Name: rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos
Uploaded: 2022-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos at JoVE.com

연구 지원은 SAB에 UCR 대학원 부문 펠로우십, SAB에 NRSA T32 교육 프로그램 펠로우십(T32ES018827), DCV에 국립 보건원 보조금(R01ES027576) 및 USDA 국립 식량 농업 연구소 해치 프로젝트(1009609)에서 제공되었습니다.

성인 육종가는 리버 사이드에있는 캘리포니아 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC) 승인 동물 사용 프로토콜 (# 20180063)에 따라 취급 및 처리되었습니다.
1. 제브라피쉬 배아 수집 및 화학 물질 노출
<ol><li>성적으로 성숙하고 생식 가능한 성인 수컷과 암컷 제브라 피쉬가 들어있는 탱크에 탱크 내 번식 트랩을 추가하십시오. 수거 최소 12 시간 전에 ~ 9 : 00 AM?...

<ol>
	<li>Zhang, H. -. Y., Xiong, J., Qi, B. -. L., Feng, Y. -. Q., Yuan, B. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+existence+of+5-hydroxymethylcytosine+and+5-formylcytosine+in+both+DNA+and+RNA+in+mammals.">The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals.</a> Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+determination+of+the+oxidation+products+of+5-methylcytosine+in+RNA.">Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA.</a> Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).</li><li>Avila-Barnard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tris(1,3-dichloro-2-propyl)+phosphate+disrupts+the+trajectory+of+cytosine+methylation+within+developing+zebrafish+embryos.">Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos.</a> Environmental Research. 211, 113078 (2022).</li><li>Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+zebrafish+embryos+to+reveal+disruptions+in+dorsoventral+patterning.">Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning.</a> Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).</li><li>Vliet, S. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal-to-zygotic+transition+as+a+potential+target+for+niclosamide+during+early+embryogenesis.">Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).</li><li>Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+alterations+in+DNA+methylation+precede+Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced+delays+in+zebrafish+epiboly.">Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly.</a> Environmental Science &amp; Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).</li><li>Dasgupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interplay+among+nuclear+receptor+ligands,+cytosine+methylation,+and+the+metabolome+in+driving+tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced+epiboly+defects+in+zebrafish.">Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish.</a> Environmental Science &amp; Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).</li><li>McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+zebrafish+embryogenesis+is+susceptible+to+developmental+TDCPP+exposure.">Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure.</a> Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).</li><li>Geiman, T. M., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+early+development.">DNA methylation in early development.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).</li><li>Wossidlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming.">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).</li><li>Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation-mediated+epigenetic+control.">DNA methylation-mediated epigenetic control.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).</li><li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy.">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).</li><li>Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cytosine+methylation+at+a+glance.">Mammalian cytosine methylation at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).</li><li>Baylin, S. B., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+exploring+the+cancer+epigenome-biological+and+translational+implications.">A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).</li><li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+chromatin-unraveling+the+tangled+web.">DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web.</a> Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).</li><li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+human+disease.">DNA methylation and human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).</li><li>Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+DNA+methylation+in+mammalian+development+and+disease.">The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).</li><li>Yuan, B. -. F., Feng, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+analysis+of+5-methylcytosine+and+its+oxidation+products.">Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products.</a> Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).</li><li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos.">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li></ol>

이 프로토콜 중에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, 배아를 제거 할 때 발달중인 배아의 이러한 부분은 매우 연약하고 구멍을 뚫기 쉽기 때문에 배아 / 난황낭 / 세포 덩어리의 조직에서 바늘을 멀리 향하게하는 것이 중요합니다. 둘째, 라벨이 붙은 배아를 개별 웰로 옮길 때 유리 피펫을 사용하여 배아가 플라스틱 피펫에 부착되므로 배아를 옮깁니다. 셋째, 전체 장착 IHC를 수행할 때 플레?...

효소 변형은 시토신의 활성 메틸화 및 탈메틸화를 5-메틸시토신(5-mC)으로 유도하고 후속 5-mC를 5-하이드록시메틸시토신, 5-포르밀시토신 및 5-카르복실시토신 1,2로 산화시킵니다. 트리스 (1,3- 디클로로 -2- 프로필) 포스페이트 (TDCIPP)는 미국에서 널리 사용되는 난연제로, 수정 후 0.75 시간 (HPF)에서 조기 위장 (6 hpf)까지 초기 배아 노출 후 시토신 메틸화의 궤적을 변경하는 것으로 이전에 입증되었습니다.3,4,5,6,7,8 . 척추동물 내에서 5-mC와 그 변형된 유도체는 초기 배아 발달을 조절하는 데 중요합니다9. 배아의 수정은 부모 DNA의 탈메틸화를 유발하고, 모체 mRNA 분해, 접합체 게놈 활성화 및 접합체게놈의 재메틸화를 유발합니다9. 시토신 메틸화를 활용하는 생물학적으로 관련된 과정에는 히스톤 변형, 전사 기계의 모집, RNA 메틸화, 후성유전학적 재프로그래밍 및 염색질 구조10,11의 결정이 포함됩니다. 시토신 메틸화는 또한 척추동물 종들 사이에서 보존되며, 비정상적인 시토신 메틸화가 유기체의 발달 궤적에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 이해하고 조사하는 것의 중요성을 강조합니다11. 또한, 자궁 내 발달은 산모의 노출에 민감하며 즉각적인 표현형 결과, 성인 질병 감수성에 대한 장기적인 영향 및 유전 된 후성 유전 학적 표시의 세대 간 영향과 같은 불리한 결과를 초래할 가능성이 있습니다12,13,14.
시토신-구아닌 쌍 또는 CpG 섬의 긴 스트레칭은 게놈15,16,17에 걸친 시토신 메틸화의 역학을 특성화하는 것을 목표로 하는 연구자의 주요 초점이었습니다. 전체 게놈 중아황산염 시퀀싱, 감소된 표현 중아황산염 시퀀싱 및 중아황산염 앰플리콘 시퀀싱과 같은 중아황산염 기반 전략은 염기쌍 분해능에서 시토신 메틸화를 조사하기 위한 황금 표준을 나타냅니다. 그러나 시퀀싱 기반 접근 방식은 비용이 많이 들기 때문에 발달 단계에 걸쳐 시토신 메틸화를 모니터링하고 화학 물질당 여러 농도를 모니터링하고 치료당 배아를 복제하는 기능을 배제합니다. 또한 시퀀싱 기반 접근 방식은 공간 국소화에 대한 정보를 제공하지 않으며, 이는 잠재적으로 영향을 받는 세포 유형 및 발달 중인 배아 내 영역을 이해하는 데 중요합니다. 유사하게, 메틸화 의존적 제한 분석, 5-mC 효소 결합 면역 분석법 (ELISAs) 및 5-메틸-2'-데옥시시티딘 (5-mC) 액체 크로마토그래피-질량 분석법(LC-MS)과 같은 글로벌 DNA 메틸화 분석은 세포 또는 조직 균질물에 의존하며, 따라서 손상되지 않은 표본12,18 내에서 공간 및 시간에 따른 시토신 메틸화의 국소화 및 크기를 모니터링하는 능력을 배제합니다.
자동화된 생체 내 이미징의 용이성, 유전자 조작, 빠른 자궁 외 발달 시간 및 배아 발생 중 축산으로 인해 제브라피쉬 배아는 초기 배아 발달 동안 불리한 결과에 기여하는 이물질적 매개 경로를 밝히기 위해 생리학적으로 온전한 모델로 계속 널리 사용되고 있습니다. 따라서 아래 프로토콜은 5-mC에 특이적인 시판되는 항체를 사용하여 전체 마운트 면역조직화학(IHC), 자동화된 고함량 이미징 및 통계 분석 전에 프로그래밍 언어를 사용한 효율적인 데이터 처리를 활용하여 개별 온전한 제브라피쉬 배아 내에서 시토신 메틸화의 빠르고 효율적인 시공간 모니터링을 위한 비용 효율적인 전략을 설명합니다.
현재 지식에 따르면,이 방법은 손상되지 않은 제브라 피쉬 배아 내에서 5-mC를 모니터링하는 최초의 방법입니다. 이 방법은 세포 덩어리 내에서 DNA 메틸화의 검출을 가능하게하고 또한 모체에서 접합체로의 전이 동안 노른자 국소화 된 모체 mRNA의 시토신 메틸화를 검출 할 수있는 능력을 갖는다. 전반적으로, 이 방법은 후성유전학적 재프로그래밍 동안 현장에서 시토신 메틸화를 방해할 가능성이 있는 화학물질을 신속하게 식별하는 데 유용할 것입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>540225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-&#181;L glass microcapillary pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>211762B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08757100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL pipette&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13690032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250-mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB501250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-mL pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13690033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm glass petri dishes with lids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08747A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP67110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1110016SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-tank breeding traps</td>
			<td>Aquatic Habitats</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.&#160; Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunochemistry (IHC) basket</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaXpress 6.0.3.1658&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2140115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-5-mC antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MABE146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50998290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1337412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18612139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1368050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>RStudio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3772-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-controlled incubator&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PR505755L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos

시토신 메틸화는 척추동물 종에 걸쳐 고도로 보존되어 있으며 후성유전학적 프로그래밍과 염색질 상태의 핵심 동인으로서 초기 배아 발달에 중요한 역할을 합니다. 효소 변형은 시토신의 활성 메틸화 및 탈메틸화를 5-메틸시토신(5-mC)으로 유도하고 이후 5-mC를 5-하이드록시메틸시토신, 5-포르밀시토신 및 5-카르복실시토신으로 산화시킵니다. 후성유전학적 재프로그래밍은 자궁 발달 중 중요한 시기이며, 산모가 화학 물질에 노출되면 자손 내에서 후성유전체를 재프로그래밍할 가능성이 있습니다. 이것은 잠재적으로 즉각적인 표현형 결과, 성인 질병 감수성에 대한 장기적인 영향 및 유전 된 후성 유전 학적 마크의 세대 간 효과와 같은 불리한 결과를 유발할 수 있습니다. 중아황산염 기반 시퀀싱을 통해 연구자는 염기쌍 분해능에서 시토신 메틸화를 조사할 수 있지만 시퀀싱 기반 접근 방식은 비용이 많이 들기 때문에 발달 단계에 걸쳐 시토신 메틸화를 모니터링하고 화학 물질당 여러 농도를 모니터링하고 치료당 배아를 복제하는 기능을 배제합니다. 자동화된 생체 내 이미징, 유전자 조작, 빠른 자궁 외 발달 시간 및 배아 발생 중 사육의 용이성으로 인해 제브라피쉬 배아는 초기 배아 발달 동안 불리한 결과에 기여하는 이생물 매개 경로를 밝히기 위한 생리학적으로 온전한 모델로 계속 사용됩니다. 따라서 상용 5-mC 특이적 항체를 사용하여 전체 마운트 면역조직화학, 자동화된 고함량 이미징 및 통계 분석 전에 프로그래밍 언어를 사용한 효율적인 데이터 처리를 활용하여 개별 온전한 제브라피쉬 배아 내 시토신 메틸화의 빠르고 효율적인 시공간 모니터링을 위한 비용 효율적인 전략을 설명합니다. 현재 지식에 따르면, 이 방법은 초기 발달 동안 제브라피쉬 배아 내에서 in situ 5-mC 수준을 성공적으로 검출하고 정량화한 최초의 방법입니다. 이 방법은 세포 덩어리 내에서 DNA 메틸화의 검출을 가능하게하고 또한 모체에서 접합체로의 전이 동안 노른자 국소화 된 모체 mRNA의 시토신 메틸화를 검출 할 수있는 능력을 갖는다. 전반적으로, 이 방법은 후성유전학적 재프로그래밍 동안 현장에서 시토신 메틸화를 방해할 가능성이 있는 화학물질을 신속하게 식별하는 데 유용할 것입니다.

이 프로토콜의 전반적인 목표는 고정 및 표지된 제브라피쉬 배아 내에서 형광의 전체 면적과 상대적 강도를 평가하여 치료가 5-mC의 상대적 풍부도에 영향을 미치는지 여부를 결정하는 것입니다. 프로토콜을 완료한 후 형광 실체 현미경을 사용하여 먼저 전체 장착 IHC가 성공했는지 여부를 결정할 수 있습니다. 표지된 배아를 FITC 또는 GFP 필터 하에서 관찰할 때, 양성 결과는 배아 내에서 양성 FITC ?...

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Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

이 논문은 온전한 제브라피쉬 배아 내에서 정상 및 비정상적인 시토신 메틸화의 신속하고 효율적인 시공간적 모니터링을 위한 프로토콜을 설명합니다.

온전한 Zebrafish 배아 내에서 정상 및 비정상적인 시토신 메틸화에 대한 신속하고 효율적인 시공간 모니터링

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

이 프로토콜은 비교적 빠르고 비용 효율적인 방법뿐만 아니라 자동화된 획득 및 분석을 제공하여 일반적인 후성유전학적 바이오마커인 5-메틸시토신의 저감도 스크리닝을 생성합니다. 이 기술의 주요 장점은 사용자가 모델 및 개발 단계에 맞게 최적화 할 수있는 실험 설계를 제공하는 유연성에 있습니다. 이 기술은 화학 물질 노출이 일반적으로 시퀀싱과 같은 값 비싼 높은 trpA 방법을 통해서만 수행 할 수있는 개발 유기체 내에서 5- 메틸 시토신의 상대적 풍부도를 어떻게 변화시키는 지 감지하는 데 사용할 수 있습니다.이 방법은 환경 자극에 대한 반응으로 5- 메틸 시토신의 후성 유전 적 변화를 이해하기 위해 NCG 방법을 활용하는 것을 목표로하는 모든 연구에 유용합니다. 수집 아침에 신선한 노출 용액을 준비하는 것으로 시작하십시오. 60mm 유리 페트리 접시에 미립자가 없는 시스템 물 5밀리리터를 추가합니다.그런 다음 10 마이크로리터 마이크로 모세관 유리 피펫을 사용하여 10 마이크로리터의 디메틸 설폭사이드 또는 화학 원액을 시스템 용수로 옮깁니다. 유리 페트리 접시를 소용돌이 치면 저장 용액이 사라집니다. 유리 페트리 접시에 5 밀리리터의 시스템 수를 더 넣고 접시를 소용돌이 치며 노출 용액을 균질화합니다.증발을 최소화하기 위해 유리 뚜껑으로 유리 접시를 덮으십시오. 다음으로 RO 물이 채워진 분출 병을 사용하여 어망에서 배아를 100mm 접시로 옮깁니다. 수정 후 0.75 시간에 50 개의 살아있는 배아를 무작위로 분류하고 과도한 RO 물을 제거합니다.노출 기간이 끝나면 인큐베이터에서 배아를 제거하십시오. 모든 살아있는 배아를 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 배아를 흡인하지 않고 잔류 노출 용액을 흡인합니다.500 마이크로 리터의 냉장 된 4 % 파라 포름 알데히드를 넣고 배아를 반전시켜 여러 번 혼합하십시오. 배아가 섭씨 4도에서 밤새 고정되고 4%파라포름알데히드가 되도록 합니다. 배아를 고정한 후 4% 파라포름알데히드를 흡인하고 배아를 1X PBS에 다시 보내고 30초 동안 부드러운 피펫팅으로 혼합합니다.유리 피펫을 사용하여 고정 된 배아를 RO 물이 채워진 유리 접시에 조심스럽게 옮깁니다. 30초 동안 부드럽게 소용돌이치고 이 세척을 한 번 반복합니다. 5배 배율로 설정된 실체 현미경으로 주사기 바늘을 사용하여 배아를 디코레이트합니다.바늘 끝을 사용하여 chorion을 뚫고 노른자와 세포 덩어리에서 부드럽게 떼어냅니다. 배아를 장식한 후 유리 마이크로 모세관 피펫을 사용하여 최대 25개의 온전한 배아를 하나의 면역조직화학 바구니에 옮깁니다. IHC 바스켓을 24웰 플레이트에 넣습니다.그런 다음 각 우물에서 물을 흡입하십시오. 배아를 웰당 500마이크로리터의 블로킹 버퍼에 재현탁하고 플레이트를 파라폼과 알루미늄 호일로 감싸 빛으로부터 보호합니다. 플레이트를 섭씨 4도에서 100rpm의 오비탈 쉐이커 상에서 4시간 동안 배양한다.배양 후, 각 웰로부터 블로킹 완충액을 흡인한다. 500 마이크로 리터의 1 차 항체 용액으로 교체하십시오. 배경 소음을 설명하기 위해 차단 버퍼와 함께 차량 제어 배아의 하위 집합을 배양하는 것을 잊지 마십시오.플레이트와 파라폼 및 알루미늄 호일을 다시 감싸고 플레이트가 궤도 셰이커에서 밤새 섭씨 4도에서 배양되도록 합니다. 다음날 각 웰에서 1차 항체 용액을 제거하고 1x PBST로 교체합니다. 오비탈 셰이커에서 세척할 때마다 5분 동안 1x PBST로 각 웰을 세 번 세척합니다.각 웰에서 1x PBST를 흡입하고 IHC 바스켓을 RO 물로 채워진 유리 페트리 접시에 넣습니다. 표준 실체 현미경에서 손상되지 않은 배아를 무작위로 96웰 플레이트로 분류하여 웰당 하나의 배아를 보장합니다. 그런 다음 개별 웰에서 모든 RO 물을 제거하고 200 마이크로 리터의 1x PBS를 추가하십시오.플레이트를 투과광 및 FITC하에서 2배 목적물로 배아를 하나의 G.Image 에서 3분 동안 원심분리한다. 자동 초점을 선택하여 카메라의 초점이 플레이트 하단에 있고 하단 두께만큼 오프셋되도록 합니다. 노출 지속 시간이 100밀리초인 FITC 파장을 선택하고 Z 오프셋이 있는 레이저로 자동 초점을 설정합니다.플레이트 획득을 시작하기 전에 적절한 이미지 획득과 여러 웰을 관찰하고 확인합니다. 이미지 획득 후 고함량 스크리닝 시스템과 맞춤형 자동 이미지 분석 절차를 사용하여 데이터 분석을 수행합니다. 96웰 플레이트에서 각 배아를 선택하여 형광의 전체 면적 및 통합 강도를 분석합니다.그런 다음 데이터 포인트를 표로 만들고 측정으로 이동하고 오픈 데이터 로그를 선택하여 데이터를 스프레드시트로 내보내는 고함량 스크리닝 시스템에서 내보냅니다. 내보낸 스프레드시트를 배치자 패키지에 업로드하여 각 웰에 대한 데이터를 정렬 및 합산하고 웰 번호별로 필터링합니다. 그런 다음 올바른 Excel 패키지를 사용하여 합산 된 데이터를 스프레드 시트로 내 보냅니다.5- 메틸 시토신 특이적 총 면적의 분포 및 통합 강도는 수정 후 6 시간에 제브라 피쉬 배아에 대해 평가되었습니다. x축은 DMSO를 비히클로 또는 TDCIPP를 양성 대조군으로 노출한 것을 보여줍니다. Y축은 상대 형광을 나타냅니다.역치는 배아 내에서 검출된 5-메틸시토신의 총 면적과 최대 신호 대 잡음비를 나타내는 동일한 영역 내의 통합 강도로 표시된 바와 같이 비히클 처리된 배아와 유의하게 달랐습니다. 적절한 IHC 검출을 위해 요크 및 세포 질량의 무결성을 유지하는 것이 매우 중요합니다. 이 방법은 상대적으로 둔감하며 상대적인 풍부한 RFU 데이터만 제공합니다.정량화가 필요한 경우 보다 표적화된 접근 방식으로 후속 조치를 취할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

연구

발생학

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Blastulae 개발의 외과 융합에 의해 Parabiotic 제브라 피쉬 배아의 생성

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Zebrafish의 배아에서 내인성 수용체의 친화력 레이블 검출

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

살아있는 개구리와 Zebrafish 태아의 저산소증 유도

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Zebrafish 초기 배아에 종양 세포 전기 활동의 시각화

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

mRNA 전기 포란을 사용하여 조류 배아에서 여러 단백질의 빠르고 효율적인 발현

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

제브라피시 배아와 애벌레의 전체 마운트 면역항암화학

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

헤드 스페이스 가스 크로마토그래피를 이용한 제브라피시 배아의 에탄올 수치 정량화

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...