Name: rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos
Uploaded: 2022-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos at JoVE.com

Il supporto alla ricerca è stato fornito da una UCR Graduate Division Fellowship a SAB, una NRSA T32 Training Program Fellowship (T32ES018827) a SAB e una sovvenzione del National Institutes of Health (R01ES027576) e USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) a DCV.

Gli allevatori adulti sono stati gestiti e trattati in conformità con un protocollo di utilizzo degli animali approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (# 20180063) presso l'Università della California, Riverside.
1. Raccolta di embrioni di zebrafish ed esposizione chimica
<ol><li>Aggiungi trappole da riproduzione in vasca alle vasche contenenti pesci zebra maschi e femmine adulti sessualmente maturi e riproduttivamente vitali. Aggiungere almeno tr...

<ol>
	<li>Zhang, H. -. Y., Xiong, J., Qi, B. -. L., Feng, Y. -. Q., Yuan, B. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+existence+of+5-hydroxymethylcytosine+and+5-formylcytosine+in+both+DNA+and+RNA+in+mammals.">The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals.</a> Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+determination+of+the+oxidation+products+of+5-methylcytosine+in+RNA.">Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA.</a> Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).</li><li>Avila-Barnard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tris(1,3-dichloro-2-propyl)+phosphate+disrupts+the+trajectory+of+cytosine+methylation+within+developing+zebrafish+embryos.">Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos.</a> Environmental Research. 211, 113078 (2022).</li><li>Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+zebrafish+embryos+to+reveal+disruptions+in+dorsoventral+patterning.">Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning.</a> Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).</li><li>Vliet, S. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal-to-zygotic+transition+as+a+potential+target+for+niclosamide+during+early+embryogenesis.">Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).</li><li>Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+alterations+in+DNA+methylation+precede+Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced+delays+in+zebrafish+epiboly.">Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly.</a> Environmental Science &amp; Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).</li><li>Dasgupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interplay+among+nuclear+receptor+ligands,+cytosine+methylation,+and+the+metabolome+in+driving+tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced+epiboly+defects+in+zebrafish.">Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish.</a> Environmental Science &amp; Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).</li><li>McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+zebrafish+embryogenesis+is+susceptible+to+developmental+TDCPP+exposure.">Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure.</a> Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).</li><li>Geiman, T. M., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+early+development.">DNA methylation in early development.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).</li><li>Wossidlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming.">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).</li><li>Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation-mediated+epigenetic+control.">DNA methylation-mediated epigenetic control.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).</li><li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy.">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).</li><li>Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cytosine+methylation+at+a+glance.">Mammalian cytosine methylation at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).</li><li>Baylin, S. B., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+exploring+the+cancer+epigenome-biological+and+translational+implications.">A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).</li><li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+chromatin-unraveling+the+tangled+web.">DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web.</a> Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).</li><li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+human+disease.">DNA methylation and human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).</li><li>Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+DNA+methylation+in+mammalian+development+and+disease.">The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).</li><li>Yuan, B. -. F., Feng, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+analysis+of+5-methylcytosine+and+its+oxidation+products.">Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products.</a> Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).</li><li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos.">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li></ol>

Durante questo protocollo, ci sono alcuni passaggi che sono critici. In primo luogo, quando si dechorionano gli embrioni, è importante puntare l'ago lontano dal tessuto dell'embrione / sacco vitellino / massa cellulare, poiché queste porzioni dell'embrione in via di sviluppo sono molto fragili e facili da perforare. In secondo luogo, quando si trasferiscono embrioni marcati a singoli pozzetti, utilizzare una pipetta di vetro per trasferire gli embrioni in quanto aderiranno a una pipetta di plastica. In terzo luogo, qua...

Le modifiche enzimatiche guidano la metilazione attiva e la demetilazione della citosina in 5-metilcitosina (5-mC) e la successiva ossidazione di 5-mC in 5-idrossimetilcitosina, 5-formilcitosina e 5-carbossilcitosina 1,2. Il tris(1,3-dicloro-2-propil) fosfato (TDCIPP) è un ritardante di fiamma ampiamente utilizzato negli Stati Uniti che ha precedentemente dimostrato di alterare la traiettoria della metilazione della citosina dopo l'esposizione embrionale precoce da 0,75 ore dopo la fecondazione (hpf) fino alla gastrulazione precoce (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . All'interno dei vertebrati, il 5-mC e i suoi derivati modificati sono fondamentali per regolare lo sviluppo embrionale precoce9. La fecondazione di un embrione innesca la demetilazione del DNA parentale, seguita dalla degradazione dell'mRNA materno, dall'attivazione del genoma zigotico e dalla rimetilazione del genoma zigotico9. I processi biologicamente rilevanti che utilizzano la metilazione della citosina includono la modificazione degli istoni, il reclutamento del macchinario trascrizionale, la metilazione dell'RNA, la riprogrammazione epigenetica e la determinazione della struttura della cromatina10,11. La metilazione della citosina è conservata anche tra le specie di vertebrati, sottolineando l'importanza di comprendere e studiare come la metilazione aberrante della citosina possa influenzare la traiettoria di sviluppo di un organismo11. Inoltre, lo sviluppo in utero è sensibile all'esposizione materna e ha il potenziale di causare esiti avversi come conseguenze fenotipiche immediate, effetti a lungo termine sulla suscettibilità alle malattie negli adulti ed effetti transgenerazionali dei segni epigenetici ereditari12,13,14.
Lunghi tratti di coppie citosina-guanina, o isole CpG, sono stati i principali focolai dei ricercatori che mirano a caratterizzare la dinamica della metilazione della citosina attraverso il genoma15,16,17. Le strategie basate sul bisolfito come il sequenziamento del bisolfito dell'intero genoma, il sequenziamento del bisolfito a rappresentazione ridotta e il sequenziamento dell'amplicone del bisolfito rappresentano il gold standard per interrogare la metilazione della citosina alla risoluzione della coppia di basi. Tuttavia, gli approcci basati sul sequenziamento sono proibitivi in termini di costi e, in quanto tali, precludono la capacità di monitorare la metilazione della citosina attraverso le fasi di sviluppo, concentrazioni multiple per sostanza chimica e replicare gli embrioni per trattamento. Inoltre, gli approcci basati sul sequenziamento non forniscono informazioni sulla localizzazione spaziale, che è fondamentale per comprendere i tipi di cellule potenzialmente interessate e le aree all'interno di un embrione in via di sviluppo. Allo stesso modo, i saggi globali di metilazione del DNA come l'analisi di restrizione dipendente dalla metilazione, i saggi immunologici legati all'enzima 5-mC (ELISA) e la cromatografia-spettrometria di massa liquida (LC-MS) 5-metil-2'-deossicitidina (5-mC) si basano su omogenati cellulari o tissutali e, come tali, precludono la capacità di monitorare la localizzazione e l'entità della metilazione della citosina nello spazio e nel tempo all'interno di campioni intatti12,18.
A causa della facilità dell'imaging automatizzato in vivo , delle manipolazioni genetiche, del rapido tempo di sviluppo ex utero e dell'allevamento durante l'embriogenesi, gli embrioni di zebrafish continuano ad essere ampiamente utilizzati come modelli fisiologicamente intatti per scoprire percorsi mediati da xenobiotici che contribuiscono a esiti avversi durante lo sviluppo embrionale precoce. Pertanto, utilizzando anticorpi disponibili in commercio specifici per 5-mC, il protocollo seguente descrive una strategia economica per un monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina all'interno di singoli embrioni intatti di zebrafish sfruttando l'immunoistochimica a montaggio intero (IHC), l'imaging automatizzato ad alto contenuto e l'elaborazione efficiente dei dati utilizzando il linguaggio di programmazione prima dell'analisi statistica.
Secondo le conoscenze attuali, questo metodo è il primo a monitorare 5-mC all'interno di embrioni di zebrafish intatti. Il metodo consente la rilevazione della metilazione del DNA all'interno della massa cellulare e ha anche la capacità di rilevare la metilazione della citosina degli mRNA materni localizzati nel tuorlo durante la transizione da madre a zigotica. Nel complesso, questo metodo sarà utile per la rapida identificazione di sostanze chimiche che hanno il potenziale di interrompere la metilazione della citosina in situ durante la riprogrammazione epigenetica.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>540225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-&#181;L glass microcapillary pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>211762B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08757100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL pipette&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13690032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250-mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB501250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-mL pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13690033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm glass petri dishes with lids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08747A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP67110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1110016SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-tank breeding traps</td>
			<td>Aquatic Habitats</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.&#160; Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunochemistry (IHC) basket</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaXpress 6.0.3.1658&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2140115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-5-mC antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MABE146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50998290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1337412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18612139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1368050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>RStudio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3772-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-controlled incubator&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PR505755L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos

La metilazione della citosina è altamente conservata tra le specie di vertebrati e, come fattore chiave della programmazione epigenetica e dello stato della cromatina, svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo embrionale precoce. Le modifiche enzimatiche guidano la metilazione attiva e la demetilazione della citosina in 5-metilcitosina (5-mC) e la successiva ossidazione di 5-mC in 5-idrossimetilcitosina, 5-formilcitosina e 5-carbossilcitosina. La riprogrammazione epigenetica è un periodo critico durante lo sviluppo in utero e l'esposizione materna a sostanze chimiche ha il potenziale per riprogrammare l'epigenoma all'interno della prole. Ciò può potenzialmente causare esiti avversi come conseguenze fenotipiche immediate, effetti a lungo termine sulla suscettibilità alle malattie negli adulti ed effetti transgenerazionali dei segni epigenetici ereditari. Sebbene il sequenziamento basato sulla bisolfito consenta ai ricercatori di interrogare la metilazione della citosina alla risoluzione della coppia di basi, gli approcci basati sul sequenziamento sono proibitivi in termini di costi e, come tali, precludono la capacità di monitorare la metilazione della citosina attraverso le fasi di sviluppo, concentrazioni multiple per sostanza chimica e replicare gli embrioni per trattamento. A causa della facilità dell'imaging automatizzato in vivo , delle manipolazioni genetiche, del rapido tempo di sviluppo ex utero e dell'allevamento durante l'embriogenesi, gli embrioni di zebrafish continuano ad essere utilizzati come modello fisiologicamente intatto per scoprire percorsi xenobiotici mediati che contribuiscono a esiti avversi durante lo sviluppo embrionale precoce. Pertanto, utilizzando anticorpi specifici per 5 mC disponibili in commercio, descriviamo una strategia economica per un monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina all'interno di singoli embrioni intatti di zebrafish sfruttando l'immunoistochimica a montaggio intero, l'imaging automatizzato ad alto contenuto e l'elaborazione efficiente dei dati utilizzando il linguaggio di programmazione prima dell'analisi statistica. Secondo le conoscenze attuali, questo metodo è il primo a rilevare e quantificare con successo i livelli di 5-mC in situ all'interno degli embrioni di zebrafish durante lo sviluppo iniziale. Il metodo consente la rilevazione della metilazione del DNA all'interno della massa cellulare e ha anche la capacità di rilevare la metilazione della citosina degli mRNA materni localizzati nel tuorlo durante la transizione da madre a zigotica. Nel complesso, questo metodo sarà utile per la rapida identificazione di sostanze chimiche che hanno il potenziale di interrompere la metilazione della citosina in situ durante la riprogrammazione epigenetica.

Lo scopo generale di questo protocollo è determinare se un trattamento influisce sull'abbondanza relativa di 5-mC valutando l'area totale e l'intensità relativa della fluorescenza all'interno di embrioni di zebrafish fissi ed etichettati. Dopo aver completato il protocollo, è possibile utilizzare uno stereomicroscopio a fluorescenza per determinare innanzitutto se l'IHC a montaggio completo ha avuto successo. Quando gli embrioni marcati sono osservati sotto un filtro FITC o GFP, un risultato positivo è indicato da un...

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Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Questo articolo descrive un protocollo per il monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina normale e aberrante all'interno di embrioni intatti di zebrafish.

Monitoraggio spaziotemporale rapido ed efficiente della metilazione della citosina normale e aberrante all'interno di embrioni di zebrafish intatti

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

Questo protocollo offre un metodo relativamente rapido ed economico, nonché un'acquisizione e un'analisi automatizzate, producendo così uno screening a bassa sensibilità della 5-metilcitosina, che è un biomarcatore epigenetico comune. Il vantaggio principale di questa tecnica è la flessibilità che offre un design sperimentale che gli utenti possono ottimizzare per il loro modello e fase di sviluppo. Questa tecnica può essere utilizzata per rilevare come l'esposizione chimica altera l'abbondanza relativa di 5-metilcitosina all'interno di un organismo in via di sviluppo che normalmente potrebbe essere fatto solo attraverso costosi metodi ad alto trpA come il sequenziamento.Questo metodo è utile per qualsiasi ricerca che mira ad utilizzare metodi NCG per comprendere le alterazioni epigenetiche della 5-metilcitosina in risposta a stimoli ambientali. Inizia preparando una nuova soluzione di esposizione la mattina della raccolta. Aggiungere cinque millilitri di acqua di sistema priva di particelle a una capsula di Petri di vetro da 60 millimetri.Quindi utilizzare una pipetta di vetro micro capillare da 10 micro litri per trasferire 10 microlitri di dimetilsolfossido o soluzione madre chimica all'acqua del sistema. Ruotare la capsula di Petri di vetro per assicurarsi che la soluzione madre si dissolva. Aggiungere altri cinque millilitri di acqua di sistema alla capsula di Petri di vetro e ruotare il piatto per omogeneizzare la soluzione di esposizione.Tappare i piatti di vetro con coperchi di vetro per ridurre al minimo l'evaporazione. Quindi, utilizzare una bottiglia di spruzzo riempita d'acqua RO per trasferire gli embrioni dalla rete da pesce in un piatto da 100 millimetri. Ordinare in modo casuale 50 embrioni vivi a 0,75 ore dopo la fecondazione e rimuovere l'acqua RO in eccesso.Al termine della durata dell'esposizione, rimuovere gli embrioni dall'incubatrice. Trasferire tutti gli embrioni viventi in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aspirare la soluzione di esposizione residua senza aspirare embrioni.Aggiungere 500 microlitri di paraformaldeide refrigerata al 4% e mescolare gli embrioni per inversione più volte. Lasciare che gli embrioni si fissino e il 4% di paraformaldeide durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo aver fissato gli embrioni, aspirare il 4% di paraformaldeide, rispendere gli embrioni in 1X PBS e mescolare con un pipettaggio delicato per 30 secondi.Utilizzando una pipetta di vetro, trasferire con cura gli embrioni fissi in un piatto di vetro riempito d'acqua RO. Agitare delicatamente per 30 secondi e ripetere il lavaggio una volta. Sotto uno stereomicroscopio impostato a cinque volte l'ingrandimento decorenare gli embrioni usando aghi da siringa.Usando la punta dell'ago, forare il corion e staccarlo delicatamente dal tuorlo e dalla massa cellulare. Dopo che gli embrioni sono stati decorati, utilizzare una pipetta micro capillare di vetro per trasferire fino a 25 embrioni intatti in un cesto di immunoistochimica. Posizionare il cestello IHC in una piastra da 24 pozzetti.Quindi aspirare l'acqua da ciascun pozzo. Risospendere gli embrioni in 500 microlitri di tampone bloccante per pozzetto, avvolgere la piastra con paraform e foglio di alluminio per proteggerla dalla luce. Incubare la piastra a quattro gradi Celsius per quattro ore su uno shaker orbitale a 100 giri / min.Dopo l'incubazione, aspirare il tampone bloccante da ciascun pozzetto. Sostituirlo con 500 microlitri di soluzione anticorpale primaria. Ricordarsi di incubare un sottoinsieme di embrioni di controllo del veicolo con il buffer di blocco per tenere conto del rumore di fondo.Riavvolgere la piastra e la paraforma e il foglio di alluminio e lasciare che la piastra incubi a quattro gradi Celsius durante la notte su uno shaker orbitale. Il giorno seguente rimuovere la soluzione anticorpale primaria da ciascun pozzetto e sostituirla con 1x PBST. Lavare ogni pozzetto tre volte con 1x PBST per cinque minuti per lavaggio su uno shaker orbitale.Aspirare 1x PBST da ciascun pozzetto e posizionare il cestello IHC in una capsula di Petri di vetro riempita con acqua RO. Sotto un microscopio stereoscopico standard ordina casualmente gli embrioni intatti in una piastra da 96 pozzetti assicurando un embrione per pozzetto. Quindi rimuovere tutta l'acqua RO dai singoli pozzetti e aggiungere 200 microlitri di 1x PBS.Centrifugare la piastra per tre minuti in un G.Immagine gli embrioni con un obiettivo due volte sotto luce trasmessa e FITC. Selezionare la messa a fuoco automatica per assicurarsi che la messa a fuoco della fotocamera sia sul fondo della lastra e sfalsata dallo spessore inferiore. Selezionare una lunghezza d'onda FITC con una durata di esposizione di 100 millisecondi e impostare la messa a fuoco automatica su laser con offset Z.Osservare e confermare la corretta acquisizione dell'immagine e diversi pozzetti prima di iniziare l'acquisizione della piastra. Dopo l'acquisizione delle immagini, eseguire l'analisi dei dati utilizzando il sistema di screening ad alto contenuto e una procedura di analisi delle immagini automatizzata personalizzata. Selezionare ogni embrione sulla piastra a 96 pozzetti da analizzare per l'area totale e l'intensità integrata della fluorescenza.Quindi tabulare i punti dati ed esportarli dal sistema di screening ad alto contenuto andando su misura e selezionando open data log per esportare i dati in un foglio di calcolo. Caricare il foglio di calcolo esportato nel pacchetto deployer per ordinare e sommare i dati per ciascun pozzo e filtrare in base al numero di pozzi. Quindi utilizzare il pacchetto Excel corretto per esportare i dati riepilogati in un foglio di calcolo.La distribuzione e l'intensità integrata dell'area totale specifica della 5-metilcitosina sono state valutate per gli embrioni di zebrafish a sei ore dopo la fecondazione. L'asse x mostra l'esposizione al DMSO come veicolo o al TDCIPP come controllo positivo. L'asse Y indica la fluorescenza relativa.Le soglie erano significativamente diverse dagli embrioni trattati con veicolo, come dimostrato dall'area totale di 5-metilcitosina rilevata all'interno degli embrioni e dall'intensità integrata all'interno della stessa area che indica il massimo rapporto segnale/rumore. È estremamente importante mantenere l'integrità del giogo e della massa cellulare per un corretto rilevamento IHC. Questo metodo è relativamente insensibile e offre solo dati RFU di abbondanza relativa.Se è necessaria una quantificazione, si può seguire con un approccio più mirato.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolamento e caratterizzazione di singole cellule da embrioni di zebrafish

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Generazione di Parabiotic embrioni di zebrafish da fusione chirurgica di Sviluppo Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Affinità Etichettatura Rilevazione di endogena Recettori da embrioni di zebrafish

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

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The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

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Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

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Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

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Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Intero Monte Immunohistochimica in Embrioni e Larve di pesce zebra

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Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...