Name: rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos
Uploaded: 2022-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos at JoVE.com

Onderzoeksondersteuning werd geleverd door een UCR Graduate Division Fellowship aan SAB, een NRSA T32 Training Program Fellowship (T32ES018827) aan SAB en een National Institutes of Health-beurs (R01ES027576) en USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) aan DCV.

Volwassen fokkers werden behandeld en behandeld in overeenstemming met een door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) goedgekeurd protocol voor diergebruik (# 20180063) aan de Universiteit van Californië, Riverside.
1. Embryoverzameling van zebravis en blootstelling aan chemische stoffen
<ol><li>Voeg kweekvallen in de tank toe aan tanks met geslachtsrijpe en reproductief levensvatbare volwassen mannelijke en vrouwelijke zebravissen. Voeg ten minste drie va...

<ol>
	<li>Zhang, H. -. Y., Xiong, J., Qi, B. -. L., Feng, Y. -. Q., Yuan, B. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+existence+of+5-hydroxymethylcytosine+and+5-formylcytosine+in+both+DNA+and+RNA+in+mammals.">The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals.</a> Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+determination+of+the+oxidation+products+of+5-methylcytosine+in+RNA.">Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA.</a> Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).</li><li>Avila-Barnard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tris(1,3-dichloro-2-propyl)+phosphate+disrupts+the+trajectory+of+cytosine+methylation+within+developing+zebrafish+embryos.">Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos.</a> Environmental Research. 211, 113078 (2022).</li><li>Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+zebrafish+embryos+to+reveal+disruptions+in+dorsoventral+patterning.">Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning.</a> Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).</li><li>Vliet, S. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal-to-zygotic+transition+as+a+potential+target+for+niclosamide+during+early+embryogenesis.">Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).</li><li>Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+alterations+in+DNA+methylation+precede+Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced+delays+in+zebrafish+epiboly.">Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly.</a> Environmental Science &amp; Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).</li><li>Dasgupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interplay+among+nuclear+receptor+ligands,+cytosine+methylation,+and+the+metabolome+in+driving+tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced+epiboly+defects+in+zebrafish.">Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish.</a> Environmental Science &amp; Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).</li><li>McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+zebrafish+embryogenesis+is+susceptible+to+developmental+TDCPP+exposure.">Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure.</a> Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).</li><li>Geiman, T. M., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+early+development.">DNA methylation in early development.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).</li><li>Wossidlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming.">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).</li><li>Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation-mediated+epigenetic+control.">DNA methylation-mediated epigenetic control.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).</li><li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy.">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).</li><li>Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cytosine+methylation+at+a+glance.">Mammalian cytosine methylation at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).</li><li>Baylin, S. B., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+exploring+the+cancer+epigenome-biological+and+translational+implications.">A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).</li><li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+chromatin-unraveling+the+tangled+web.">DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web.</a> Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).</li><li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+human+disease.">DNA methylation and human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).</li><li>Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+DNA+methylation+in+mammalian+development+and+disease.">The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).</li><li>Yuan, B. -. F., Feng, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+analysis+of+5-methylcytosine+and+its+oxidation+products.">Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products.</a> Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).</li><li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos.">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li></ol>

Tijdens dit protocol zijn er een paar stappen die van cruciaal belang zijn. Ten eerste is het bij het dechorioneren van embryo's belangrijk om de naald weg te wijzen van het weefsel van de embryo/ dooierzak / celmassa, omdat deze delen van het zich ontwikkelende embryo zeer kwetsbaar en gemakkelijk te doorboren zijn. Ten tweede, bij het overbrengen van gelabelde embryo's naar individuele putten, gebruik dan een glazen pipet om embryo's over te brengen, omdat ze zich hechten aan een plastic pipet. Ten derde, bij het uitvo...

Enzymatische modificaties stimuleren actieve methylering en demethylering van cytosine in 5-methylcytosine (5-mC) en daaropvolgende oxidatie van 5-mC in 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine en 5-carboxylcytosine 1,2. Tris(1,3-dichloor-2-propyl)fosfaat (TDCIPP) is een veelgebruikte vlamvertrager in de Verenigde Staten waarvan eerder is aangetoond dat het het traject van cytosinemethylatie verandert na vroege embryonale blootstelling vanaf 0,75 uur na de bevruchting (hpf) door vroege gastrulatie (6 pkf)3,4,5,6,7,8 . Binnen gewervelde dieren zijn 5-mC en zijn gemodificeerde derivaten van cruciaal belang voor het reguleren van de vroege embryonale ontwikkeling9. Bevruchting van een embryo veroorzaakt demethylatie van ouderlijk DNA, gevolgd door maternale mRNA-afbraak, zygotische genoomactivering en remethylering van het zygotische genoom9. Biologisch relevante processen die cytosinemethylatie gebruiken, omvatten histonmodificatie, rekrutering van transcriptionele machines, RNA-methylatie, epigenetische herprogrammering en bepaling van chromatinestructuur10,11. Cytosinemethylatie wordt ook bewaard bij gewervelde soorten, wat het belang onderstreept van het begrijpen en onderzoeken van hoe afwijkende cytosinemethylatie het traject van de ontwikkeling van een organisme kan beïnvloeden11. Bovendien is de ontwikkeling in utero gevoelig voor maternale blootstelling en kan het nadelige uitkomsten veroorzaken, zoals onmiddellijke fenotypische gevolgen, langetermijneffecten op de gevoeligheid voor volwassen ziekten en transgenerationele effecten van erfelijke epigenetische kenmerken 12,13,14.
Lange stukken cytosine-guanineparen, of CpG-eilanden, zijn de primaire foci van onderzoekers geweest die tot doel hebben de dynamiek van cytosinemethylatie in het genoom te karakteriseren 15,16,17. Op bisulfiet gebaseerde strategieën zoals bisulfietsequencing van het hele genoom, bisulfietsequencing met verminderde representatie en bisulfiet ampliconsequencing vertegenwoordigen de gouden standaard voor het ondervragen van cytosinemethylatie bij basenpaarresolutie. Op sequencing gebaseerde benaderingen zijn echter onbetaalbaar en sluiten als zodanig de mogelijkheid uit om cytosinemethylatie in ontwikkelingsstadia, meerdere concentraties per chemische stof te controleren en embryo's per behandeling te repliceren. Bovendien bieden op sequencing gebaseerde benaderingen geen informatie over ruimtelijke lokalisatie, wat van cruciaal belang is voor het begrijpen van mogelijk aangetaste celtypen en gebieden binnen een zich ontwikkelend embryo. Evenzo vertrouwen globale DNA-methylatietests zoals methylatieafhankelijke restrictieanalyse, 5-mC enzymgebonden immunoassays (ELISA's) en 5-methyl-2'-deoxycytidine (5-mC) vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LC-MS) op cel- of weefselhomogenaten en sluiten als zodanig de mogelijkheid uit om de lokalisatie en omvang van cytosinemethylatie over ruimte en tijd in intacte monsters te controleren12,18.
Vanwege het gemak van geautomatiseerde in vivo beeldvorming, genetische manipulaties, snelle ex-utero-ontwikkelingstijd en houderij tijdens embryogenese, worden zebravisembryo's nog steeds op grote schaal gebruikt als fysiologisch intacte modellen om xenobiotisch gemedieerde routes te ontdekken die bijdragen aan nadelige resultaten tijdens de vroege embryonale ontwikkeling. Daarom beschrijft het onderstaande protocol, met behulp van commercieel beschikbare antilichamen die specifiek zijn voor 5-mC, een kosteneffectieve strategie voor snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van cytosinemethylatie in individuele, intacte zebravisembryo's door gebruik te maken van whole-mount immunohistochemie (IHC), geautomatiseerde beeldvorming met hoge inhoud en efficiënte gegevensverwerking met behulp van programmeertaal voorafgaand aan statistische analyse.
Voor zover bekend is deze methode de eerste die 5-mC monitort binnen intacte zebravisembryo's. De methode maakt de detectie van DNA-methylatie in de celmassa mogelijk en heeft ook de mogelijkheid om cytosinemethylatie van dooier-gelokaliseerde maternale mRNA's te detecteren tijdens de maternale naar zygote overgang. Over het algemeen zal deze methode nuttig zijn voor de snelle identificatie van chemische stoffen die het potentieel hebben om cytosinemethylatie in situ te verstoren tijdens epigenetische herprogrammering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>540225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-&#181;L glass microcapillary pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>211762B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08757100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL pipette&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13690032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250-mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB501250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-mL pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13690033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm glass petri dishes with lids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08747A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP67110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1110016SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-tank breeding traps</td>
			<td>Aquatic Habitats</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.&#160; Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunochemistry (IHC) basket</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaXpress 6.0.3.1658&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2140115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-5-mC antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MABE146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50998290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1337412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18612139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1368050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>RStudio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3772-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-controlled incubator&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PR505755L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos

Cytosinemethylatie is sterk geconserveerd bij gewervelde soorten en speelt, als een belangrijke aanjager van epigenetische programmering en chromatinetoestand, een cruciale rol in de vroege embryonale ontwikkeling. Enzymatische modificaties stimuleren actieve methylering en demethylering van cytosine in 5-methylcytosine (5-mC) en daaropvolgende oxidatie van 5-mC in 5-hydroxymethylcytosine, 5-formylcytosine en 5-carboxylcytosine. Epigenetische herprogrammering is een kritieke periode tijdens de ontwikkeling van de baarmoeder en maternale blootstelling aan chemicaliën heeft het potentieel om het epigenoom in nakomelingen te herprogrammeren. Dit kan mogelijk nadelige gevolgen veroorzaken, zoals onmiddellijke fenotypische gevolgen, langetermijneffecten op de gevoeligheid voor volwassen ziekten en transgenerationele effecten van erfelijke epigenetische kenmerken. Hoewel op bisulfiet gebaseerde sequencing onderzoekers in staat stelt om cytosinemethylatie met basenpaarresolutie te ondervragen, zijn op sequencing gebaseerde benaderingen onbetaalbaar en sluiten ze als zodanig de mogelijkheid uit om cytosinemethylatie in ontwikkelingsstadia, meerdere concentraties per chemische stof te controleren en embryo's per behandeling te repliceren. Vanwege het gemak van geautomatiseerde in vivo beeldvorming, genetische manipulaties, snelle ex-utero-ontwikkelingstijd en houderij tijdens embryogenese, blijven zebravisembryo's worden gebruikt als een fysiologisch intact model voor het blootleggen van xenobiotisch gemedieerde routes die bijdragen aan nadelige resultaten tijdens de vroege embryonale ontwikkeling. Daarom beschrijven we, met behulp van commercieel beschikbare 5-mC-specifieke antilichamen, een kosteneffectieve strategie voor snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van cytosinemethylatie binnen individuele, intacte zebravisembryo's door gebruik te maken van immunohistochemie met hele mount, geautomatiseerde beeldvorming met hoge inhoud en efficiënte gegevensverwerking met behulp van programmeertaal voorafgaand aan statistische analyse. Volgens de huidige kennis is deze methode de eerste die met succes 5-mC-niveaus in situ in zebravisembryo's detecteert en kwantificeert tijdens de vroege ontwikkeling. De methode maakt de detectie van DNA-methylatie in de celmassa mogelijk en heeft ook de mogelijkheid om cytosinemethylatie van dooier-gelokaliseerde maternale mRNA's te detecteren tijdens de maternale naar zygote overgang. Over het algemeen zal deze methode nuttig zijn voor de snelle identificatie van chemische stoffen die het potentieel hebben om cytosinemethylatie in situ te verstoren tijdens epigenetische herprogrammering.

Het algemene doel van dit protocol is om te bepalen of een behandeling de relatieve abundantie van 5-mC beïnvloedt door het totale gebied en de relatieve intensiteit van fluorescentie binnen vaste en gelabelde zebravisembryo's te beoordelen. Na het voltooien van het protocol kan een fluorescentiemicroscoop worden gebruikt om eerst te bepalen of de IHC met hele mount succesvol was. Wanneer gelabelde embryo's worden waargenomen onder een FITC- of GFP-filter, wordt een positief resultaat aangegeven door een positief FITC-s...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos at JoVE.com

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Dit artikel beschrijft een protocol voor de snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie in intacte zebravisembryo's.

Snelle en efficiënte spatiotemporale monitoring van normale en afwijkende cytosinemethylatie binnen intacte zebravisembryo's

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

Dit protocol biedt een relatief snelle en kostenefficiënte methode, evenals een geautomatiseerde acquisitie en analyse, waardoor een screening met een lage gevoeligheid van 5-methylcytosine wordt geproduceerd, een veel voorkomende epigenetische biomarker. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is de flexibiliteit die het biedt een experimenteel ontwerp dat gebruikers kunnen optimaliseren voor hun model en ontwikkelingsfase. Deze techniek kan worden gebruikt om te detecteren hoe chemische blootstelling de relatieve abundantie van 5-methylcytosine in een zich ontwikkelend organisme verandert, wat normaal gesproken alleen zou kunnen worden gedaan door middel van dure hoge trpA-methoden zoals sequencing.Deze methode is nuttig voor elk onderzoek dat tot doel heeft NCG-methoden te gebruiken om epigenetische veranderingen van 5-Methylcytosine te begrijpen als reactie op omgevingsstimuli. Begin met het bereiden van een nieuwe belichtingsoplossing op de ochtend van het verzamelen. Voeg vijf milliliter deeltjesvrij systeemwater toe aan een petrischaaltje van 60 millimeter glas.Gebruik vervolgens een 10 microliter micro capillaire glazen pipet om 10 microliter dimethylsulfoxide of chemische voorraadoplossing over te brengen naar systeemwater. Draai de glazen petrischaal om ervoor te zorgen dat de voorraadoplossing verdwijnt. Voeg nog eens vijf milliliter systeemwater toe aan de glazen petrischaal en draai de schaal om de blootstellingsoplossing te homogeniseren.Sluit de glazen schalen af met glazen deksels om verdamping te minimaliseren. Gebruik vervolgens een met RO water gevulde spuitfles om de embryo's van het visnet in een schaal van 100 millimeter te brengen. Sorteer willekeurig 50 levende embryo's op 0,75 uur na de bevruchting en verwijder overtollig RO-water.Nadat de blootstellingsduur is beëindigd, verwijdert u de embryo's uit de couveuse. Breng alle levende embryo's over naar een microcentrifugebuis van 1,5 milliliter. Aspirate restblootstellingsoplossing zonder embryo's aan te zuigen.Voeg 500 microliter gekoelde 4% paraformaldehyde toe en meng de embryo's meerdere keren door inversie. Laat de embryo's fixeren en 4% paraformaldehyde 's nachts op vier graden celsius. Na het fixeren van de embryo's aspirateer de 4% paraformaldehyde, respend de embryo's in 1X PBS en meng door zachtjes te pipetteren gedurende 30 seconden.Breng met behulp van een glazen pipet zorgvuldig vaste embryo's over naar een ro-met water gevulde glazen schaal. Draai voorzichtig gedurende 30 seconden en herhaal deze wasbeurt eenmaal. Onder een stereomicroscoop ingesteld op vijf keer vergroting de embryo's ontgiften met behulp van spuitnaalden.Prik met behulp van de naaldpunt het chorion door en pel het voorzichtig af van de dooier en celmassa. Nadat de embryo's zijn versierd, gebruikt u een glazen microcapillaire pipet om tot 25 intacte embryo's in één immunohistochemische mand te brengen. Plaats de IHC mand in een bord met 24 putten.Zuig vervolgens het water uit elke put. Resuspendeer de embryo's in 500 microliter blokkerende buffer per put, wikkel de plaat met paraform en aluminiumfolie om het te beschermen tegen licht. Incubeer de plaat vier uur lang op vier graden Celsius op een orbitale shaker bij 100 rpm.Na incubatie aspirateer je de blokkerende buffer uit elke put. Vervang het door 500 microliter primaire antilichaamoplossing. Vergeet niet om een subset van voertuigcontrole-embryo's te incuberen met de blokkerende buffer om rekening te houden met achtergrondgeluid.Verpak de plaat en paraform en aluminiumfolie opnieuw en laat de plaat 's nachts bij vier graden Celsius incuberen op een orbitale shaker. Verwijder de volgende dag de primaire antilichaamoplossing uit elke put en vervang deze door 1x PBST. Was elke put driemaal met 1x PBST gedurende vijf minuten per wasbeurt op een orbitale shaker.Haal 1x PBST uit elke put en plaats de IHC-mand in een glazen petrischaal gevuld met RO-water. Onder een standaard stereomicroscoop willekeurig intacte embryo's sorteren in een 96 putplaat die één embryo per put garandeert. Verwijder vervolgens al het RO-water uit individuele putten en voeg 200 microliter 1x PBS toe.Centrifugeer de plaat gedurende drie minuten bij één G.Beeld de embryo's af met een twee keer objectief onder doorgelaten licht en FITC. Selecteer autofocus om ervoor te zorgen dat de focus van de camera zich op de onderkant van de plaat bevindt en wordt gecompenseerd door de onderste dikte. Selecteer een FITC-golflengte met een belichtingsduur van 100 milliseconden en stel de autofocus in op laser met een Z-offset.Observeer en bevestig de juiste beeldacquisitie en verschillende putten voordat u begint met het verwerven van platen. Voer na beeldacquisitie gegevensanalyse uit met behulp van het screeningsysteem met hoge inhoud en een aangepaste geautomatiseerde beeldanalyseprocedure. Selecteer elk embryo op de 96 putplaat die moet worden geanalyseerd op totale oppervlakte en geïntegreerde intensiteit van fluorescentie.Voer vervolgens de gegevenspunten in tabelvorm uit en exporteer ze vanuit het screeningsysteem met hoge inhoud door naar meten te gaan en een open gegevenslogboek te selecteren om de gegevens naar een spreadsheet te exporteren. Upload de geëxporteerde spreadsheet naar het deployer-pakket om gegevens voor elke put te sorteren en op te tellen en te filteren op putnummer. Gebruik vervolgens het juiste Excel-pakket om de samengevatte gegevens naar een spreadsheet te exporteren.De verdeling en geïntegreerde intensiteit van het 5-Methylcytosine specifieke totale gebied werden beoordeeld voor zebravisembryo's zes uur na de bevruchting. De x-as toont de blootstelling aan DMSO als voertuig of TDCIPP als de positieve controle. De Y-as duidt op relatieve fluorescentie.De drempelwaarden verschilden significant van de met het medium behandelde embryo's, zoals blijkt uit het totale gebied van 5-methylcytosine dat in embryo's is gedetecteerd en de geïntegreerde intensiteit binnen datzelfde gebied dat de maximale signaal-ruisverhouding aangeeft. Het is uiterst belangrijk om de integriteit van het juk en de celmassa te behouden voor een goede IHC-detectie. Deze methode is relatief ongevoelig en biedt alleen relatieve abundantie RFU-gegevens.Als kwantificering nodig is, kan men een meer gerichte aanpak volgen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolatie en karakterisering van enkele cellen van zebravis embryo&#39;s

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Generatie Parabiotic zebravis embryo&#39;s door Surgical Fusion of Developing Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Affiniteit Labeling Detectie van endogene receptoren van zebravis embryo&#39;s

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing Motor Neuron Membraan Potentieel in Live Zebrafish Embryo&#39;s

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Inductie van hypoxie in levende kikker en zebravis embryo&#39;s

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Eencellige Photoconversion in levende Intact zebravis

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisatie van cellulaire elektrische activiteit in de zebravis vroege embryo's en tumoren

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Snelle en efficiënte expressie van meervoudige eiwitten in aviaire embryo's met behulp van mRNA-Elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Hele mount immunohistochemie in zebravissen embryo's en larven

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

Kwantificering van ethanolniveaus in zebravisembryo's met behulp van head space gaschromatografie

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...