Name: rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos
Uploaded: 2022-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos at JoVE.com

Forskningsstøtte blev ydet af et UCR Graduate Division Fellowship til SAB, et NRSA T32 Training Program Fellowship (T32ES018827) til SAB og et National Institutes of Health-tilskud (R01ES027576) og USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) til DCV.

Voksne opdrættere blev håndteret og behandlet i overensstemmelse med en Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) -godkendt dyrebrugsprotokol (#20180063) ved University of California, Riverside.
1. Indsamling af zebrafiskembryoner og kemisk eksponering
<ol><li>Tilsæt opdrætsfælder i tanken til tanke, der indeholder seksuelt modne og reproduktivt levedygtige voksne mandlige og kvindelige zebrafisk. Tilføj mindst tre fælder pr. 6 L tank mindst 12 timer før in...

<ol>
	<li>Zhang, H. -. Y., Xiong, J., Qi, B. -. L., Feng, Y. -. Q., Yuan, B. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+existence+of+5-hydroxymethylcytosine+and+5-formylcytosine+in+both+DNA+and+RNA+in+mammals.">The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals.</a> Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+determination+of+the+oxidation+products+of+5-methylcytosine+in+RNA.">Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA.</a> Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).</li><li>Avila-Barnard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tris(1,3-dichloro-2-propyl)+phosphate+disrupts+the+trajectory+of+cytosine+methylation+within+developing+zebrafish+embryos.">Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos.</a> Environmental Research. 211, 113078 (2022).</li><li>Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+zebrafish+embryos+to+reveal+disruptions+in+dorsoventral+patterning.">Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning.</a> Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).</li><li>Vliet, S. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal-to-zygotic+transition+as+a+potential+target+for+niclosamide+during+early+embryogenesis.">Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).</li><li>Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+alterations+in+DNA+methylation+precede+Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced+delays+in+zebrafish+epiboly.">Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly.</a> Environmental Science &amp; Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).</li><li>Dasgupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interplay+among+nuclear+receptor+ligands,+cytosine+methylation,+and+the+metabolome+in+driving+tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced+epiboly+defects+in+zebrafish.">Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish.</a> Environmental Science &amp; Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).</li><li>McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+zebrafish+embryogenesis+is+susceptible+to+developmental+TDCPP+exposure.">Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure.</a> Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).</li><li>Geiman, T. M., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+early+development.">DNA methylation in early development.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).</li><li>Wossidlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming.">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).</li><li>Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation-mediated+epigenetic+control.">DNA methylation-mediated epigenetic control.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).</li><li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy.">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).</li><li>Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cytosine+methylation+at+a+glance.">Mammalian cytosine methylation at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).</li><li>Baylin, S. B., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+exploring+the+cancer+epigenome-biological+and+translational+implications.">A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).</li><li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+chromatin-unraveling+the+tangled+web.">DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web.</a> Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).</li><li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+human+disease.">DNA methylation and human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).</li><li>Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+DNA+methylation+in+mammalian+development+and+disease.">The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).</li><li>Yuan, B. -. F., Feng, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+analysis+of+5-methylcytosine+and+its+oxidation+products.">Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products.</a> Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).</li><li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos.">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li></ol>

Under denne protokol er der et par trin, der er kritiske. For det første er det vigtigt at pege nålen væk fra embryonets/cellemassens væv, når embryonen afkobles/cellemassen afkobles, da disse dele af det udviklende embryo er meget skrøbelige og lette at punktere. For det andet, når du overfører mærkede embryoner til individuelle brønde, skal du bruge en glaspipette til at overføre embryoner, da de klæber til en plastpipette. For det tredje, når du udfører helmonteret IHC, skal du sikre dig, at pladen er be...

Enzymatiske modifikationer driver aktiv methylering og demethylering af cytosin til 5-methylcytosin (5-mC) og efterfølgende oxidation af 5-mC til 5-hydroxymethylcytosin, 5-formylcytosin og 5-carboxylcytosin 1,2. Tris(1,3-dichlor-2-propyl)phosphat (TDCIPP) er et meget anvendt flammehæmmende middel i USA, der tidligere har vist sig at ændre cytosinmethyleringens bane efter tidlig embryonal eksponering fra 0,75 timer efter befrugtning (hpf) gennem tidlig gastrulation (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . Inden for hvirveldyr er 5 mC og dets modificerede derivater afgørende for regulering af tidlig embryonal udvikling9. Befrugtning af et embryo udløser demethylering af forældrenes DNA efterfulgt af moderens mRNA-nedbrydning, zygotisk genomaktivering og remethylering af det zygotiske genom9. Biologisk relevante processer, der anvender cytosinmethylering, omfatter histonmodifikation, rekruttering af transkriptionsmaskiner, RNA-methylering, epigenetisk omprogrammering og bestemmelse af kromatinstruktur10,11. Cytosinmethylering bevares også blandt hvirveldyrarter, hvilket understreger vigtigheden af at forstå og undersøge, hvordan afvigende cytosinmethylering kan påvirke banen for en organismes udvikling11. Desuden er udviklingen i utero følsom over for moderens eksponering og har potentiale til at forårsage negative resultater såsom umiddelbare fænotypiske konsekvenser, langsigtede virkninger på voksensygdomsmodtagelighed og transgenerationelle virkninger af arvelige epigenetiske mærker12,13,14.
Lange strækninger af cytosin-guaninpar eller CpG-øer har været de primære fokus for efterforskere, der sigter mod at karakterisere dynamikken i cytosinmethylering på tværs af genomet15,16,17. Bisulfitbaserede strategier såsom helgenombisulfitsekventering, reduceret repræsentation af bisulfitsekventering og bisulfitamplicon-sekventering repræsenterer guldstandarden til forhør af cytosinmethylering ved baseparopløsning. Sekventering baseret på metoder er imidlertid omkostningsoverkommelige og udelukker som sådan muligheden for at overvåge cytosinmethylering på tværs af udviklingsstadier, flere koncentrationer pr. kemikalie og replikere embryoner pr. behandling. Derudover giver sekventeringsbaserede tilgange ikke information om rumlig lokalisering, hvilket er afgørende for at forstå potentielt berørte celletyper og områder inden for et embryo, der udvikler sig. Tilsvarende er globale DNA-methyleringsassays såsom methyleringsafhængig restriktionsanalyse, 5-mC enzymbundne immunoassays (ELISA'er) og 5-methyl-2'-deoxycytidin (5-mC) væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) afhængige af celle- eller vævshomogenater og udelukker som sådan evnen til at overvåge lokaliseringen og størrelsen af cytosinmethylering over rum og tid inden for intakte prøver12,18.
På grund af den lette automatiserede in vivo-billeddannelse , genetiske manipulationer, hurtig ex utero-udviklingstid og opdræt under embryogenese anvendes zebrafiskembryoner fortsat i vid udstrækning som fysiologisk intakte modeller til at afdække xenobiotisk-medierede veje, der bidrager til negative resultater under tidlig embryonal udvikling. Derfor beskriver nedenstående protokol ved hjælp af kommercielt tilgængelige antistoffer, der er specifikke for 5 mC, en omkostningseffektiv strategi for hurtig og effektiv spatiotemporal overvågning af cytosinmethylering inden for individuelle, intakte zebrafiskembryoner ved at udnytte helmonteret immunhistokemi (IHC), automatiseret billeddannelse med højt indhold og effektiv databehandling ved hjælp af programmeringssprog forud for statistisk analyse.
Efter den nuværende viden er denne metode den første til at overvåge 5 mC inden for intakte zebrafiskembryoner. Metoden muliggør påvisning af DNA-methylering i cellemassen og har også evnen til at detektere cytosinmethylering af æggeblomme-lokaliserede maternel mRNA'er under den moderlige-til-zygotiske overgang. Samlet set vil denne metode være nyttig til hurtig identifikation af kemikalier, der har potentiale til at forstyrre cytosinmethylering in situ under epigenetisk omprogrammering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>540225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-&#181;L glass microcapillary pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>211762B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08757100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL pipette&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13690032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250-mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB501250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-mL pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13690033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm glass petri dishes with lids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08747A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP67110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1110016SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-tank breeding traps</td>
			<td>Aquatic Habitats</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.&#160; Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunochemistry (IHC) basket</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaXpress 6.0.3.1658&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2140115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-5-mC antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MABE146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50998290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1337412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18612139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1368050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>RStudio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3772-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-controlled incubator&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PR505755L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos

Cytosinmethylering er stærkt bevaret på tværs af hvirveldyrarter og spiller som en vigtig drivkraft for epigenetisk programmering og kromatintilstand en kritisk rolle i tidlig embryonal udvikling. Enzymatiske modifikationer driver aktiv methylering og demethylering af cytosin til 5-methylcytosin (5-mC) og efterfølgende oxidation af 5-mC til 5-hydroxymethylcytosin, 5-formylcytosin og 5-carboxylcytosin. Epigenetisk omprogrammering er en kritisk periode under in utero-udvikling , og moderens eksponering for kemikalier har potentialet til at omprogrammere epigenomet inden for afkom. Dette kan potentielt forårsage negative resultater såsom umiddelbare fænotypiske konsekvenser, langsigtede virkninger på voksensygdomsfølsomhed og transgenerationelle virkninger af arvelige epigenetiske mærker. Selvom bisulfitbaseret sekventering gør det muligt for efterforskere at forhøre cytosinmethylering ved baseparopløsning, er sekventeringsbaserede tilgange omkostningsoverkommelige og udelukker som sådan evnen til at overvåge cytosinmethylering på tværs af udviklingsstadier, flere koncentrationer pr. kemikalie og replikere embryoner pr. Behandling. På grund af den lette automatiserede in vivo-billeddannelse , genetiske manipulationer, hurtig ex utero-udviklingstid og opdræt under embryogenese anvendes zebrafiskembryoner fortsat som en fysiologisk intakt model til afdækning af xenobiotisk-medierede veje, der bidrager til negative resultater under tidlig embryonal udvikling. Derfor beskriver vi ved hjælp af kommercielt tilgængelige 5-mC-specifikke antistoffer en omkostningseffektiv strategi for hurtig og effektiv spatiotemporal overvågning af cytosinmethylering inden for individuelle, intakte zebrafiskembryoner ved at udnytte helmonteret immunhistokemi, automatiseret billeddannelse med højt indhold og effektiv databehandling ved hjælp af programmeringssprog forud for statistisk analyse. Ifølge den nuværende viden er denne metode den første, der med succes detekterer og kvantificerer 5-mC-niveauer in situ i zebrafiskembryoner under tidlig udvikling. Metoden muliggør påvisning af DNA-methylering i cellemassen og har også evnen til at detektere cytosinmethylering af æggeblomme-lokaliserede maternel mRNA'er under den moderlige-til-zygotiske overgang. Samlet set vil denne metode være nyttig til hurtig identifikation af kemikalier, der har potentiale til at forstyrre cytosinmethylering in situ under epigenetisk omprogrammering.

Det overordnede formål med denne protokol er at afgøre, om en behandling påvirker den relative forekomst af 5 mC ved at vurdere det samlede areal og den relative intensitet af fluorescens i faste og mærkede zebrafiskembryoner. Efter afslutningen af protokollen kan et fluorescensstereomikroskop bruges til først at afgøre, om hele IHC var vellykket. Når mærkede embryoner observeres under et FITC- eller GFP-filter, indikeres et positivt resultat med et positivt FITC-signal i embryonet, mens et negativt resultat indi...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos at JoVE.com

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Dette papir beskriver en protokol for hurtig og effektiv spatiotemporal overvågning af normal og afvigende cytosinmethylering i intakte zebrafiskembryoner.

Hurtig og effektiv spatiotemporal overvågning af normal og afvigende cytosinmethylering i intakte zebrafiskembryoner

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

Denne protokol tilbyder en relativt hurtig og omkostningseffektiv metode samt en automatiseret erhvervelse og analyse, der således producerer lavfølsomhedsscreening af 5-methylcytosin, som er en almindelig epigenetisk biomarkør. Den største fordel ved denne teknik er i fleksibiliteten, den tilbyder et eksperimentelt design, som brugerne kan optimere til deres model og udviklingsstadium. Denne teknik kan bruges til at detektere, hvordan kemisk eksponering ændrer den relative overflod af 5-methylcytosin i en udviklende organisme, som normalt kun kunne gøres gennem dyre høje trpA-metoder såsom sekventering.Denne metode er nyttig til enhver forskning, der sigter mod at udnytte NCG-metoder til at forstå epigenetiske ændringer af 5-methylcytosin som reaktion på miljømæssige stimuli. Begynd med at forberede en frisk eksponeringsopløsning om morgenen for indsamling. Tilsæt fem milliliter partikelfrit systemvand til en 60 millimeter glas petriskål.Brug derefter en 10 mikroliter mikrokapillærglaspipette til at overføre 10 mikroliter dimethylsulfoxid eller kemisk stamopløsning til systemvand. Hvirvl glaspetriskålen for at sikre, at stamopløsningen forsvinder. Tilsæt yderligere fem milliliter systemvand til glasset Petri skål og hvirvl skålen for at homogenisere eksponeringsopløsningen.Dæk glasskålene med glaslåg for at minimere fordampningen. Brug derefter en RO-vandfyldt sprøjteflaske til at overføre embryonerne fra fiskenettet til en 100 millimeter skål. Sorter tilfældigt 50 levende embryoner 0,75 timer efter befrugtning, og fjern overskydende RO-vand.Når eksponeringsvarigheden er afsluttet, fjernes embryonerne fra inkubatoren. Overfør alle levende embryoner til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Aspirat resterende eksponeringsopløsning uden aspirering af embryoner.Tilsæt 500 mikroliter kølet 4% paraformaldehyd og bland embryonerne ved inversion flere gange. Lad embryonerne fiksere og 4% paraformaldehyd natten over ved fire grader celsius. Efter fastgørelse af embryonerne aspireres 4% paraformaldehyd, genbrug embryonerne i 1X PBS og blandes ved blid pipettering i 30 sekunder.Brug en glaspipette til forsigtigt at overføre faste embryoner til en RO-vandfyldt glasskål. Hvirvl forsigtigt i 30 sekunder, og gentag denne vask en gang. Under et stereomikroskop indstillet til fem gange forstørrelse dekoreneres embryonerne ved hjælp af sprøjtenåle.Brug nålespidsen til at punktere chorionen og forsigtigt skrælle den væk fra æggeblommen og cellemassen. Når embryonerne er blevet dekoreret, skal du bruge en glasmikrokapillærpipette til at overføre op til 25 intakte embryoner til en immunohistokemikurv. Anbring IHC-kurven i en 24 brøndplade.Derefter aspirer vandet fra hver brønd. Resuspender embryonerne i 500 mikroliter blokerende buffer pr. Brønd, pakk pladen med paraform og aluminiumsfolie for at beskytte den mod lys. Inkuber pladen ved fire grader Celsius i fire timer på en orbital shaker ved 100 o / min.Efter inkubation aspireres blokeringsbufferen fra hver brønd. Udskift det med 500 mikroliter primær antistofopløsning. Husk at inkubere en delmængde af køretøjskontrolembryoner med blokeringsbufferen for at tage højde for baggrundsstøj.Pak pladen og paraformen og aluminiumsfolien om, og lad pladen inkubere ved fire grader Celsius natten over på en orbital shaker. Den følgende dag fjernes den primære antistofopløsning fra hver brønd og erstattes med 1x PBST. Vask hver brønd tre gange med 1x PBST i fem minutter pr. vask på en orbital shaker.Aspirer 1x PBST fra hver brønd og læg IHC-kurven i et glas petriskål fyldt med RO-vand. Under et standard stereomikroskop sorteres tilfældigt intakte embryoner i en 96 brøndplade, der sikrer et embryo pr. Brønd. Fjern derefter alt RO-vand fra individuelle brønde og tilsæt 200 mikroliter 1x PBS.Centrifuge pladen i tre minutter ved et G.Image embryonerne med et to gange mål under transmitteret lys og FITC. Vælg autofokus for at sikre, at kameraets fokus er på bunden af pladen og forskudt af bundtykkelsen. Vælg en FITC-bølgelængde med en eksponeringsvarighed på 100 millisekunder, og indstil autofokus til laser med en Z-forskydning.Overhold og bekræft korrekt billedoptagelse og flere brønde, inden du påbegynder pladeoptagelse. Efter billedindsamling skal du udføre dataanalyse ved hjælp af screeningssystemet med højt indhold og en brugerdefineret automatiseret billedanalyseprocedure. Vælg hvert embryo på 96-brøndpladen, der skal analyseres for det samlede areal og den integrerede intensitet af fluorescens.Tabulerer derefter datapunkterne og eksporterer dem fra screeningssystemet med højt indhold ved at gå til måling og vælge åben datalog for at eksportere dataene til et regneark. Overfør det eksporterede regneark til installationspakken for at sortere og opsummere data for hver brønd og filtrere efter brøndnummer. Brug derefter den rigtige Excel-pakke til at eksportere de opsummerede data til et regneark.Fordelingen og den integrerede intensitet af 5-methylcytosinspecifikt samlet areal blev vurderet for zebrafiskembryoner seks timer efter befrugtningen. X-aksen viser eksponering for enten DMSO som køretøj eller TDCIPP som den positive kontrol. Y-aksen betegner relativ fluorescens.Tærsklerne var signifikant forskellige fra de køretøjsbehandlede embryoner, som det fremgår af det samlede areal af 5-methylcytosin, der blev påvist i embryoner, og den integrerede intensitet inden for det samme område, hvilket indikerer maksimalt signal til støjforhold. Det er ekstremt vigtigt at opretholde integriteten af åget og cellemassen for korrekt IHC-detektion. Denne metode er relativt ufølsom og tilbyder kun relativ overflod RFU-data.Hvis der er behov for kvantificering, kan man følge op med en mere målrettet tilgang.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering og karakterisering af enkeltceller fra zebrafisk embryoer

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Generation af Parabiotic zebrafisk embryoner ved Kirurgisk Fusion af Udvikling Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Affinity Labeling Påvisning af endogene receptorer fra zebrafisk embryoer

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing Motor Neuron Membran Potential i Live Zebrafish Embryoer

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induktion af hypoxi i levende frø og zebrafiskembryoner

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Encellede Photoconversion i levende intakt zebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisering af cellulære elektriske aktivitet i zebrafisk tidlige embryoner og tumorer

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Hurtig og effektiv ekspression af flere proteiner i aviær embryoner ved hjælp af mRNA-elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Hele Mount Immunhistokemi i Zebrafish Embryoner og Larver

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

Kvantificering af ethanolniveauer i zebrafiskembryoner ved hjælp af head space gaskromatografi

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...