Name: rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos
Uploaded: 2022-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos at JoVE.com

תמיכה מחקרית ניתנה על ידי מלגת חטיבת בוגרי UCR ל- SAB, מלגת תוכנית הכשרה של NRSA T32 (T32ES018827) ל- SAB, ומענק של המכונים הלאומיים לבריאות (R01ES027576) ופרויקט האצ'ים של המכון הלאומי למזון וחקלאות של USDA (1009609) ל- DCV.

מגדלים בוגרים טופלו וטופלו בהתאם ל 20180063 פרוטוקול שימוש בבעלי חיים (IACUC) שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת קליפורניה, ריברסייד.
1. איסוף עוברים של דגי זברה וחשיפה כימית
<ol><li>הוסף מלכודות רבייה בתוך המיכל למיכלים המכילים דגי זברה ב?...

<ol>
	<li>Zhang, H. -. Y., Xiong, J., Qi, B. -. L., Feng, Y. -. Q., Yuan, B. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+existence+of+5-hydroxymethylcytosine+and+5-formylcytosine+in+both+DNA+and+RNA+in+mammals.">The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals.</a> Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+determination+of+the+oxidation+products+of+5-methylcytosine+in+RNA.">Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA.</a> Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).</li><li>Avila-Barnard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tris(1,3-dichloro-2-propyl)+phosphate+disrupts+the+trajectory+of+cytosine+methylation+within+developing+zebrafish+embryos.">Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos.</a> Environmental Research. 211, 113078 (2022).</li><li>Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+zebrafish+embryos+to+reveal+disruptions+in+dorsoventral+patterning.">Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning.</a> Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).</li><li>Vliet, S. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal-to-zygotic+transition+as+a+potential+target+for+niclosamide+during+early+embryogenesis.">Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).</li><li>Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+alterations+in+DNA+methylation+precede+Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced+delays+in+zebrafish+epiboly.">Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly.</a> Environmental Science &amp; Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).</li><li>Dasgupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interplay+among+nuclear+receptor+ligands,+cytosine+methylation,+and+the+metabolome+in+driving+tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced+epiboly+defects+in+zebrafish.">Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish.</a> Environmental Science &amp; Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).</li><li>McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+zebrafish+embryogenesis+is+susceptible+to+developmental+TDCPP+exposure.">Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure.</a> Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).</li><li>Geiman, T. M., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+early+development.">DNA methylation in early development.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).</li><li>Wossidlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming.">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).</li><li>Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation-mediated+epigenetic+control.">DNA methylation-mediated epigenetic control.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).</li><li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy.">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).</li><li>Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cytosine+methylation+at+a+glance.">Mammalian cytosine methylation at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).</li><li>Baylin, S. B., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+exploring+the+cancer+epigenome-biological+and+translational+implications.">A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).</li><li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+chromatin-unraveling+the+tangled+web.">DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web.</a> Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).</li><li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+human+disease.">DNA methylation and human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).</li><li>Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+DNA+methylation+in+mammalian+development+and+disease.">The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).</li><li>Yuan, B. -. F., Feng, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+analysis+of+5-methylcytosine+and+its+oxidation+products.">Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products.</a> Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).</li><li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos.">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li></ol>

במהלך פרוטוקול זה, ישנם כמה שלבים שהם קריטיים. ראשית, בעת דכוריזציה של עוברים, חשוב לכוון את המחט הרחק מהרקמה של העובר/שק החלמון/מסת התא, שכן חלקים אלה של העובר המתפתח שבריריים מאוד וקלים לניקוב. שנית, בעת העברת עוברים מסומנים לבארות בודדות, השתמש בפיפטה מזכוכית כדי להעביר עוברים מכיוון שהם ...

שינויים אנזימטיים מניעים מתילציה פעילה ודה-מתילציה של ציטוזין ל-5-מתיל-ציטוזין (5-mC) ולאחר מכן חמצון של 5-mC ל-5-הידרוקסי-מתיל-ציטוזין, 5-פורמילציטוזין ו-5-קרבוקסילציטוזין 1,2. טריס(1,3-דיכלורו-2-פרופיל) פוספט (TDCIPP) הוא מעכב בעירה בשימוש נרחב בארצות הברית שהוכח בעבר כמשנה את המסלול של מתילציה ציטוזין בעקבות חשיפה עוברית מוקדמת מ-0.75 שעות לאחר ההפריה (HPF) ועד גסטרולציה מוקדמת (6 כ"ס)3,4,5,6,7,8 . בתוך בעלי חוליות, 5-mC ונגזרותיו המתוקנות הם קריטיים לוויסות ההתפתחות העוברית המוקדמת9. הפריה של עובר גורמת לדה-מתילציה של הדנ"א ההורי, ואחריה פירוק mRNA אימהי, הפעלת הגנום הזיגוטי ומתילציה מחדש של הגנום הזיגוטי9. תהליכים רלוונטיים ביולוגית המשתמשים במתילציה של ציטוזין כוללים שינוי היסטון, גיוס מכונות שעתוק, מתילציה של RNA, תכנות מחדש אפיגנטי וקביעת מבנה הכרומטין10,11. מתילציה של ציטוזין נשמרת גם בקרב מיני בעלי חוליות, מה שמדגיש את החשיבות של הבנה וחקירה של האופן שבו מתילציה של ציטוזין סוטה עשויה להשפיע על מסלול ההתפתחות של אורגניזם11. יתר על כן, התפתחות הרחם רגישה לחשיפה אימהית ויש לה פוטנציאל לגרום לתוצאות שליליות כגון השלכות פנוטיפיות מיידיות, השפעות ארוכות טווח על רגישות למחלות מבוגרים, והשפעות טרנס-דוריות של סימנים אפיגנטיים תורשתיים12,13,14.
קטעים ארוכים של זוגות ציטוזין-גואנין, או איי CpG, היו המוקדים העיקריים של חוקרים שמטרתם לאפיין את הדינמיקה של מתילציה של ציטוזין על פני הגנום15,16,17. אסטרטגיות מבוססות ביסולפיט כגון ריצוף ביסולפיט בגנום שלם, ריצוף ביסולפיט בייצוג מופחת וריצוף אמפליקון ביסולפיט מייצגות את תקן הזהב לחקר מתילציה של ציטוזין ברזולוציית זוג בסיסים. עם זאת, גישות מבוססות ריצוף הן בעלות גבוהה, וככאלה, מונעות את היכולת לנטר מתילציה של ציטוזין בשלבי התפתחות, ריכוזים מרובים לכל כימיקל, ולשכפל עוברים לכל טיפול. בנוסף, גישות מבוססות ריצוף אינן מספקות מידע על לוקליזציה מרחבית, שהיא קריטית להבנת סוגי תאים ואזורים שעלולים להיות מושפעים בתוך עובר מתפתח. באופן דומה, מבחני מתילציה גלובליים של דנ"א, כגון ניתוח הגבלות תלויות מתילציה, בדיקות חיסוניות הקשורות לאנזים 5-mC (ELISAs), וספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית 5-מתיל-2'-דאוקסיציטידין (5-mC) (LC-MS) מסת על הומוגנאטים של תאים או רקמות, וככאלה, מונעים את היכולת לנטר את הלוקליזציה והגודל של מתילציה של ציטוזין על פני מרחב וזמן בתוך דגימות שלמות12,18.
בשל הקלות של הדמיית in vivo אוטומטית, מניפולציות גנטיות, זמן התפתחות מהיר של הרחם לשעבר , וגידול במהלך העוברים, עוברי דגי זברה ממשיכים להיות בשימוש נרחב כמודלים שלמים מבחינה פיזיולוגית כדי לחשוף מסלולים בתיווך קסנוביוטי התורמים לתוצאות שליליות במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת. לכן, תוך שימוש בנוגדנים זמינים מסחרית ספציפיים ל-5-mC, הפרוטוקול שלהלן מתאר אסטרטגיה חסכונית לניטור מהיר ויעיל של מתילציה של ציטוזין בתוך עוברים בודדים ושלמים של דגי זברה על ידי מינוף אימונוהיסטוכימיה שלמה (IHC), הדמיה אוטומטית בעלת תוכן גבוה ועיבוד נתונים יעיל באמצעות שפת תכנות לפני ניתוח סטטיסטי.
למיטב ידיעתו, שיטה זו היא הראשונה לניטור 5-mC בתוך עוברים שלמים של דגי זברה. השיטה מאפשרת זיהוי של מתילציה של דנ"א בתוך מסת התא ויש לה גם את היכולת לזהות מתילציה של ציטוזין של mRNA אימהי מקומי חלמון במהלך המעבר האימהי לזיגוטי. באופן כללי, שיטה זו תהיה שימושית לזיהוי מהיר של כימיקלים שיש להם פוטנציאל לשבש מתילציה של ציטוזין באתרה במהלך תכנות מחדש אפיגנטי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>540225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-&#181;L glass microcapillary pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>211762B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08757100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL pipette&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13690032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250-mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB501250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-mL pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13690033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm glass petri dishes with lids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08747A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP67110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1110016SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-tank breeding traps</td>
			<td>Aquatic Habitats</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.&#160; Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunochemistry (IHC) basket</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaXpress 6.0.3.1658&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2140115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-5-mC antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MABE146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50998290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1337412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18612139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1368050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>RStudio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3772-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-controlled incubator&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PR505755L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos

מתילציה של ציטוזין נשמרת מאוד בין מיני בעלי חוליות, וכגורם מפתח לתכנות אפיגנטי ולמצב הכרומטין, יש תפקיד קריטי בהתפתחות העוברית המוקדמת. שינויים אנזימטיים מניעים מתילציה פעילה ודה-מתילציה של ציטוזין ל-5-מתיל-ציטוזין (5-mC) ולאחר מכן חמצון של 5-mC ל-5-הידרוקסי-מתיל-ציטוזין, 5-פורמילציטוזין ו-5-קרבוקסילציטוזין. תכנות מחדש אפיגנטי הוא תקופה קריטית במהלך התפתחות הרחם , ולחשיפה אימהית לכימיקלים יש פוטנציאל לתכנת מחדש את האפיגנום בתוך הצאצאים. זה עלול לגרום לתוצאות שליליות כגון השלכות פנוטיפיות מיידיות, השפעות ארוכות טווח על רגישות למחלות מבוגרים והשפעות טרנס-דוריות של סימנים אפיגנטיים תורשתיים. למרות שריצוף מבוסס ביסולפיט מאפשר לחוקרים לחקור מתילציה של ציטוזין ברזולוציית זוג בסיסים, גישות מבוססות ריצוף הן בעלות גבוהה, וככאלה, מונעות את היכולת לנטר מתילציה של ציטוזין בשלבי התפתחות, ריכוזים מרובים לכל כימיקל, ולשכפל עוברים לכל טיפול. בשל הקלות של הדמיית in vivo אוטומטית, מניפולציות גנטיות, זמן התפתחות מהיר של רחם לשעבר , וגידול במהלך העוברים, עוברי דגי זברה ממשיכים לשמש כמודל שלם מבחינה פיזיולוגית לחשיפת מסלולים בתיווך קסנוביוטי התורמים לתוצאות שליליות במהלך ההתפתחות העוברית המוקדמת. לכן, תוך שימוש בנוגדנים ספציפיים ל-5 mC הזמינים מסחרית, אנו מתארים אסטרטגיה חסכונית לניטור מהיר ויעיל של מתילציה של ציטוזין בתוך עוברי דגי זברה בודדים ושלמים על ידי מינוף אימונוהיסטוכימיה שלמה, הדמיה אוטומטית בעלת תוכן גבוה ועיבוד נתונים יעיל באמצעות שפת תכנות לפני ניתוח סטטיסטי. למיטב ידיעתו, שיטה זו היא הראשונה לזהות ולכמת בהצלחה רמות של 5-mC באתרם בתוך עוברי דגי זברה במהלך ההתפתחות המוקדמת. השיטה מאפשרת זיהוי של מתילציה של דנ"א בתוך מסת התא ויש לה גם את היכולת לזהות מתילציה של ציטוזין של mRNA אימהי מקומי חלמון במהלך המעבר האימהי לזיגוטי. באופן כללי, שיטה זו תהיה שימושית לזיהוי מהיר של כימיקלים שיש להם פוטנציאל לשבש מתילציה של ציטוזין באתרה במהלך תכנות מחדש אפיגנטי.

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לקבוע אם טיפול משפיע על השפע היחסי של 5-mC על ידי הערכת השטח הכולל והעוצמה היחסית של פלואורסצנטיות בתוך עוברים קבועים ומסומנים של דגי זברה. לאחר השלמת הפרוטוקול, ניתן להשתמש בסטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לקבוע תחילה אם IHC השלם היה מוצלח. כאשר עוברים מסומני...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos at JoVE.com

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

מאמר זה מתאר פרוטוקול לניטור מהיר ויעיל של מתילציה תקינה וחריגה של ציטוזין בתוך עוברי דגי זברה שלמים.

ניטור מרחבי-טמפורלי מהיר ויעיל של מתילציה תקינה וחריגה של ציטוזין בתוך עוברים שלמים של דגי זברה

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

פרוטוקול זה מציע שיטה מהירה יחסית וחסכונית, כמו גם רכישה וניתוח אוטומטיים ובכך מייצר סינון ברגישות נמוכה של 5-מתילציטוזין שהוא סמן ביולוגי אפיגנטי נפוץ. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא בגמישות שהיא מציעה עיצוב ניסיוני שמשתמשים יכולים לייעל למודל שלהם ולשלב הפיתוח. ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לזהות כיצד חשיפה כימית משנה את השפע היחסי של 5-מתילציטוזין בתוך אורגניזם מתפתח, שבדרך כלל ניתן היה לעשות זאת רק באמצעות שיטות יקרות של trpA גבוה כגון ריצוף.שיטה זו שימושית לכל מחקר שמטרתו להשתמש בשיטות NCG כדי להבין שינויים אפיגנטיים של 5-מתילציטוזין בתגובה לגירויים סביבתיים. התחילו בהכנת פתרון חשיפה חדש בבוקר האיסוף. הוסיפו חמישה מיליליטר של מי מערכת נטולי חלקיקים לצלחת פטרי זכוכית בקוטר 60 מילימטר.לאחר מכן השתמש בפיפטה זכוכית מיקרו נימי של 10 מיקרוליטר כדי להעביר 10 מיקרוליטרים של דימתיל סולפוקסיד או תמיסת מלאי כימית למי המערכת. סובבו את צלחת הפטרי מזכוכית כדי להבטיח שתמיסת המלאי תתפוגג. מוסיפים עוד חמישה מיליליטר של מי מערכת לצלחת פטרי הזכוכית ומערבבים את המנה כדי להפוך את תמיסת החשיפה להומוגנית.מכסים את כלי הזכוכית במכסי זכוכית כדי למזער את האידוי. לאחר מכן, השתמש בבקבוק שפריץ מלא במים RO כדי להעביר את העוברים מרשת הדגים לצלחת של 100 מילימטר. מיין באופן אקראי 50 עוברים חיים בשעה 0.75 שעות לאחר ההפריה והסר עודפי מים RO.לאחר שמשך החשיפה הסתיים, הוציאו את העוברים מהאינקובטור. העבירו את כל העוברים החיים לצינור מיקרו-צנטריפוגה בקוטר 1.5 מיליליטר. שאפו פתרון חשיפה שיורי מבלי לשאוף לעוברים כלשהם.מוסיפים 500 מיקרוליטרים של 4% paraformaldehyde מקורר ומערבבים את העוברים על ידי היפוך מספר פעמים. אפשרו לעוברים לקבע ו-4% פרפורמלדהיד למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. לאחר תיקון העוברים שואפים את 4% paraformaldehyde, regrabs את העוברים ב 1X PBS, ומערבבים על ידי pipetting עדין במשך 30 שניות.באמצעות פיפטה מזכוכית, העבירו בזהירות עוברים קבועים לצלחת זכוכית מלאה במים של RO. יש לסובב בעדינות במשך 30 שניות ולחזור על הכביסה פעם אחת. תחת מיקרוסקופ סטריאו שנקבע בהגדלה של פי חמישה העוברים באמצעות מחטי מזרק.בעזרת קצה המחט, מנקבים את הכוריון ומקלפים אותו בעדינות הרחק מהחלמון וממסת התא. לאחר שהעוברים עוצבו, השתמשו בפיפטה מיקרו נימי זכוכית כדי להעביר עד 25 עוברים שלמים לסל אימונוהיסטוכימיה אחד. הכניסו את סלסלת IHC לצלחת של 24 בארות.ואז לשאוף את המים מכל באר. להשעות את העוברים ב 500 microliters של חוצץ חוסם לכל באר, לעטוף את הצלחת עם paraform ונייר אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור. דגרו את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס במשך ארבע שעות על שייקר מסלולי ב-100 סל"ד.לאחר הדגירה, שאפו את המאגר החוסם מכל באר. החלף אותו עם 500 microliters של פתרון נוגדנים ראשוני. זכור לדגור תת-קבוצה של עוברי בקרת רכב עם המאגר החוסם כדי לקחת בחשבון רעשי רקע.יש לעטוף מחדש את הצלחת ואת רדיד האלומיניום ולאפשר לצלחת לדגור בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה על שייקר מסלולי. למחרת הסר את תמיסת הנוגדנים העיקרית מכל באר והחלף אותה ב- PBST אחד. יש לשטוף כל באר שלוש פעמים עם PBST אחד במשך חמש דקות לכל שטיפה על שייקר מסלולי.שאפו 1x PBST מכל באר והניחו את סל ה- IHC בצלחת פטרי זכוכית מלאה במי RO. תחת מיקרוסקופ סטריאו סטנדרטי מיין באופן אקראי עוברים שלמים לצלחת של 96 באר המבטיחה עובר אחד לכל באר. לאחר מכן הסר את כל מי RO מבארות בודדות והוסף 200 מיקרוליטר של 1x PBS.צנטריפוגה של הצלחת במשך שלוש דקות ב- G.Image אחד את העוברים עם מטרה כפולה תחת אור מועבר ו- FITC. בחר מיקוד אוטומטי כדי להבטיח שהמיקוד של המצלמה נמצא בתחתית הלוח ומוסט על ידי העובי התחתון. בחר אורך גל FITC עם משך חשיפה של 100 אלפיות השנייה והגדר את המיקוד האוטומטי ללייזר עם היסט Z.שימו לב ואשרו רכישת תמונה נכונה ומספר בארות לפני תחילת רכישת הלוחות. לאחר רכישת התמונה, בצע ניתוח נתונים באמצעות מערכת סינון התוכן הגבוהה והליך ניתוח תמונה אוטומטי מותאם אישית. בחר כל עובר על לוח 96 הבאר כדי לנתח את השטח הכולל ואת עוצמת הפלואורסצנציה המשולבת.לאחר מכן טבל את נקודות הנתונים וייצא אותן ממערכת סינון התוכן הגבוהה על ידי מעבר למדידה ובחירה ביומן נתונים פתוח כדי לייצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני. העלה את הגיליון האלקטרוני המיוצא לחבילת הפריסה כדי למיין ולסכם נתונים עבור כל באר ולסנן לפי מספר באר. לאחר מכן השתמש בחבילת Excel הנכונה כדי לייצא את הנתונים המסוכמים לגיליון אלקטרוני.ההתפלגות והעוצמה המשולבת של 5-מתילציטוזין באזור הכולל הספציפי הוערכו עבור עוברי דגי זברה בשש שעות לאחר ההפריה. ציר ה-x מציג חשיפה ל-DMSO כרכב או ל-TDCIPP כבקרה החיובית. ציר ה-Y מציין פלואורסצנטיות יחסית.ערכי הסף היו שונים באופן משמעותי מהעוברים שטופלו ברכב כפי שמוצג על ידי השטח הכולל של 5-מתילציטוזין שזוהה בתוך העוברים והעוצמה המשולבת באותו אזור המצביעה על יחס אות מרבי לרעש. חשוב מאוד לשמור על שלמות העול ומסת התא לצורך זיהוי IHC תקין. שיטה זו היא חסרת רגישות יחסית ומציעה רק שפע יחסי של נתוני RFU.אם נדרש כימות ניתן להמשיך בגישה ממוקדת יותר.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

בידוד ואפיון של תאים בודדים מעוברים דג הזברה

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

הדור של Parabiotic דג הזברה עוברים ידי Fusion כירורגי של פיתוח Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

איתור תיוג זיקה של אנדוגני רצפטורים מעוברים דג הזברה

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing מוטורית נוירון פוטנציאל ממברנה עוברי דג הזברה חיים

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

אינדוקציה של היפוקסיה צפרדע חיה דג הזברה עוברי

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Photoconversion תא בודד בהמחיה שלם דג זברה

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

ויזואליזציה של הפעילות החשמלית הסלולר עוברי מוקדם דג זברה, גידולים

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

ביטוי מהיר ויעיל של חלבונים מרובים בעוברי העופות באמצעות mRNA אלקטרופורציה

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

כל הר אימונוהיסטוכימיה בזיבפיש עוברים וזחלים

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

קוונפיקציה של רמות האתנול של עוברי דגים באמצעות כרומטוגרפיה גז החלל הראשי

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...