Name: rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos
Uploaded: 2022-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos at JoVE.com

Le soutien à la recherche a été fourni par une bourse de la division des études supérieures de l’UCR à SAB, une bourse du programme de formation T32 de la NRSA (T32ES018827) à SAB, et une subvention des National Institutes of Health (R01ES027576) et le projet Hatch (1009609) de l’USDA National Institute of Food and Agriculture à DCV.

Les éleveurs adultes ont été manipulés et traités conformément à un protocole d’utilisation des animaux approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) (#20180063) à l’Université de Californie, Riverside.
1. Collecte d’embryons de poisson zèbre et exposition à des produits chimiques
<ol><li>Ajouter des pièges de reproduction dans les bassins contenant des poissons-zèbres mâles et femelles adultes sexuellement matures...

<ol>
	<li>Zhang, H. -. Y., Xiong, J., Qi, B. -. L., Feng, Y. -. Q., Yuan, B. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+existence+of+5-hydroxymethylcytosine+and+5-formylcytosine+in+both+DNA+and+RNA+in+mammals.">The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals.</a> Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+determination+of+the+oxidation+products+of+5-methylcytosine+in+RNA.">Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA.</a> Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).</li><li>Avila-Barnard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tris(1,3-dichloro-2-propyl)+phosphate+disrupts+the+trajectory+of+cytosine+methylation+within+developing+zebrafish+embryos.">Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos.</a> Environmental Research. 211, 113078 (2022).</li><li>Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+zebrafish+embryos+to+reveal+disruptions+in+dorsoventral+patterning.">Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning.</a> Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).</li><li>Vliet, S. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal-to-zygotic+transition+as+a+potential+target+for+niclosamide+during+early+embryogenesis.">Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).</li><li>Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+alterations+in+DNA+methylation+precede+Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced+delays+in+zebrafish+epiboly.">Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly.</a> Environmental Science &amp; Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).</li><li>Dasgupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interplay+among+nuclear+receptor+ligands,+cytosine+methylation,+and+the+metabolome+in+driving+tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced+epiboly+defects+in+zebrafish.">Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish.</a> Environmental Science &amp; Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).</li><li>McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+zebrafish+embryogenesis+is+susceptible+to+developmental+TDCPP+exposure.">Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure.</a> Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).</li><li>Geiman, T. M., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+early+development.">DNA methylation in early development.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).</li><li>Wossidlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming.">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).</li><li>Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation-mediated+epigenetic+control.">DNA methylation-mediated epigenetic control.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).</li><li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy.">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).</li><li>Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cytosine+methylation+at+a+glance.">Mammalian cytosine methylation at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).</li><li>Baylin, S. B., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+exploring+the+cancer+epigenome-biological+and+translational+implications.">A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).</li><li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+chromatin-unraveling+the+tangled+web.">DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web.</a> Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).</li><li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+human+disease.">DNA methylation and human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).</li><li>Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+DNA+methylation+in+mammalian+development+and+disease.">The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).</li><li>Yuan, B. -. F., Feng, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+analysis+of+5-methylcytosine+and+its+oxidation+products.">Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products.</a> Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).</li><li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos.">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li></ol>

Au cours de ce protocole, il y a quelques étapes qui sont critiques. Tout d’abord, lors de la déchorionisation des embryons, il est important de pointer l’aiguille loin du tissu de l’embryon / sac vitellin / masse cellulaire, car ces parties de l’embryon en développement sont très fragiles et faciles à percer. Deuxièmement, lors du transfert d’embryons marqués vers des puits individuels, utilisez une pipette en verre pour transférer les embryons, car ils adhéreront à une pipette en plastique. Troisiè...

Les modifications enzymatiques entraînent la méthylation active et la déméthylation de la cytosine en 5-méthylcytosine (5-mC) et l’oxydation ultérieure de la 5-mC en 5-hydroxyméthylcytosine, 5-formylcytosine et 5-carboxylcytosine 1,2. Le phosphate de tris(1,3-dichloro-2-propyle) (TDCIPP) est un retardateur de flamme largement utilisé aux États-Unis dont il a déjà été démontré qu’il modifie la trajectoire de méthylation de la cytosine après une exposition embryonnaire précoce de 0,75 heure après la fécondation (HPF) jusqu’à la gastrulation précoce (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . Chez les vertébrés, le 5-mC et ses dérivés modifiés sont essentiels pour réguler le développement embryonnaire précoce9. La fécondation d’un embryon déclenche la déméthylation de l’ADN parental, suivie de la dégradation de l’ARNm maternel, de l’activation du génome zygotique et de la reméthylation du génome zygotique9. Les processus biologiquement pertinents qui utilisent la méthylation de la cytosine comprennent la modification des histones, le recrutement de la machinerie transcriptionnelle, la méthylation de l’ARN, la reprogrammation épigénétique et la détermination de la structure de la chromatine10,11. La méthylation de la cytosine est également conservée chez les espèces de vertébrés, ce qui souligne l’importance de comprendre et d’étudier comment la méthylation aberrante de la cytosine peut affecter la trajectoire du développement d’un organisme11. De plus, le développement in utero est sensible à l’exposition maternelle et peut entraîner des effets indésirables tels que des conséquences phénotypiques immédiates, des effets à long terme sur la susceptibilité aux maladies chez l’adulte et des effets transgénérationnels des marques épigénétiques héréditaires12,13,14.
De longues étendues de paires cytosine-guanine, ou îlots CpG, ont été les principaux foyers d’intérêt des chercheurs qui visent à caractériser la dynamique de la méthylation de la cytosine dans le génome15,16,17. Les stratégies à base de bisulfite telles que le séquençage du bisulfite du génome entier, le séquençage du bisulfite à représentation réduite et le séquençage de l’amplicon du bisulfite représentent l’étalon-or pour interroger la méthylation de la cytosine à la résolution par paire de bases. Cependant, les approches basées sur le séquençage sont d’un coût prohibitif et, en tant que telles, empêchent la capacité de surveiller la méthylation de la cytosine à tous les stades de développement, à des concentrations multiples par produit chimique et de répliquer les embryons par traitement. En outre, les approches basées sur le séquençage ne fournissent pas d’informations sur la localisation spatiale, ce qui est essentiel pour comprendre les types de cellules et les zones potentiellement affectées au sein d’un embryon en développement. De même, les tests globaux de méthylation de l’ADN tels que l’analyse de restriction dépendante de la méthylation, les tests immunologiques enzymatiques (ELISA) de 5-mC et la chromatographie liquide par spectrométrie de masse (LC-MS) de la 5-méthyl-2'-désoxycytidine (5-mC) reposent sur des homogénats cellulaires ou tissulaires et, en tant que tels, empêchent la capacité de surveiller la localisation et l’ampleur de la méthylation de la cytosine dans l’espace et le temps dans des échantillons intacts12,18.
En raison de la facilité de l’imagerie in vivo automatisée, des manipulations génétiques, du temps de développement ex utero rapide et de l’élevage pendant l’embryogenèse, les embryons de poisson zèbre continuent d’être largement utilisés comme modèles physiologiquement intacts pour découvrir les voies médiées par les xénobiotiques qui contribuent à des résultats indésirables au début du développement embryonnaire. Par conséquent, en utilisant des anticorps disponibles dans le commerce spécifiques au 5-mC, le protocole ci-dessous décrit une stratégie rentable pour une surveillance spatio-temporelle rapide et efficace de la méthylation de la cytosine dans des embryons de poisson-zèbre intacts individuels en tirant parti de l’immunohistochimie (IHC), de l’imagerie automatisée à haut contenu et du traitement efficace des données à l’aide du langage de programmation avant l’analyse statistique.
Selon les connaissances actuelles, cette méthode est la première à surveiller le 5-mC dans des embryons de poisson zèbre intacts. La méthode permet la détection de la méthylation de l’ADN dans la masse cellulaire et a également la capacité de détecter la méthylation de la cytosine des ARNm maternels localisés par le jaune au cours de la transition mère-zygote. Dans l’ensemble, cette méthode sera utile pour l’identification rapide des produits chimiques susceptibles de perturber la méthylation de la cytosine in situ lors de la reprogrammation épigénétique.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>540225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-&#181;L glass microcapillary pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>211762B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08757100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL pipette&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13690032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250-mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB501250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-mL pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13690033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm glass petri dishes with lids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08747A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP67110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1110016SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-tank breeding traps</td>
			<td>Aquatic Habitats</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.&#160; Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunochemistry (IHC) basket</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaXpress 6.0.3.1658&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2140115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-5-mC antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MABE146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50998290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1337412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18612139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1368050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>RStudio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3772-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-controlled incubator&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PR505755L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos

La méthylation de la cytosine est hautement conservée chez les espèces de vertébrés et, en tant que facteur clé de la programmation épigénétique et de l’état de chromatine, joue un rôle essentiel dans le développement embryonnaire précoce. Les modifications enzymatiques entraînent la méthylation active et la déméthylation de la cytosine en 5-méthylcytosine (5-mC) et l’oxydation ultérieure de la 5-mC en 5-hydroxyméthylcytosine, 5-formylcytosine et 5-carboxylcytosine. La reprogrammation épigénétique est une période critique du développement in utero , et l’exposition maternelle aux produits chimiques a le potentiel de reprogrammer l’épigénome dans la progéniture. Cela peut potentiellement entraîner des résultats indésirables tels que des conséquences phénotypiques immédiates, des effets à long terme sur la susceptibilité aux maladies chez l’adulte et des effets transgénérationnels des marques épigénétiques héréditaires. Bien que le séquençage à base de bisulfite permette aux chercheurs d’interroger la méthylation de la cytosine à une résolution par paire de bases, les approches basées sur le séquençage sont coûteuses et, en tant que telles, empêchent la capacité de surveiller la méthylation de la cytosine à tous les stades de développement, les concentrations multiples par produit chimique et les embryons répliqués par traitement. En raison de la facilité de l’imagerie in vivo automatisée, des manipulations génétiques, du temps de développement ex utero rapide et de l’élevage pendant l’embryogenèse, les embryons de poisson zèbre continuent d’être utilisés comme modèle physiologiquement intact pour découvrir les voies médiées par les xénobiotiques qui contribuent à des résultats indésirables au cours du développement embryonnaire précoce. Par conséquent, en utilisant des anticorps spécifiques au 5-mC disponibles dans le commerce, nous décrivons une stratégie rentable pour une surveillance spatio-temporelle rapide et efficace de la méthylation de la cytosine dans des embryons de poisson-zèbre intacts individuels en tirant parti de l’immunohistochimie à montage entier, de l’imagerie automatisée à haut contenu et du traitement efficace des données à l’aide du langage de programmation avant l’analyse statistique. Selon les connaissances actuelles, cette méthode est la première à détecter et à quantifier avec succès les niveaux de 5-mC in situ dans les embryons de poisson zèbre au cours du développement précoce. La méthode permet la détection de la méthylation de l’ADN dans la masse cellulaire et a également la capacité de détecter la méthylation de la cytosine des ARNm maternels localisés par le jaune au cours de la transition mère-zygote. Dans l’ensemble, cette méthode sera utile pour l’identification rapide des produits chimiques susceptibles de perturber la méthylation de la cytosine in situ lors de la reprogrammation épigénétique.

L’objectif global de ce protocole est de déterminer si un traitement affecte l’abondance relative de 5-mC en évaluant la surface totale et l’intensité relative de la fluorescence dans les embryons de poisson-zèbre fixes et marqués. Après avoir terminé le protocole, un stéréomicroscope à fluorescence peut être utilisé pour déterminer d’abord si l’IHC à monture entière a réussi. Lorsque des embryons marqués sont observés sous un filtre FITC ou GFP, un résultat positif est indiqué par un signal...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos at JoVE.com

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Cet article décrit un protocole pour la surveillance spatio-temporelle rapide et efficace de la méthylation normale et aberrante de la cytosine dans des embryons intacts de poisson-zèbre.

Surveillance spatio-temporelle rapide et efficace de la méthylation normale et aberrante de la cytosine dans des embryons intacts de poisson-zèbre

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

Ce protocole offre une méthode relativement rapide et rentable, ainsi qu’une acquisition et une analyse automatisées, produisant ainsi un criblage à faible sensibilité de la 5-méthylcytosine qui est un biomarqueur épigénétique commun. Le principal avantage de cette technique réside dans la flexibilité qu’elle offre une conception expérimentale que les utilisateurs peuvent optimiser en fonction de leur modèle et de leur stade de développement. Cette technique peut être utilisée pour détecter comment l’exposition chimique modifie l’abondance relative de la 5-méthylcytosine dans un organisme en développement, ce qui ne pourrait normalement être fait que par des méthodes coûteuses à forte trpA telles que le séquençage.Cette méthode est utile à toute recherche qui vise à utiliser les méthodes NCG pour comprendre les altérations épigénétiques de la 5-méthylcytosine en réponse à des stimuli environnementaux. Commencez par préparer une solution d’exposition fraîche le matin de la collecte. Ajouter cinq millilitres d’eau du système exempt de particules dans une boîte de Petri en verre de 60 millimètres.Utilisez ensuite une pipette micro-capillaire en verre de 10 microlitres pour transférer 10 microlitres de diméthylsulfoxyde ou de solution mère chimique dans l’eau du système. Faites tourbillonner la boîte de Petri en verre pour vous assurer que la solution mère se dissipe. Ajouter cinq millilitres supplémentaires d’eau du système à la boîte de Petri en verre et faire tourbillonner la boîte pour homogénéiser la solution d’exposition.Boucher les plats en verre avec des couvercles en verre pour minimiser l’évaporation. Ensuite, utilisez une bouteille d’eau remplie d’osmose inverse pour transférer les embryons de la fille de poisson dans un plat de 100 millimètres. Triez au hasard 50 embryons vivants 0,75 heure après la fécondation et retirez l’excès d’eau osmosée.Une fois la durée d’exposition terminée, retirez les embryons de l’incubateur. Transférer tous les embryons vivants dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Aspirer la solution d’exposition résiduelle sans aspirer d’embryons.Ajouter 500 microlitres de paraformaldéhyde réfrigéré à 4% et mélanger les embryons par inversion plusieurs fois. Laisser les embryons se fixer et 4% de paraformaldéhyde pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Après avoir fixé, les embryons aspirent le paraformaldéhyde à 4%, redépensez les embryons dans 1X PBS et mélangez par pipetage doux pendant 30 secondes.À l’aide d’une pipette en verre, transférer soigneusement les embryons fixés dans un plat en verre rempli d’eau osmosée. Remuer doucement pendant 30 secondes et répéter ce lavage une fois. Sous un stéréomicroscope réglé à un grossissement de cinq fois, décorer les embryons à l’aide d’aiguilles de seringue.À l’aide de l’extrémité de l’aiguille, percez le chorion et retirez-le doucement du jaune et de la masse cellulaire. Une fois les embryons décorés, utilisez une micropipette capillaire en verre pour transférer jusqu’à 25 embryons intacts dans un panier d’immunohistochimie. Placez le panier IHC dans une plaque de 24 puits.Ensuite, aspirez l’eau de chaque puits. Remettez les embryons en suspension dans 500 microlitres de tampon de blocage par puits, enveloppez la plaque avec du paraforme et du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière. Incuber la plaque à quatre degrés Celsius pendant quatre heures sur un agitateur orbital à 100 tr / min.Après l’incubation, aspirez le tampon de blocage de chaque puits. Remplacez-le par 500 microlitres de solution d’anticorps primaires. N’oubliez pas d’incuber un sous-ensemble d’embryons de contrôle de véhicule avec le tampon de blocage pour tenir compte du bruit de fond.Reconditionnez la plaque, la forme paraforme et la feuille d’aluminium et laissez la plaque incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit sur un agitateur orbital. Le lendemain, retirez la solution d’anticorps primaire de chaque puits et remplacez-la par 1x PBST. Lavez chaque puits trois fois avec 1x PBST pendant cinq minutes par lavage sur un agitateur orbital.Aspirez 1x PBST de chaque puits et placez le panier IHC dans une boîte de Petri en verre remplie d’eau osmosée. Sous un stéréomicroscope standard, triez au hasard les embryons intacts dans une plaque de 96 puits, assurant un embryon par puits. Ensuite, retirez toute l’eau osmosée des puits individuels et ajoutez 200 microlitres de 1x PBS.Centrifuger la plaque pendant trois minutes à un G.Image les embryons avec un objectif deux fois sous lumière transmise et FITC. Sélectionnez la mise au point automatique pour vous assurer que la mise au point de l’appareil photo est sur le bas de la plaque et décalée par l’épaisseur inférieure. Sélectionnez une longueur d’onde FITC avec une durée d’exposition de 100 millisecondes et réglez la mise au point automatique sur laser avec un décalage Z.Observer et confirmer l’acquisition correcte de l’image et de plusieurs puits avant de commencer l’acquisition de plaques. Après l’acquisition de l’image, effectuez l’analyse des données à l’aide du système de filtrage à haut contenu et d’une procédure d’analyse d’image automatisée personnalisée. Sélectionnez chaque embryon sur la plaque de 96 puits à analyser pour la surface totale et l’intensité intégrée de la fluorescence.Ensuite, tabulez les points de données et exportez-les à partir du système de filtrage à haut contenu en allant sur mesurer et en sélectionnant Open Data log pour exporter les données vers une feuille de calcul. Téléchargez la feuille de calcul exportée dans le package du déployeur pour trier et additionner les données de chaque puits et filtrer par numéro de puits. Utilisez ensuite le bon package Excel pour exporter les données résumées dans une feuille de calcul.La distribution et l’intensité intégrée de la surface totale spécifique de la 5-méthylcytosine ont été évaluées pour les embryons de poisson zèbre six heures après la fécondation. L’axe des x montre l’exposition au DMSO en tant que véhicule ou au TDCIPP en tant que témoin positif. L’axe des Y indique la fluorescence relative.Les seuils étaient significativement différents de ceux des embryons traités dans le véhicule, comme le montrent la surface totale de 5-méthylcytosine détectée dans les embryons et l’intensité intégrée dans cette même zone indiquant un rapport signal sur bruit maximal. Il est extrêmement important de maintenir l’intégrité du joug et de la masse cellulaire pour une détection correcte de l’IHC. Cette méthode est relativement peu sensible et n’offre que des données RFU d’abondance relative.Si une quantification est nécessaire, on peut suivre avec une approche plus ciblée.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolement et caractérisation de cellules isolées à partir d&#39;embryons de poisson zèbre

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Recherche

Biologie du développement

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Génération de parabiose Zebrafish Embryons par Fusion chirurgicale de développement blastulas

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Affinity Étiquetage Détection de Endogène Receptors de Zebrafish Embryons

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing Potentiel de membrane de neurones moteurs dans les embryons vivants de zébrés

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induction de l&#39;hypoxie dans les écrevisses vivantes de grenouille et de poisson zèbre

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion cellule unique chez le poisson zèbre Intact de la vie

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisation de l’activité électrique cellulaire dans les jeunes embryons de poisson-zèbre et tumeurs

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Expression rapide et efficace des protéines multiples dans les embryons aviaires à l'aide de l'électroporation de l'ARNm

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Immunohistochimie du mont entier dans les embryons et larves de poissons-zèbres

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

Quantification des niveaux d’éthanol dans les embryons de poisson zèbre à l’aide de la chromatographie de gaz de l’espace de tête

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...