Name: rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos
Uploaded: 2022-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos at JoVE.com

研究支援は、SABへのUCR大学院部門フェローシップ、SABへのNRSA T32トレーニングプログラムフェローシップ(T32ES018827)、およびDCVへの国立衛生研究所助成金(R01ES027576)およびUSDA国立食品農業研究所ハッチプロジェクト(1009609)によって提供されました。

成体ブリーダーは、カリフォルニア大学リバーサイド校の施設動物管理使用委員会(IACUC)が承認した動物使用プロトコル(#20180063)に従って取り扱われ、扱われました。
1.ゼブラフィッシュの胚の収集と化学物質への暴露
<ol><li>性的に成熟し、生殖的に生存可能な成体のオスとメスのゼブラフィッシュを含むタンク内の繁殖トラップを追加します。収集の少な?...

<ol>
	<li>Zhang, H. -. Y., Xiong, J., Qi, B. -. L., Feng, Y. -. Q., Yuan, B. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+existence+of+5-hydroxymethylcytosine+and+5-formylcytosine+in+both+DNA+and+RNA+in+mammals.">The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals.</a> Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+determination+of+the+oxidation+products+of+5-methylcytosine+in+RNA.">Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA.</a> Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).</li><li>Avila-Barnard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tris(1,3-dichloro-2-propyl)+phosphate+disrupts+the+trajectory+of+cytosine+methylation+within+developing+zebrafish+embryos.">Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos.</a> Environmental Research. 211, 113078 (2022).</li><li>Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+zebrafish+embryos+to+reveal+disruptions+in+dorsoventral+patterning.">Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning.</a> Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).</li><li>Vliet, S. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal-to-zygotic+transition+as+a+potential+target+for+niclosamide+during+early+embryogenesis.">Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).</li><li>Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+alterations+in+DNA+methylation+precede+Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced+delays+in+zebrafish+epiboly.">Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly.</a> Environmental Science &amp; Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).</li><li>Dasgupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interplay+among+nuclear+receptor+ligands,+cytosine+methylation,+and+the+metabolome+in+driving+tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced+epiboly+defects+in+zebrafish.">Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish.</a> Environmental Science &amp; Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).</li><li>McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+zebrafish+embryogenesis+is+susceptible+to+developmental+TDCPP+exposure.">Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure.</a> Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).</li><li>Geiman, T. M., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+early+development.">DNA methylation in early development.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).</li><li>Wossidlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming.">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).</li><li>Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation-mediated+epigenetic+control.">DNA methylation-mediated epigenetic control.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).</li><li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy.">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).</li><li>Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cytosine+methylation+at+a+glance.">Mammalian cytosine methylation at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).</li><li>Baylin, S. B., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+exploring+the+cancer+epigenome-biological+and+translational+implications.">A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).</li><li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+chromatin-unraveling+the+tangled+web.">DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web.</a> Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).</li><li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+human+disease.">DNA methylation and human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).</li><li>Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+DNA+methylation+in+mammalian+development+and+disease.">The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).</li><li>Yuan, B. -. F., Feng, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+analysis+of+5-methylcytosine+and+its+oxidation+products.">Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products.</a> Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).</li><li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos.">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li></ol>

このプロトコルでは、いくつかの重要な手順があります。まず、胚を脱絨毛する場合、発生中の胚のこれらの部分は非常に壊れやすく、穿刺しやすいため、針を胚/卵黄嚢/細胞塊の組織から遠ざけることが重要です。次に、標識された胚を個々のウェルに移すときは、プラスチックピペットに付着するため、ガラスピペットを使用して胚を移植します。第三に、ホールマウントIHCを実行する?...

酵素修飾は、シトシンの5-メチルシトシン(5-mC)への活性メチル化および脱メチル化、およびそれに続く5-mCの5-ヒドロキシメチルシトシン、5-ホルミルシトシン、および5-カルボキシルシトシンへの酸化を促進します1,2。リン酸トリス(1,3-ジクロロ-2-プロピル)(TDCIPP)は、米国で広く使用されている難燃剤であり、受精後0.75時間(hpf)から早期原腸形成(6hpf)までの初期胚曝露後のシトシンメチル化の軌跡を変化させることが以前に実証されています3,4,5,6,7,8。.脊椎動物の中では、5-mCとその修飾誘導体は初期胚発生を調節するために重要です9。胚の受精は、親DNAの脱メチル化を引き起こし、続いて母体のmRNA分解、接合子ゲノムの活性化、および接合子ゲノムの再メチル化を引き起こします9。シトシンメチル化を利用する生物学的に関連するプロセスには、ヒストン修飾、転写機構の動員、RNAメチル化、エピジェネティックなリプログラミング、およびクロマチン構造の決定が含まれます10,11。シトシンメチル化は脊椎動物種の間でも保存されており、異常なシトシンメチル化が生物の発生の軌跡にどのように影響するかを理解し、調査することの重要性を強調しています11。さらに、子宮内での発達は母親の曝露に敏感であり、即時の表現型の結果、成人病の感受性に対する長期的な影響、および遺伝性のエピジェネティックマークの世代を超えた影響などの有害な結果を引き起こす可能性があります12,13,14。
長いシトシン-グアニンペア、またはCpGアイランドは、ゲノム全体のシトシンメチル化のダイナミクスを特徴付けることを目的とした研究者の主要な病巣でした15,16,17。全ゲノムバイサルファイトシーケンシング、還元表現バイサルファイトシーケンシング、バイサルファイトアンプリコンシーケンシングなどのバイサルファイトベースの戦略は、塩基対分解能でシトシンメチル化を調べるためのゴールドスタンダードです。ただし、シーケンシングベースのアプローチはコストがかかりすぎるため、発生段階全体でシトシンメチル化を監視し、化学物質ごとに複数の濃度を監視し、処理ごとに胚を複製する機能がありません。さらに、シーケンシングベースのアプローチでは、影響を受ける可能性のある細胞タイプや発生中の胚内の領域を理解するために重要な空間局在に関する情報は提供されません。同様に、メチル化依存性制限分析、5-mC酵素結合イムノアッセイ(ELISA)、5-メチル-2'-デオキシシチジン(5-mC)液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)などのグローバルDNAメチル化アッセイは、細胞または組織のホモジネートに依存しているため、無傷の標本内の空間および時間にわたるシトシンメチル化の局在と大きさをモニターする能力が妨げられています12,18。
自動化された in vivo イメージング、遺伝子操作、子宮 外 発生時間の迅速化、および胚発生中の飼育の容易さにより、ゼブラフィッシュ胚は、初期胚発生中の有害な結果に寄与する生体異物媒介経路を明らかにするための生理学的に無傷のモデルとして引き続き広く使用されています。したがって、以下のプロトコルでは、5-mCに特異的な市販の抗体を使用して、ホールマウント免疫組織化学(IHC)、自動化されたハイコンテントイメージング、および統計分析前のプログラミング言語を使用した効率的なデータ処理を活用して、個々の無傷のゼブラフィッシュ胚内のシトシンメチル化を迅速かつ効率的に時空間的にモニタリングするための費用効果の高い戦略について説明します。
現在の知る限り、この方法は、無傷のゼブラフィッシュ胚内の5-mCを監視する最初の方法です。この方法は、細胞塊内のDNAメチル化の検出を可能にし、母体から接合体への移行中に卵黄に局在する母体mRNAのシトシンメチル化を検出する能力も有する。全体として、この方法は、エピジェネティックなリプログラミング中にシトシンメチル化を in situ で破壊する可能性のある化学物質の迅速な同定に役立ちます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>540225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-&#181;L glass microcapillary pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>211762B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08757100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL pipette&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13690032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250-mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB501250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-mL pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13690033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm glass petri dishes with lids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08747A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP67110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1110016SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-tank breeding traps</td>
			<td>Aquatic Habitats</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.&#160; Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunochemistry (IHC) basket</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaXpress 6.0.3.1658&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2140115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-5-mC antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MABE146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50998290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1337412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18612139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1368050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>RStudio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3772-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-controlled incubator&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PR505755L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos

シトシンメチル化は脊椎動物種全体で高度に保存されており、エピジェネティックプログラミングとクロマチン状態の主要な推進力として、初期胚発生において重要な役割を果たしています。酵素修飾は、シトシンの5-メチルシトシン(5-mC)への活性メチル化および脱メチル化を促進し、続いて5-mCの5-ヒドロキシメチルシトシン、5-ホルミルシトシン、および5-カルボキシルシトシンへの酸化を促進します。エピジェネティックなリプログラミングは 子宮内 発育中の重要な時期であり、母親の化学物質への曝露は子孫内のエピゲノムを再プログラムする可能性があります。これは、即時の表現型の結果、成人病の感受性に対する長期的な影響、および遺伝性のエピジェネティックマークの世代を超えた影響などの有害な結果を引き起こす可能性があります。バイサルファイトベースのシーケンシングにより、研究者は塩基対分解能でシトシンメチル化を調べることができますが、シーケンシングベースのアプローチはコストがかかりすぎるため、発生段階全体でシトシンメチル化をモニタリングする機能、化学物質ごとに複数の濃度、および処理ごとに胚を複製する能力が妨げられます。自動化された in vivo イメージング、遺伝子操作、子宮 外 発生時間の迅速化、および胚形成中の飼育の容易さにより、ゼブラフィッシュ胚は、初期胚発生中の有害な結果に寄与する生体異物媒介経路を明らかにするための生理学的に無傷のモデルとして引き続き使用されています。そこで、市販の5mC特異的抗体を用いて、ホールマウント免疫組織化学、自動ハイコンテントイメージング、および統計解析前のプログラミング言語を用いた効率的なデータ処理を活用して、個々の無傷のゼブラフィッシュ胚におけるシトシンメチル化を迅速かつ効率的に時空間的にモニタリングするための費用対効果の高い戦略について説明します。現在の知る限り、この方法は、発生初期にゼブラフィッシュ胚内の in situ で5-mCレベルを検出して定量化した最初の方法です。この方法は、細胞塊内のDNAメチル化の検出を可能にし、母体から接合体への移行中に卵黄に局在する母体mRNAのシトシンメチル化を検出する能力も有する。全体として、この方法は、エピジェネティックなリプログラミング中にシトシンメチル化を in situ で破壊する可能性のある化学物質の迅速な同定に役立ちます。

このプロトコルの全体的な目的は、固定および標識されたゼブラフィッシュ胚内の蛍光の総面積と相対強度を評価することにより、処理が5-mCの相対的な存在量に影響を与えるかどうかを判断することです。プロトコルが完了したら、蛍光実体顕微鏡を使用して、最初にホールマウントIHCが成功したかどうかを判断できます。標識された胚をFITCまたはGFPフィルターの下で観察する場合、陽性?...

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Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

この論文では、無傷のゼブラフィッシュ胚内の正常および異常なシトシンメチル化の迅速かつ効率的な時空間モニタリングのためのプロトコルについて説明します。

無傷ゼブラフィッシュ胚における正常および異常なシトシンメチル化の迅速かつ効率的な時空間モニタリング

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

このプロトコルは、比較的迅速でコスト効率の高い方法、および自動取得および分析を提供するため、一般的なエピジェネティックバイオマーカーである5-メチルシトシンの低感度スクリーニングを実現します。この手法の主な利点は、ユーザーがモデルと開発段階に合わせて最適化できる実験計画を提供する柔軟性です。この手法は、化学物質への曝露が、通常はシーケンシングなどの高価な高trpA法によってのみ行うことができる、発生中の生物内の5-メチルシトシンの相対的な存在量をどのように変化させるかを検出するために使用できます。この方法は、環境刺激に応答する5-メチルシトシンのエピジェネティックな変化を理解するためにNCG法を利用することを目指すあらゆる研究に役立ちます。収集の朝に新しい露出溶液を準備することから始めます。5ミリリットルの粒子状物質を含まないシステム水を60ミリメートルのガラスペトリ皿に加えます。次に、10マイクロリットルのマイクロキャピラリーガラスピペットを使用して、10マイクロリットルのジメチルスルホキシドまたは化学ストック溶液をシステム水に移します。ガラスのペトリ皿を回転させて、原液が確実に消散します。ガラスのペトリ皿にさらに5ミリリットルのシステム水を加え、皿を回転させて露光溶液を均質化します。蒸発を最小限に抑えるために、ガラス皿にガラス蓋をします。次に、RO水で満たされた噴出ボトルを使用して、胚を魚網から100ミリメートルの皿に移します。受精後0.75時間で50個の生胚をランダムに分類し、余分なRO水を取り除きます。暴露期間が終了したら、インキュベーターから胚を取り出します。すべての生きている胚を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。胚を吸引せずに残留暴露溶液を吸引する。500マイクロリットルの冷やした4%パラホルムアルデヒドを加え、胚を数回反転させて混合します。胚を固定し、摂氏4度で一晩4%パラホルムアルデヒドを固定します。胚を固定した後、4%パラホルムアルデヒドを吸引し、胚を1X PBSに再消化し、30秒間穏やかなピペッティングによって混合する。ガラスピペットを使用して、固定胚をRO水で満たされたガラス皿に注意深く移します。30秒間ゆっくりと回転させ、この洗浄を1回繰り返します。倍率5倍に設定した実体顕微鏡下で、注射針を用いて胚を脱コレーションする。針先を使用して、絨毛膜に穴を開け、卵黄と細胞塊からそっと剥がします。胚がデコレニングされたら、ガラスマイクロキャピラリーピペットを使用して、最大25個の無傷の胚を1つの免疫組織化学バスケットに移します。IHCバスケットを24ウェルプレートに入れます。次に、各井戸から水を吸引します。ウェルあたり500マイクロリットルのブロッキングバッファーに胚を再懸濁し、プレートをパラフォームとアルミホイルで包み、光から保護します。プレートを摂氏4度で100rpmのオービタルシェーカーで4時間インキュベートします。インキュベーション後、各ウェルからブロッキングバッファーを吸引します。500マイクロリットルの一次抗体溶液と交換してください。バックグラウンドノイズを説明するために、ブロッキングバッファーを使用してビヒクルコントロール胚のサブセットをインキュベートすることを忘れないでください。プレートとパラフォームとアルミホイルを再ラップし、プレートをオービタルシェーカーで摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、各ウェルから一次抗体溶液を取り出し、1x PBSTと交換します。各ウェルを1x PBSTで3回、オービタルシェーカーで1回の洗浄で5分間洗浄します。各ウェルから1x PBSTを吸引し、IHCバスケットをRO水で満たされたガラスのペトリ皿に入れます。標準的な実体顕微鏡下で、無傷の胚をランダムに96ウェルプレートに分類し、ウェルごとに1つの胚を確保します。次に、個々の井戸からすべてのRO水を取り除き、200マイクロリットルの1x PBSを追加します。プレートを1Gで3分間遠心分離し、透過光とFITCの下で2倍の対物レンズで胚を画像化します。オートフォーカスを選択して、カメラの焦点がプレートの下部にあり、下部の厚さによってオフセットされていることを確認します。露光時間が100ミリ秒のFITC波長を選択し、オートフォーカスをZオフセットのレーザーに設定します。プレート取得を開始する前に、適切な画像取得といくつかのウェルを観察して確認してください。画像取得後、ハイコンテントスクリーニングシステムとカスタム自動画像解析手順を使用してデータ解析を実行します。蛍光の総面積および積分強度について分析する96ウェルプレート上の各胚を選択する。次に、データポイントを集計し、測定に移動してオープンデータログを選択してデータをスプレッドシートにエクスポートすることにより、ハイコンテントスクリーニングシステムからエクスポートします。エクスポートしたスプレッドシートをデプロイヤーパッケージにアップロードして、各ウェルのデータを並べ替えて合計し、ウェル番号でフィルタリングします。次に、適切なExcelパッケージを使用して、合計データをスプレッドシートにエクスポートします。5-メチルシトシン特異的総面積の分布と積分強度は、受精後6時間でゼブラフィッシュ胚について評価されました。X 軸は、車両としての DMSO またはポジティブ コントロールとしての TDCIPP への曝露を示します。Y軸は相対蛍光を示す。閾値は、胚内で検出された5-メチルシトシンの総面積と、最大シグナル対ノイズ比を示す同じ領域内の積分強度によって示されるように、ビヒクル処理された胚とは有意に異なっていました。IHCを適切に検出するためには、ヨークと細胞塊の完全性を維持することが非常に重要です。この方法は比較的鈍感ではなく、相対的な存在量のRFUデータのみを提供します。定量化が必要な場合は、よりターゲットを絞ったアプローチでフォローアップできます。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ胚からの単一細胞の単離とキャラクタリゼーション

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

胞胚の開発の外科的融合による並体結合ゼブラフィッシュ胚の生成

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ胚からの内因性受容体の親和性ラベリング検出

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

生きたゼブラフィッシュ胚における運動ニューロン膜電位のバイオセンシング

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

生きた蛙およびゼブラフィッシュの胚における低酸素の誘導

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

生活そのままゼブラフィッシュの単一セルの光電

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

mRNAエレクトロポレーションを用いて鳥類胚における複数のタンパク質の迅速かつ効率的な発現

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

ゼブラフィッシュ胚と幼虫の全山免疫賦形化学

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

ヘッドスペースガスクロマトグラフィーを用いたゼブラフィッシュ胚におけるエタノール濃度の定量

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...