 5-methyl-2'-deoxycytidine (5-mC) قياس الطيف الكتلي اللوني السائل (LC-MS) تعتمد على تجانس الخلايا أو الأنسجة ، وعلى هذا النحو ، تمنع القدرة على مراقبة توطين وحجم مثيلة السيتوزين عبر المكان والزمان داخل العينات السليمة12,18.
نظرا لسهولة التصوير الآلي في الجسم الحي ، والتلاعب الجيني ، ووقت التطور السريع خارج الرحم ، والتربية أثناء التطور الجنيني ، لا تزال أجنة الزرد تستخدم على نطاق واسع كنماذج سليمة من الناحية الفسيولوجية للكشف عن المسارات بوساطة الأجانب التي تساهم في النتائج السلبية أثناء التطور الجنيني المبكر. لذلك ، باستخدام الأجسام المضادة المتاحة تجاريا الخاصة ب 5-mC ، يصف البروتوكول أدناه استراتيجية فعالة من حيث التكلفة للمراقبة الزمانية المكانية السريعة والفعالة لمثيلة السيتوزين داخل أجنة الزرد الفردية السليمة من خلال الاستفادة من الكيمياء الهيستولوجية المناعية الكاملة (IHC) ، والتصوير الآلي عالي المحتوى ، ومعالجة البيانات بكفاءة باستخدام لغة البرمجة قبل التحليل الإحصائي.
للمعرفة الحالية ، هذه الطريقة هي الأولى لمراقبة 5 mC داخل أجنة الزرد سليمة. تتيح هذه الطريقة الكشف عن مثيلة الحمض النووي داخل كتلة الخلية ولديها أيضا القدرة على اكتشاف مثيلة السيتوزين ل mRNAs الأم الموضعية بالصفار أثناء الانتقال من الأم إلى الزيجوت. بشكل عام ، ستكون هذه الطريقة مفيدة في التعرف السريع على المواد الكيميائية التي لديها القدرة على تعطيل مثيلة السيتوزين في الموقع أثناء إعادة البرمجة اللاجينية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>540225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-&#181;L glass microcapillary pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>211762B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08757100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL pipette&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13690032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250-mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB501250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-mL pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13690033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm glass petri dishes with lids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08747A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP67110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1110016SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-tank breeding traps</td>
			<td>Aquatic Habitats</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.&#160; Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunochemistry (IHC) basket</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaXpress 6.0.3.1658&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2140115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-5-mC antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MABE146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50998290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1337412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18612139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1368050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>RStudio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3772-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-controlled incubator&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PR505755L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos

يتم الحفاظ على مثيلة السيتوزين بشكل كبير عبر أنواع الفقاريات ، وكمحرك رئيسي للبرمجة اللاجينية وحالة الكروماتين ، تلعب دورا مهما في التطور الجنيني المبكر. تؤدي التعديلات الأنزيمية إلى المثيلة النشطة وإزالة ميثيل السيتوزين إلى 5-ميثيل سيتوزين (5-mC) والأكسدة اللاحقة ل 5-mC إلى 5-hydroxymethylcytosine و 5-formylcytosine و 5-carboxylcytosine. إعادة البرمجة اللاجينية هي فترة حرجة أثناء تطور الرحم ، وتعرض الأمهات للمواد الكيميائية لديه القدرة على إعادة برمجة epigenome داخل النسل. يمكن أن يتسبب هذا في نتائج سلبية مثل عواقب النمط الظاهري الفوري ، والآثار طويلة المدى على قابلية الإصابة بأمراض البالغين ، والآثار عبر الأجيال للعلامات اللاجينية الموروثة. على الرغم من أن التسلسل القائم على ثنائي الكبريتيت يمكن الباحثين من استجواب مثيلة السيتوزين بدقة زوج القاعدة ، فإن النهج القائمة على التسلسل باهظة التكلفة ، وعلى هذا النحو ، تمنع القدرة على مراقبة مثيلة السيتوزين عبر مراحل النمو ، وتركيزات متعددة لكل مادة كيميائية ، وتكرار الأجنة لكل علاج. نظرا لسهولة التصوير الآلي في الجسم الحي ، والتلاعب الجيني ، ووقت التطور السريع خارج الرحم ، والتربية أثناء التطور الجنيني ، يستمر استخدام أجنة الزرد كنموذج سليم من الناحية الفسيولوجية للكشف عن المسارات بوساطة الأجانب التي تساهم في النتائج السلبية أثناء التطور الجنيني المبكر. لذلك ، باستخدام الأجسام المضادة الخاصة ب 5 mC المتاحة تجاريا ، نصف استراتيجية فعالة من حيث التكلفة للمراقبة الزمانية المكانية السريعة والفعالة لمثيلة السيتوزين داخل أجنة الزرد الفردية السليمة من خلال الاستفادة من الكيمياء الهيستولوجية المناعية الكاملة ، والتصوير الآلي عالي المحتوى ، ومعالجة البيانات الفعالة باستخدام لغة البرمجة قبل التحليل الإحصائي. وفقا للمعرفة الحالية ، هذه الطريقة هي الأولى التي نجحت في اكتشاف وتحديد مستويات 5 mC في الموقع داخل أجنة الزرد أثناء التطور المبكر. تتيح هذه الطريقة الكشف عن مثيلة الحمض النووي داخل كتلة الخلية ولديها أيضا القدرة على اكتشاف مثيلة السيتوزين ل mRNAs الأم الموضعية بالصفار أثناء الانتقال من الأم إلى الزيجوت. بشكل عام ، ستكون هذه الطريقة مفيدة في التعرف السريع على المواد الكيميائية التي لديها القدرة على تعطيل مثيلة السيتوزين في الموقع أثناء إعادة البرمجة اللاجينية.

الهدف العام من هذا البروتوكول هو تحديد ما إذا كان العلاج يؤثر على الوفرة النسبية ل 5 مللي مئوية من خلال تقييم المساحة الإجمالية والكثافة النسبية للتألق داخل أجنة الزرد الثابتة والموسمة. بعد الانتهاء من البروتوكول ، يمكن استخدام المجهر المجسم الفلوري لتحديد ما إذا كان IHC بالكامل ناجحا أم ل?...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos at JoVE.com

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

تصف هذه الورقة بروتوكولا للمراقبة الزمانية المكانية السريعة والفعالة لمثيلة السيتوزين الطبيعية والشاذة داخل أجنة الزرد السليمة.

المراقبة الزمانية المكانية السريعة والفعالة لمثيلة السيتوزين الطبيعية والشاذة داخل أجنة الزرد السليمة

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

يقدم هذا البروتوكول طريقة سريعة نسبيا وفعالة من حيث التكلفة ، بالإضافة إلى اكتساب وتحليل آلي وبالتالي ينتج عنه فحص منخفض الحساسية ل 5-Methylcytosine وهو علامة حيوية جينية شائعة. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي المرونة التي توفرها تصميما تجريبيا يمكن للمستخدمين تحسينه لنموذجهم ومرحلة التطوير. يمكن استخدام هذه التقنية للكشف عن كيفية تغيير التعرض الكيميائي للوفرة النسبية ل 5-Methylcytosine داخل كائن حي نام والذي لا يمكن القيام به عادة إلا من خلال طرق trpA عالية التكلفة مثل التسلسل.هذه الطريقة مفيدة لأي بحث يهدف إلى استخدام طرق NCG لفهم التغيرات اللاجينية ل 5-Methylcytosine استجابة للمحفزات البيئية. ابدأ بإعداد محلول تعرض جديد في صباح يوم التجميع. أضف خمسة ملليلتر من ماء النظام الخالي من الجسيمات إلى طبق بتري زجاجي 60 ملم.ثم استخدم ماصة زجاجية شعرية صغيرة سعة 10 ميكرولتر لنقل 10 ميكرولتر من محلول ثنائي ميثيل سلفوكسيد أو محلول مخزون كيميائي إلى مياه النظام. حرك طبق بتري الزجاجي لضمان تبدد محلول المخزون. أضف خمسة ملليلتر أخرى من ماء النظام إلى طبق بتري الزجاجي وقم بتدوير الطبق لتجانس محلول التعرض.قم بتغطية الأطباق الزجاجية بأغطية زجاجية لتقليل التبخر. بعد ذلك ، استخدم زجاجة بخ مملوءة بالماء RO لنقل الأجنة من شبكة السمك إلى طبق 100 ملم. فرز 50 جنينا حيا بشكل عشوائي بعد 0.75 ساعة من الإخصاب وإزالة الماء الزائد من التناضح العكسي.بعد انتهاء مدة التعرض ، قم بإزالة الأجنة من الحاضنة. نقل جميع الأجنة الحية إلى أنبوب طرد مركزي صغير سعة 1.5 ملليلتر. نضح محلول التعرض المتبقي دون استنشاق أي أجنة.أضف 500 ميكرولتر من بارافورمالدهيد المبرد بنسبة 4٪ واخلط الأجنة عن طريق الانقلاب عدة مرات. اسمح للأجنة بالإصلاح و 4٪ بارافورمالدهيد طوال الليل عند أربع درجات مئوية. بعد تثبيت الأجنة ، قم بشفط 4٪ بارافورمالدهيد ، وأعد إنفاق الأجنة في 1X PBS ، واخلطها عن طريق ماصة لطيفة لمدة 30 ثانية.باستخدام ماصة زجاجية ، انقل الأجنة الثابتة بعناية إلى طبق زجاجي مملوء بالماء RO. حرك بلطف لمدة 30 ثانية وكرر هذا الغسيل مرة واحدة. تحت المجهر ستيريو تعيين في خمس مرات التكبير تزيين الأجنة باستخدام الإبر حقنة.باستخدام طرف الإبرة ، قم بثقب المشيم وقشره برفق بعيدا عن صفار البيض وكتلة الخلية. بعد تزيين الأجنة ، استخدم ماصة شعرية زجاجية دقيقة لنقل ما يصل إلى 25 جنينا سليما إلى سلة واحدة للكيمياء المناعية. ضع سلة IHC في طبق 24 بئر.ثم استنشاق الماء من كل بئر. أعد تعليق الأجنة في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لكل بئر ، لف اللوحة بورق الألمنيوم ورقائق الألومنيوم لحمايتها من الضوء. احتضان اللوحة عند أربع درجات مئوية لمدة أربع ساعات على شاكر مداري عند 100 دورة في الدقيقة.بعد الحضانة ، استنشاق المخزن المؤقت للحجب من كل بئر. استبدله ب 500 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأساسي. تذكر أن تحتضن مجموعة فرعية من أجنة التحكم في السيارة باستخدام المخزن المؤقت للحجب لحساب ضوضاء الخلفية.أعد لف اللوحة و paraform ورقائق الألومنيوم واترك اللوحة تحضن عند أربع درجات مئوية طوال الليل على شاكر مداري. في اليوم التالي ، قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي من كل بئر واستبدله ب 1x PBST. اغسل كل بئر ثلاث مرات باستخدام 1x PBST لمدة خمس دقائق لكل غسلة على شاكر مدالي.قم بشفط 1x PBST من كل بئر وضع سلة IHC في طبق بتري زجاجي مملوء بماء RO. تحت مجهر ستيريو قياسي ، قم بفرز الأجنة السليمة بشكل عشوائي في لوحة بئر 96 لضمان جنين واحد لكل بئر. ثم قم بإزالة جميع مياه RO من الآبار الفردية وأضف 200 ميكرولتر من 1x PBS.الطرد المركزي لوحة لمدة ثلاث دقائق في واحد G.Image الأجنة مع هدف مرتين تحت الضوء المرسل و FITC. حدد التركيز البؤري التلقائي للتأكد من أن تركيز الكاميرا على الجزء السفلي من اللوحة ويقابله سمك القاع. حدد طولا موجيا ل FITC مع مدة تعريض تبلغ 100 مللي ثانية واضبط التركيز التلقائي على الليزر باستخدام إزاحة Z.مراقبة وتأكيد الحصول على الصورة المناسبة والعديد من الآبار قبل البدء في الحصول على اللوحة. بعد الحصول على الصور ، قم بإجراء تحليل البيانات باستخدام نظام فحص المحتوى العالي وإجراء تحليل الصور الآلي المخصص. حدد كل جنين على لوحة البئر 96 ليتم تحليلها للمساحة الكلية والكثافة المتكاملة للتألق.ثم قم بجدولة نقاط البيانات وتصديرها من نظام فحص المحتوى العالي بالانتقال إلى القياس وتحديد سجل البيانات المفتوح لتصدير البيانات إلى جدول بيانات. قم بتحميل جدول البيانات الذي تم تصديره إلى حزمة الموزع لفرز البيانات وتلخيصها لكل بئر والتصفية حسب رقم البئر. ثم استخدم حزمة Excel الصحيحة لتصدير البيانات المجمعة إلى جدول بيانات.تم تقييم التوزيع والشدة المتكاملة للمنطقة الكلية المحددة ل 5-Methylcytosine لأجنة الزرد بعد ست ساعات من الإخصاب. يظهر المحور السيني التعرض إما ل DMSO كمركبة أو TDCIPP كعنصر تحكم إيجابي. يشير المحور Y إلى التألق النسبي.كانت العتبات مختلفة بشكل كبير عن الأجنة المعالجة بالمركبة كما هو موضح في المساحة الإجمالية ل 5-Methylcytosine المكتشفة داخل الأجنة والشدة المتكاملة داخل نفس المنطقة التي تشير إلى أقصى نسبة إشارة إلى الضوضاء. من المهم للغاية الحفاظ على سلامة النير وكتلة الخلية للكشف السليم عن IHC. هذه الطريقة غير حساسة نسبيا ولا تقدم سوى وفرة نسبية لبيانات RFU.إذا كان القياس الكمي مطلوبا ، فيمكن للمرء المتابعة بنهج أكثر استهدافا.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

عزل وتوصيف الخلايا واحدة من اسماك الزرد الأجنة

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

جيل من التعايش الالتصاقي الزرد الأجنة التي كتبها فيوجن الجراحي لتطوير الأريمات

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

تقارب كشف وسمها الذاتية المستقبلات من الزرد الأجنة

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

بيوسنسينغ موتور الخلايا العصبية الغشاء المحتملة في الأجنة الزرد الحية

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

تحريض نقص الأكسجة في الضفدع الحي والأجنة الزرد

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

فوتوكونفيرسيون خلية واحدة في معيشة سليمة الزرد

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

التصور للنشاط الكهربائي الخلوية في الزرد الأجنة في وقت مبكر، والأورام

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

التعبير السريع والفعال عن البروتينات المتعددة في أجنة الطيور باستخدام الكهربة mRNA

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

كامل جبل المناعة الكيمياء في الأجنة حمار وحشي واليرقات

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

القياس الكمي لمستويات الإيثانول في أجنة حمار وحشي باستخدام كروماتوغرافيا غاز الرأس الفضائية

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...