Name: rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos
Uploaded: 2022-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos at JoVE.com

एसएबी को यूसीआर ग्रेजुएट डिवीजन फैलोशिप, एसएबी को एक एनआरएसए टी 32 प्रशिक्षण कार्यक्रम फैलोशिप (टी 32ईएस 018827), और डीसीवी को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान अनुदान (आर01ईएस027576) और यूएसडीए नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ फूड एंड एग्रीकल्चर हैच प्रोजेक्ट (1009609) द्वारा अनुसंधान सहायता प्रदान की गई थी।

वयस्क प्रजनकों को कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, रिवरसाइड में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) -अनुमोदित पशु उपयोग प्रोटोकॉल (# 20180063) के अनुसार संभाला और इलाज किया गया था।
1. ज़ेब?...

<ol>
	<li>Zhang, H. -. Y., Xiong, J., Qi, B. -. L., Feng, Y. -. Q., Yuan, B. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+existence+of+5-hydroxymethylcytosine+and+5-formylcytosine+in+both+DNA+and+RNA+in+mammals.">The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals.</a> Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+determination+of+the+oxidation+products+of+5-methylcytosine+in+RNA.">Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA.</a> Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).</li><li>Avila-Barnard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tris(1,3-dichloro-2-propyl)+phosphate+disrupts+the+trajectory+of+cytosine+methylation+within+developing+zebrafish+embryos.">Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos.</a> Environmental Research. 211, 113078 (2022).</li><li>Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+zebrafish+embryos+to+reveal+disruptions+in+dorsoventral+patterning.">Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning.</a> Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).</li><li>Vliet, S. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal-to-zygotic+transition+as+a+potential+target+for+niclosamide+during+early+embryogenesis.">Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).</li><li>Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+alterations+in+DNA+methylation+precede+Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced+delays+in+zebrafish+epiboly.">Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly.</a> Environmental Science &amp; Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).</li><li>Dasgupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interplay+among+nuclear+receptor+ligands,+cytosine+methylation,+and+the+metabolome+in+driving+tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced+epiboly+defects+in+zebrafish.">Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish.</a> Environmental Science &amp; Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).</li><li>McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+zebrafish+embryogenesis+is+susceptible+to+developmental+TDCPP+exposure.">Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure.</a> Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).</li><li>Geiman, T. M., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+early+development.">DNA methylation in early development.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).</li><li>Wossidlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming.">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).</li><li>Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation-mediated+epigenetic+control.">DNA methylation-mediated epigenetic control.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).</li><li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy.">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).</li><li>Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cytosine+methylation+at+a+glance.">Mammalian cytosine methylation at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).</li><li>Baylin, S. B., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+exploring+the+cancer+epigenome-biological+and+translational+implications.">A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).</li><li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+chromatin-unraveling+the+tangled+web.">DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web.</a> Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).</li><li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+human+disease.">DNA methylation and human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).</li><li>Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+DNA+methylation+in+mammalian+development+and+disease.">The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).</li><li>Yuan, B. -. F., Feng, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+analysis+of+5-methylcytosine+and+its+oxidation+products.">Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products.</a> Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).</li><li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos.">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li></ol>

इस प्रोटोकॉल के दौरान, कुछ कदम हैं जो महत्वपूर्ण हैं। सबसे पहले, भ्रूण को विघटित करते समय, सुई को भ्रूण / जर्दी थैली / सेल द्रव्यमान के ऊतक से दूर इंगित करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि विकासशील भ्रूण के ये हिस?...

एंजाइमेटिक संशोधन 5-मिथाइलसाइटोसिन (5-एमसी) में साइटोसिन के सक्रिय मिथाइलेशन और डिमिथाइलेशन को चलाते हैं और बाद में 5-एमसी के ऑक्सीकरण को 5-हाइड्रॉक्सीमिथाइलसाइटोसिन, 5-फॉर्मिलसाइटोसिन और 5-कार्बोक्सिलसाइटोसिन 1,2 में करते हैं। ट्राइस (1,3-डाइक्लोरो-2-प्रोपाइल) फॉस्फेट (टीडीसीआईपीपी) संयुक्त राज्य अमेरिका में एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाने वाला लौ रोधी है जिसे पहले प्रारंभिक गैस्ट्रुलेशन (6 एचपीएफ) 3,4,5,6,7,8 के माध्यम से 0.75 घंटे बाद निषेचन (एचपीएफ) से प्रारंभिक भ्रूण के संपर्क में आने के बाद साइटोसिन मिथाइलेशन के प्रक्षेपवक्र को बदलने के लिए प्रदर्शित किया गया है। . कशेरुकियों के भीतर, 5-एमसी और इसके संशोधित डेरिवेटिव प्रारंभिकभ्रूण के विकास को विनियमित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। भ्रूण के निषेचन से माता-पिता के डीएनए का डिमिथाइलेशन शुरू होता है, इसके बाद मातृ एमआरएनए क्षरण, युग्मनज जीनोम सक्रियण और युग्मनज जीनोम 9 का रीमिथाइलेशन होताहै। जैविक रूप से प्रासंगिक प्रक्रियाएं जो साइटोसिन मिथाइलेशन का उपयोग करती हैं, उनमें हिस्टोन संशोधन, ट्रांसक्रिप्शनल मशीनरी की भर्ती, आरएनए मिथाइलेशन, एपिजेनेटिक रीप्रोग्रामिंग और क्रोमैटिन संरचना10,11 का निर्धारण शामिल है। साइटोसिन मिथाइलेशन को कशेरुक प्रजातियों के बीच भी संरक्षित किया जाता है, जो यह समझने और जांच करने के महत्व को रेखांकित करता है कि असामान्य साइटोसिन मिथाइलेशन किसी जीव के विकास के प्रक्षेपवक्र को कैसे प्रभावित कर सकताहै। इसके अलावा, गर्भाशय विकास में मातृ जोखिम के प्रति संवेदनशील होता है और इसमें प्रतिकूल परिणाम पैदा करने की क्षमता होती है जैसे कि तत्काल फेनोटाइपिक परिणाम, वयस्क रोग संवेदनशीलता पर दीर्घकालिक प्रभाव, और विरासत में मिले एपिजेनेटिक अंक 12,13,14 के ट्रांसजेनरेशनल प्रभाव।
साइटोसिन-गुआनिन जोड़े, या सीपीजी द्वीपों के लंबे खंड, जांचकर्ताओं के प्राथमिक केंद्र रहे हैं जिनका उद्देश्य जीनोम 15,16,17 में साइटोसिन मिथाइलेशन की गतिशीलता को चिह्नित करना है। बिसल्फाइट-आधारित रणनीतियां जैसे कि पूरे जीनोम बाइसल्फाइट अनुक्रमण, कम प्रतिनिधित्व बाइसल्फाइट अनुक्रमण, और बिसल्फाइट एम्प्लिकॉन अनुक्रमण बेस-जोड़ी रिज़ॉल्यूशन पर साइटोसिन मिथाइलेशन से पूछताछ के लिए स्वर्ण मानक का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, अनुक्रमण-आधारित दृष्टिकोण लागत-निषेधात्मक हैं और, इस तरह, विकास के चरणों में साइटोसिन मिथाइलेशन की निगरानी करने, प्रति रसायन कई सांद्रता और प्रति उपचार भ्रूण को दोहराने की क्षमता को रोकते हैं। इसके अलावा, अनुक्रमण-आधारित दृष्टिकोण स्थानिक स्थानीयकरण के बारे में जानकारी प्रदान नहीं करते हैं, जो एक विकासशील भ्रूण के भीतर संभावित रूप से प्रभावित सेल प्रकारों और क्षेत्रों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। इसी तरह, मिथाइलेशन-निर्भर प्रतिबंध विश्लेषण, 5-एमसी एंजाइम-लिंक्ड इम्यूनोएसे (ईएलआईएसए), और 5-मिथाइल-2'-डीऑक्सीसाइटिडीन (5-एमसी) तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) जैसे वैश्विक डीएनए मिथाइलेशन परख सेल या ऊतक होमोजेनेट्स पर भरोसा करते हैं और इस तरह, बरकरार नमूनोंके भीतर अंतरिक्ष और समय पर साइटोसिन मिथाइलेशन के स्थानीयकरण और परिमाण की निगरानी करने की क्षमता को रोकते हैं।
भ्रूणजनन के दौरान विवो इमेजिंग, आनुवंशिक जोड़तोड़, तेजी से गर्भाशय विकास समय और पशुपालन में स्वचालित की आसानी के कारण, जेब्राफिश भ्रूण को व्यापक रूप से ज़ेनोबायोटिक-मध्यस्थता मार्गों को उजागर करने के लिए शारीरिक रूप से बरकरार मॉडल के रूप में उपयोग किया जाता है जो प्रारंभिक भ्रूण के विकास के दौरान प्रतिकूल परिणामों में योगदान करते हैं। इसलिए, 5-एमसी के लिए विशिष्ट व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए, नीचे दिया गया प्रोटोकॉल सांख्यिकीय विश्लेषण से पहले प्रोग्रामिंग भाषा का उपयोग करके व्यक्तिगत, बरकरार जेब्राफिश भ्रूण के भीतर साइटोसिन मिथाइलेशन की तेजी से और कुशल स्थानिक निगरानी के लिए एक लागत प्रभावी रणनीति का वर्णन करता है।
वर्तमान ज्ञान के लिए, यह विधि बरकरार ज़ेबराफिश भ्रूण के भीतर 5-एमसी की निगरानी करने वाली पहली है। विधि सेल द्रव्यमान के भीतर डीएनए मिथाइलेशन का पता लगाने में सक्षम बनाती है और मातृ-से-युग्मनज संक्रमण के दौरान जर्दी-स्थानीयकृत मातृ एमआरएनए के साइटोसिन मिथाइलेशन का पता लगाने की क्षमता भी है। कुल मिलाकर, यह विधि उन रसायनों की तेजी से पहचान के लिए उपयोगी होगी जो एपिजेनेटिक रीप्रोग्रामिंग के दौरान सीटू में साइटोसिन मिथाइलेशन को बाधित करने की क्षमता रखते हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>540225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-&#181;L glass microcapillary pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>211762B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08757100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL pipette&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13690032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250-mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB501250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-mL pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13690033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm glass petri dishes with lids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08747A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP67110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1110016SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-tank breeding traps</td>
			<td>Aquatic Habitats</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.&#160; Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunochemistry (IHC) basket</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaXpress 6.0.3.1658&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2140115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-5-mC antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MABE146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50998290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1337412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18612139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1368050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>RStudio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3772-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-controlled incubator&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PR505755L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos

साइटोसिन मिथाइलेशन कशेरुक प्रजातियों में अत्यधिक संरक्षित है और, एपिजेनेटिक प्रोग्रामिंग और क्रोमैटिन स्थिति के एक प्रमुख चालक के रूप में, प्रारंभिक भ्रूण के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। एंजाइमेटिक संशोधन 5-मिथाइलसाइटोसिन (5-एमसी) में साइटोसिन के सक्रिय मिथाइलेशन और डिमिथाइलेशन को चलाते हैं और बाद में 5-एमसी के ऑक्सीकरण को 5-हाइड्रॉक्सीमिथाइलसाइटोसिन, 5-फॉर्मिलसाइटोसिन और 5-कार्बोक्सिलसाइटोसिन में करते हैं। एपिजेनेटिक रीप्रोग्रामिंग गर्भाशय के विकास के दौरान एक महत्वपूर्ण अवधि है, और रसायनों के मातृ संपर्क में संतानों के भीतर एपिजीनोम को पुन: प्रोग्राम करने की क्षमता होती है। यह संभावित रूप से प्रतिकूल परिणामों का कारण बन सकता है जैसे कि तत्काल फेनोटाइपिक परिणाम, वयस्क रोग संवेदनशीलता पर दीर्घकालिक प्रभाव, और विरासत में मिले एपिजेनेटिक निशान के ट्रांसजेनरेशनल प्रभाव। यद्यपि बिसल्फाइट-आधारित अनुक्रमण जांचकर्ताओं को बेस-जोड़ी संकल्प पर साइटोसिन मिथाइलेशन से पूछताछ करने में सक्षम बनाता है, अनुक्रमण-आधारित दृष्टिकोण लागत-निषेधात्मक हैं और इस तरह, विकास चरणों में साइटोसिन मिथाइलेशन की निगरानी करने की क्षमता को रोकते हैं, प्रति रासायनिक कई सांद्रता, और प्रति उपचार भ्रूण को दोहराते हैं। भ्रूणजनन के दौरान विवो इमेजिंग, आनुवंशिक जोड़तोड़, तेजी से गर्भाशय विकास समय और पशुपालन में स्वचालित की आसानी के कारण, जेब्राफिश भ्रूण का उपयोग ज़ेनोबायोटिक-मध्यस्थता मार्गों को उजागर करने के लिए शारीरिक रूप से बरकरार मॉडल के रूप में किया जाता है जो प्रारंभिक भ्रूण के विकास के दौरान प्रतिकूल परिणामों में योगदान करते हैं। इसलिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 5-एमसी-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग करते हुए, हम सांख्यिकीय विश्लेषण से पहले प्रोग्रामिंग भाषा का उपयोग करके व्यक्तिगत, बरकरार जेब्राफिश भ्रूण के भीतर साइटोसिन मिथाइलेशन की तेजी से और कुशल स्थानिक निगरानी के लिए एक लागत प्रभावी रणनीति का वर्णन करते हैं। वर्तमान ज्ञान के लिए, यह विधि प्रारंभिक विकास के दौरान ज़ेब्राफिश भ्रूण के भीतर सीटू में 5-एमसी स्तरों का सफलतापूर्वक पता लगाने और मात्रा निर्धारित करने वाली पहली है। विधि सेल द्रव्यमान के भीतर डीएनए मिथाइलेशन का पता लगाने में सक्षम बनाती है और मातृ-से-युग्मनज संक्रमण के दौरान जर्दी-स्थानीयकृत मातृ एमआरएनए के साइटोसिन मिथाइलेशन का पता लगाने की क्षमता भी है। कुल मिलाकर, यह विधि उन रसायनों की तेजी से पहचान के लिए उपयोगी होगी जो एपिजेनेटिक रीप्रोग्रामिंग के दौरान सीटू में साइटोसिन मिथाइलेशन को बाधित करने की क्षमता रखते हैं।

इस प्रोटोकॉल का समग्र उद्देश्य यह निर्धारित करना है कि क्या एक उपचार निश्चित और लेबल जेब्राफिश भ्रूण के भीतर प्रतिदीप्ति के कुल क्षेत्र और सापेक्ष तीव्रता का आकलन करके 5-एमसी की सापेक्ष बहुतायत को प्र...

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Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

यह पेपर बरकरार जेब्राफिश भ्रूण के भीतर सामान्य और असामान्य साइटोसिन मिथाइलेशन की तेजी से और कुशल स्थानिक निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है।

बरकरार ज़ेबराफिश भ्रूण के भीतर सामान्य और असामान्य साइटोसिन मिथाइलेशन की त्वरित और कुशल स्थानिक निगरानी

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

यह प्रोटोकॉल अपेक्षाकृत तेज और लागत कुशल विधि प्रदान करता है, साथ ही एक स्वचालित अधिग्रहण और विश्लेषण इस प्रकार 5-मिथाइलसाइटोसिन की कम संवेदनशीलता स्क्रीनिंग का उत्पादन करता है जो एक सामान्य एपिजेनेटिक बायोमार्कर है। इस तकनीक का मुख्य लाभ लचीलेपन में है कि यह एक प्रयोगात्मक डिजाइन प्रदान करता है जिसे उपयोगकर्ता अपने मॉडल और विकास के चरण के लिए अनुकूलित कर सकते हैं। इस तकनीक का उपयोग यह पता लगाने के लिए किया जा सकता है कि रासायनिक जोखिम एक विकासशील जीव के भीतर 5-मेथिलसाइटोसिन की सापेक्ष बहुतायत को कैसे बदल देता है जो आम तौर पर केवल अनुक्रमण जैसे महंगे उच्च टीआरपीए विधियों के माध्यम से किया जा सकता है।यह विधि किसी भी शोध के लिए उपयोगी है जिसका उद्देश्य पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के जवाब में 5-मिथाइलसाइटोसिन के एपिजेनेटिक परिवर्तनों को समझने के लिए एनसीजी विधियों का उपयोग करना है। संग्रह की सुबह एक ताजा एक्सपोजर समाधान तैयार करके शुरू करें। 60 मिलीमीटर ग्लास पेट्री डिश में पांच मिलीलीटर पार्टिकुलेट फ्री सिस्टम पानी जोड़ें।फिर सिस्टम पानी में डिमेथिल सल्फोक्साइड या रासायनिक स्टॉक समाधान के 10 माइक्रोलीटर स्थानांतरित करने के लिए 10 माइक्रोलीटर माइक्रोकेशिका ग्लास पिपेट का उपयोग करें। स्टॉक समाधान को समाप्त करने के लिए ग्लास पेट्री डिश को घुमाएं। ग्लास पेट्री डिश में एक और पांच मिलीलीटर सिस्टम पानी जोड़ें और एक्सपोज़र समाधान को समरूप करने के लिए डिश को घुमाएं।वाष्पीकरण को कम करने के लिए कांच के ढक्कन के साथ कांच के व्यंजनों को कैप करें। इसके बाद, मछली के जाल से भ्रूण को 100 मिलीमीटर डिश में स्थानांतरित करने के लिए आरओ पानी से भरी धारा की बोतल का उपयोग करें। निषेचन के बाद 0.75 घंटे में यादृच्छिक रूप से 50 जीवित भ्रूण को क्रमबद्ध करें और अतिरिक्त आरओ पानी को हटा दें।एक्सपोज़र अवधि समाप्त होने के बाद, इनक्यूबेटर से भ्रूण को हटा दें। सभी जीवित भ्रूणों को 1.5 मिलीलीटर माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। किसी भी भ्रूण को एस्पिरेटेड किए बिना एस्पिरेटेड अवशिष्ट जोखिम समाधान।500 माइक्रोलीटर ठंडा 4% पैराफॉर्मलडिहाइड जोड़ें और भ्रूण को कई बार उलटा करके मिलाएं। भ्रूण को ठीक करने और चार डिग्री सेल्सियस पर रात भर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड को ठीक करने दें। भ्रूण को ठीक करने के बाद 4% पैराफॉर्मलडिहाइड को एस्पिरेट करें, भ्रूण को 1 एक्स पीबीएस में फिर से चार्ज करें, और 30 सेकंड के लिए सौम्य पिपेटिंग द्वारा मिलाएं।ग्लास पिपेट का उपयोग करके, निश्चित भ्रूण को आरओ पानी से भरे ग्लास डिश में सावधानीपूर्वक स्थानांतरित करें। धीरे से 30 सेकंड के लिए घुमाएं और इस धोने को एक बार दोहराएं। पांच गुना आवर्धन पर सेट स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत सिरिंज सुइयों का उपयोग करके भ्रूण को डीकोरेट करें।सुई की नोक का उपयोग करके, कोरियन को पंचर करें और धीरे से इसे जर्दी और सेल द्रव्यमान से दूर छील लें। भ्रूण को डीकोरेट करने के बाद, एक इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री टोकरी में 25 बरकरार भ्रूण तक स्थानांतरित करने के लिए ग्लास माइक्रो केशिका पिपेट का उपयोग करें। आईएचसी टोकरी को 24 वेल प्लेट में रखें।फिर प्रत्येक कुएं से पानी को बाहर निकालें। भ्रूण को प्रति कुएं अवरुद्ध बफर के 500 माइक्रोलीटर में पुन: निलंबित करें, प्लेट को प्रकाश से बचाने के लिए पैराफॉर्म और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ लपेटें। प्लेट को 100 आरपीएम पर ऑर्बिटल शेकर पर चार घंटे के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।इनक्यूबेशन के बाद, प्रत्येक कुएं से ब्लॉकिंग बफर को एस्पिरेट करें। इसे प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 500 माइक्रोलीटर के साथ बदलें। पृष्ठभूमि शोर के लिए ब्लॉकिंग बफर के साथ वाहन नियंत्रण भ्रूण के एक उप-समूह को इनक्यूबेट करना याद रखें।प्लेट और पैराफॉर्म और एल्यूमीनियम पन्नी को फिर से लपेटें और प्लेट को कक्षीय शेकर पर रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करने की अनुमति दें। अगले दिन प्रत्येक कुएं से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को हटा दें और इसे 1x PBST के साथ बदलें। कक्षीय शेकर पर प्रति धोने के लिए पांच मिनट के लिए 1x PBST के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से तीन बार धोएं।प्रत्येक कुएं से एस्पिरेटेड 1x PBST और IHC टोकरी को आरओ पानी से भरे ग्लास पेट्री डिश में रखें। एक मानक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत यादृच्छिक रूप से बरकरार भ्रूण को 96 वेल प्लेट में क्रमबद्ध करें जो प्रति कुएं एक भ्रूण सुनिश्चित करता है। फिर अलग-अलग कुओं से सभी आरओ पानी निकालें और 1x PBS के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें।एक जी पर तीन मिनट के लिए प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें. संचारित प्रकाश और एफआईटीसी के तहत दो गुना उद्देश्य के साथ भ्रूण की छवि। यह सुनिश्चित करने के लिए ऑटोफोकस का चयन करें कि कैमरे का फोकस प्लेट के निचले हिस्से पर है और नीचे की मोटाई से ऑफसेट है। 100 मिलीसेकंड की एक्सपोजर अवधि के साथ एफआईटीसी तरंगदैर्ध्य का चयन करें और जेड ऑफसेट के साथ लेजर पर ऑटो फोकस सेट करें।प्लेट अधिग्रहण शुरू करने से पहले उचित छवि अधिग्रहण और कई कुओं का निरीक्षण और पुष्टि करें। छवि अधिग्रहण के बाद, उच्च सामग्री स्क्रीनिंग सिस्टम और एक कस्टम स्वचालित छवि विश्लेषण प्रक्रिया का उपयोग करके डेटा विश्लेषण करें। प्रतिदीप्ति के कुल क्षेत्र और एकीकृत तीव्रता के लिए विश्लेषण किए जाने के लिए 96 वेल प्लेट पर प्रत्येक भ्रूण का चयन करें।फिर डेटा बिंदुओं को सारणीबद्ध करें और डेटा को स्प्रेडशीट में निर्यात करने के लिए खुले डेटा लॉग को मापने और चयन करके उन्हें उच्च सामग्री स्क्रीनिंग सिस्टम से निर्यात करें। प्रत्येक कुएं के लिए डेटा को सॉर्ट और सारांशित करने और अच्छी संख्या से फ़िल्टर करने के लिए डिप्लॉयर पैकेज पर निर्यात की गई स्प्रेडशीट अपलोड करें। फिर किसी स्प्रेडशीट में समामेलित डेटा निर्यात करने के लिए सही Excel पैकेज़ का उपयोग करें.निषेचन के छह घंटे बाद ज़ेबराफिश भ्रूण के लिए 5-मेथिलसाइटोसिन विशिष्ट कुल क्षेत्र के वितरण और एकीकृत तीव्रता का आकलन किया गया था। एक्स-अक्ष एक वाहन के रूप में डीएमएसओ या सकारात्मक नियंत्रण के रूप में टीडीसीआईपीपी के संपर्क को दर्शाता है। वाई-अक्ष सापेक्ष प्रतिदीप्ति को दर्शाता है।थ्रेसहोल्ड वाहन उपचारित भ्रूण से काफी अलग थे जैसा कि भ्रूण के भीतर पाए गए 5-मेथिलसाइटोसिन के कुल क्षेत्र और उसी क्षेत्र के भीतर एकीकृत तीव्रता से पता चलता है जो शोर अनुपात के लिए अधिकतम संकेत का संकेत देता है। उचित आईएचसी का पता लगाने के लिए जूए और सेल द्रव्यमान की अखंडता को बनाए रखना बेहद महत्वपूर्ण है। यह विधि अपेक्षाकृत असंवेदनशील है और केवल सापेक्ष बहुतायत आरएफयू डेटा प्रदान करती है।यदि परिमाणीकरण की आवश्यकता है तो कोई अधिक लक्षित दृष्टिकोण के साथ पालन कर सकता है।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

अलगाव और zebrafish भ्रूण से एकल कक्ष की विशेषता

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Blastulae विकास के सर्जिकल फ्यूजन द्वारा Parabiotic zebrafish भ्रूण की जनरेशन

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Zebrafish भ्रूण से अंतर्जात रिसेप्टर्स की आत्मीयता लेबल जांच

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

जीवित जेबराफिश भ्रूण में बायोसेंसिंग मोटर न्यूरॉन झिल्ली संभावित

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

रहने वाले मेंढक और ज़ेबराफिश भ्रूण में हाइपोक्सिया का प्रेरण

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

सिंगल सेल Photoconversion में रह Zebrafish बरकरार

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Zebrafish जल्दी भ्रूण और ट्यूमर में सेलुलर विद्युत गतिविधि के दृश्य

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

एवियन भ्रूण में कई प्रोटीन की तेजी से और कुशल अभिव्यक्ति MRNA इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

जेब्राफिश भ्रूण और लार्वा में पूरे माउंट इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

हेड स्पेस गैस क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करके जेब्राफिश भ्रूण में इथेनॉल के स्तर का परिमाणीकरण

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...