Name: rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos
Uploaded: 2022-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos at JoVE.com

Forskningsstøtte ble gitt av et UCR Graduate Division Fellowship til SAB, et NRSA T32 Training Program Fellowship (T32ES018827) til SAB, og et National Institutes of Health-tilskudd (R01ES027576) og USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) til DCV.

Voksne oppdrettere ble håndtert og behandlet i samsvar med en Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) -godkjent dyrebruksprotokoll (#20180063) ved University of California, Riverside.
1. Sebrafisk embryo samling og kjemisk eksponering
<ol><li>Legg til oppdrettsfeller i tanken til tanker som inneholder seksuelt modne og reproduktivt levedyktige voksne mannlige og kvinnelige sebrafisk. Legg til minst tre feller per 6 L tank minst 12 timer før innsamling kl. ~ 9:0...

<ol>
	<li>Zhang, H. -. Y., Xiong, J., Qi, B. -. L., Feng, Y. -. Q., Yuan, B. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+existence+of+5-hydroxymethylcytosine+and+5-formylcytosine+in+both+DNA+and+RNA+in+mammals.">The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals.</a> Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+determination+of+the+oxidation+products+of+5-methylcytosine+in+RNA.">Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA.</a> Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).</li><li>Avila-Barnard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tris(1,3-dichloro-2-propyl)+phosphate+disrupts+the+trajectory+of+cytosine+methylation+within+developing+zebrafish+embryos.">Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos.</a> Environmental Research. 211, 113078 (2022).</li><li>Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+zebrafish+embryos+to+reveal+disruptions+in+dorsoventral+patterning.">Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning.</a> Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).</li><li>Vliet, S. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal-to-zygotic+transition+as+a+potential+target+for+niclosamide+during+early+embryogenesis.">Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).</li><li>Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+alterations+in+DNA+methylation+precede+Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced+delays+in+zebrafish+epiboly.">Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly.</a> Environmental Science &amp; Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).</li><li>Dasgupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interplay+among+nuclear+receptor+ligands,+cytosine+methylation,+and+the+metabolome+in+driving+tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced+epiboly+defects+in+zebrafish.">Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish.</a> Environmental Science &amp; Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).</li><li>McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+zebrafish+embryogenesis+is+susceptible+to+developmental+TDCPP+exposure.">Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure.</a> Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).</li><li>Geiman, T. M., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+early+development.">DNA methylation in early development.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).</li><li>Wossidlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming.">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).</li><li>Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation-mediated+epigenetic+control.">DNA methylation-mediated epigenetic control.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).</li><li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy.">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).</li><li>Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cytosine+methylation+at+a+glance.">Mammalian cytosine methylation at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).</li><li>Baylin, S. B., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+exploring+the+cancer+epigenome-biological+and+translational+implications.">A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).</li><li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+chromatin-unraveling+the+tangled+web.">DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web.</a> Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).</li><li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+human+disease.">DNA methylation and human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).</li><li>Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+DNA+methylation+in+mammalian+development+and+disease.">The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).</li><li>Yuan, B. -. F., Feng, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+analysis+of+5-methylcytosine+and+its+oxidation+products.">Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products.</a> Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).</li><li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos.">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li></ol>

I løpet av denne protokollen er det noen få trinn som er kritiske. For det første, når du dekorionerer embryoer, er det viktig å peke nålen bort fra vevet til embryoet / eggeplommesekken / cellemassen, da disse delene av det utviklende embryoet er svært skjøre og enkle å punktere. For det andre, når du overfører merkede embryoer til individuelle brønner, bruk en glasspipette for å overføre embryoer, da de vil feste seg til en plastpipette. For det tredje, når du utfører helmontert IHC, må du sørge for a...

Enzymatiske modifikasjoner driver aktiv metylering og demetylering av cytosin til 5-metylcytosin (5 mC) og påfølgende oksidasjon av 5 mC til 5-hydroksymetylcytosin, 5-formylcytosin og 5-karboksylcytosin 1,2. Tris (1,3-diklor-2-propyl) fosfat (TDCIPP) er et mye brukt flammehemmende middel i USA som tidligere har vist seg å endre banen til cytosinmetylering etter tidlig embryonal eksponering fra 0,75 timer etter befruktning (hpf) gjennom tidlig gastrulering (6 hkf) 3,4,5,6,7,8 . Innenfor virveldyr er 5 mC og dets modifiserte derivater avgjørende for å regulere tidlig embryonal utvikling9. Befruktning av et embryo utløser demetylering av foreldrenes DNA, etterfulgt av mors mRNA-nedbrytning, zygotisk genomaktivering og remetylering av det zygotiske genomet9. Biologisk relevante prosesser som benytter cytosinmetylering inkluderer histonmodifisering, rekruttering av transkripsjonsmaskiner, RNA-metylering, epigenetisk omprogrammering og bestemmelse av kromatinstruktur10,11. Cytosinmetylering er også bevart blant virveldyrarter, noe som understreker viktigheten av å forstå og undersøke hvordan avvikende cytosinmetylering kan påvirke banen til en organismes utvikling11. Videre er in utero utvikling følsom for mors eksponering og har potensial til å forårsake uønskede utfall som umiddelbare fenotypiske konsekvenser, langsiktige effekter på følsomhet for voksen sykdom og transgenerasjonelle effekter av arvelige epigenetiske merker12,13,14.
Lange strekninger av cytosin-guaninpar, eller CpG-øyer, har vært de primære fokusene til etterforskere som tar sikte på å karakterisere dynamikken i cytosinmetylering over genomet15,16,17. Bisulfittbaserte strategier som helgenombisulfittsekvensering, redusert representasjonsbisulfittsekvensering og bisulfittamplikonsekvensering representerer gullstandarden for å forhøre cytosinmetylering ved baseparoppløsning. Sekvenseringsbaserte tilnærminger er imidlertid kostnadsoverkommelige og utelukker som sådan evnen til å overvåke cytosinmetylering på tvers av utviklingsstadier, flere konsentrasjoner per kjemikalie og replikere embryoer per behandling. I tillegg gir sekvenseringsbaserte tilnærminger ikke informasjon om romlig lokalisering, noe som er kritisk for å forstå potensielt berørte celletyper og områder i et utviklende embryo. På samme måte er globale DNA-metyleringsanalyser som metyleringsavhengig restriksjonsanalyse, 5-mC enzymbundne immunoassays (ELISAs) og 5-metyl-2'-deoksycytidin (5-mC) væskekromatografi-massespektrometri (LC-MS) avhengige av celle- eller vevshomogenater og utelukker som sådan evnen til å overvåke lokaliseringen og størrelsen på cytosinmetylering over rom og tid innenfor intakte prøver12,18.
På grunn av den enkle automatiserte in vivo-avbildningen, genetiske manipulasjoner, rask ex utero-utviklingstid og husdyrhold under embryogenese, fortsetter sebrafiskembryoer å bli mye brukt som fysiologisk intakte modeller for å avdekke xenobiotisk medierte veier som bidrar til uønskede utfall under tidlig embryonal utvikling. Ved bruk av kommersielt tilgjengelige antistoffer som er spesifikke for 5-mC, beskriver derfor protokollen nedenfor en kostnadseffektiv strategi for rask og effektiv spatiotemporal overvåking av cytosinmetylering i individuelle, intakte sebrafiskembryoer ved å utnytte helmontert immunhistokjemi (IHC), automatisert bildebehandling med høyt innhold og effektiv databehandling ved hjelp av programmeringsspråk før statistisk analyse.
Til dagens kunnskap er denne metoden den første som overvåker 5 mC i intakte sebrafiskembryoer. Metoden muliggjør påvisning av DNA-metylering i cellemassen og har også evnen til å oppdage cytosinmetylering av eggeplomme-lokaliserte maternelle mRNA under den maternelle-til-zygotiske overgangen. Samlet sett vil denne metoden være nyttig for rask identifisering av kjemikalier som har potensial til å forstyrre cytosinmetylering in situ under epigenetisk omprogrammering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>540225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-&#181;L glass microcapillary pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>211762B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08757100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL pipette&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13690032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250-mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB501250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-mL pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13690033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm glass petri dishes with lids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08747A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP67110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1110016SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-tank breeding traps</td>
			<td>Aquatic Habitats</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.&#160; Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunochemistry (IHC) basket</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaXpress 6.0.3.1658&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2140115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-5-mC antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MABE146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50998290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1337412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18612139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1368050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>RStudio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3772-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-controlled incubator&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PR505755L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos

Cytosinmetylering er svært konservert på tvers av virveldyrarter, og som en nøkkeldriver for epigenetisk programmering og kromatintilstand spiller en kritisk rolle i tidlig embryonal utvikling. Enzymatiske modifikasjoner driver aktiv metylering og demetylering av cytosin til 5-metylcytosin (5 mC) og påfølgende oksidasjon av 5 mC til 5-hydroksymetylcytosin, 5-formylcytosin og 5-karboksylcytosin. Epigenetisk omprogrammering er en kritisk periode under in utero utvikling, og mors eksponering for kjemikalier har potensial til å omprogrammere epigenomet i avkom. Dette kan potensielt forårsake uønskede utfall som umiddelbare fenotypiske konsekvenser, langsiktige effekter på følsomhet for voksen sykdom og transgenerasjonelle effekter av arvelige epigenetiske merker. Selv om bisulfittbasert sekvensering gjør det mulig for etterforskere å forhøre cytosinmetylering ved baseparoppløsning, er sekvenseringsbaserte tilnærminger kostnadsoverkommelige og utelukker som sådan evnen til å overvåke cytosinmetylering på tvers av utviklingsstadier, flere konsentrasjoner per kjemikalie og replikere embryoer per behandling. På grunn av den enkle automatiserte in vivo-avbildningen, genetiske manipulasjoner, rask ex utero-utviklingstid og husdyrhold under embryogenese, fortsetter sebrafiskembryoer å bli brukt som en fysiologisk intakt modell for å avdekke xenobiotisk medierte veier som bidrar til uønskede utfall under tidlig embryonal utvikling. Ved hjelp av kommersielt tilgjengelige 5-mC-spesifikke antistoffer beskriver vi derfor en kostnadseffektiv strategi for rask og effektiv spatiotemporal overvåking av cytosinmetylering i individuelle, intakte sebrafiskembryoer ved å utnytte helmontert immunhistokjemi, automatisert bildebehandling med høyt innhold og effektiv databehandling ved hjelp av programmeringsspråk før statistisk analyse. Med dagens kunnskap er denne metoden den første som lykkes med å oppdage og kvantifisere 5 mC-nivåer in situ i sebrafiskembryoer under tidlig utvikling. Metoden muliggjør påvisning av DNA-metylering i cellemassen og har også evnen til å oppdage cytosinmetylering av eggeplomme-lokaliserte maternelle mRNA under den maternelle-til-zygotiske overgangen. Samlet sett vil denne metoden være nyttig for rask identifisering av kjemikalier som har potensial til å forstyrre cytosinmetylering in situ under epigenetisk omprogrammering.

Det overordnede målet med denne protokollen er å avgjøre om en behandling påvirker den relative overfloden av 5 mC ved å vurdere det totale arealet og den relative intensiteten av fluorescens innenfor faste og merkede sebrafiskembryoer. Etter å ha fullført protokollen, kan et fluorescensstereomikroskop brukes til først å avgjøre om hele IHC var vellykket. Når merkede embryoer observeres under et FITC- eller GFP-filter, indikeres et positivt resultat av et positivt FITC-signal i embryoet, mens et negativt resul...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos at JoVE.com

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Denne artikkelen beskriver en protokoll for rask og effektiv spatiotemporal overvåking av normal og avvikende cytosinmetylering i intakte sebrafiskembryoer.

Rask og effektiv spatiotemporal overvåking av normal og avvikende cytosinmetylering i intakte sebrafiskembryoer

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

Denne protokollen tilbyr en relativt rask og kostnadseffektiv metode, samt en automatisert innsamling og analyse som dermed gir lav sensitivitetsscreening av 5-metylcytosin som er en vanlig epigenetisk biomarkør. Den største fordelen med denne teknikken er i fleksibiliteten den tilbyr en eksperimentell design som brukerne kan optimalisere til sin modell og utviklingsstadium. Denne teknikken kan brukes til å oppdage hvordan kjemisk eksponering endrer den relative overflod av 5-metylcytosin i en utviklende organisme som normalt bare kunne gjøres gjennom dyre høye trpA-metoder som sekvensering.Denne metoden er nyttig for enhver forskning som tar sikte på å bruke NCG-metoder for å forstå epigenetiske endringer av 5-metylcytosin som respons på miljøstimuli. Begynn med å forberede en ny eksponeringsløsning om morgenen for innsamling. Tilsett fem milliliter partikkelfritt systemvann til en petriskål i 60 millimeter glass.Bruk deretter en 10 mikroliter mikrokapillær glasspipette for å overføre 10 mikroliter dimetylsulfoksid eller kjemisk stamløsning til systemvann. Virvle glasset petriskålen for å sikre at stamløsningen forsvinner. Tilsett ytterligere fem milliliter systemvann i glassfatet og virvle parabolen for å homogenisere eksponeringsløsningen.Caps glassfatene med glasslokk for å minimere fordampning. Deretter bruker du en RO vannfylt spruteflaske for å overføre embryoene fra fiskenettet til en 100 millimeter tallerken. Sorter tilfeldig 50 levende embryoer 0,75 timer etter befruktning og fjern overflødig RO-vann.Etter at eksponeringsvarigheten er avsluttet, fjern embryoene fra inkubatoren. Overfør alle levende embryoer til et 1,5 milliliter mikrosentrifugerør. Aspirate resteksponeringsløsning uten å aspirere noen embryoer.Tilsett 500 mikroliter kjølt 4% paraformaldehyd og bland embryoene ved inversjon flere ganger. La embryoene fikse seg og 4% paraformaldehyd over natten ved fire grader celsius. Etter å ha fikset embryoene, aspirer 4% paraformaldehyd, gjenbruk embryoene i 1X PBS, og bland ved forsiktig pipettering i 30 sekunder.Bruk en glasspipette til å overføre faste embryoer forsiktig til en RO vannfylt glassfat. Roter forsiktig i 30 sekunder og gjenta denne vasken en gang. Under et stereomikroskop satt til fem ganger forstørrelse dekorerer embryoene ved hjelp av sprøytenåler.Bruk nålespissen, punkter korionet og skrell det forsiktig bort fra eggeplommen og cellemassen. Etter at embryoene er dekorert, bruk en mikrokapillær pipette i glass for å overføre opptil 25 intakte embryoer til en immunhistokjemikurv. Plasser IHC-kurven i en 24-brønnplate.Deretter aspireres vannet fra hver brønn. Resuspend embryoene i 500 mikroliter blokkeringsbuffer per brønn, pakk platen med paraform og aluminiumsfolie for å beskytte den mot lys. Inkuber platen ved fire grader Celsius i fire timer på en orbital shaker ved 100 o / min.Etter inkubasjon, aspirer blokkeringsbufferen fra hver brønn. Bytt den ut med 500 mikroliter primær antistoffløsning. Husk å inkubere en delmengde av kjøretøykontrollembryoer med blokkeringsbufferen for å ta hensyn til bakgrunnsstøy.Pakk om platen og paraformen og aluminiumsfolien og la platen inkubere ved fire grader Celsius over natten på en orbital shaker. Dagen etter fjerner du den primære antistoffløsningen fra hver brønn og erstatter den med 1x PBST. Vask hver brønn tre ganger med 1x PBST i fem minutter per vask på en orbital shaker.Aspirer 1x PBST fra hver brønn og legg IHC-kurven i en glass petriskål fylt med RO-vann. Under et standard stereomikroskop sorterer tilfeldig intakte embryoer i en 96-brønnplate som sikrer ett embryo per brønn. Fjern deretter alt RO-vann fra individuelle brønner og tilsett 200 mikroliter 1x PBS.Sentrifuge platen i tre minutter på en G.Image embryoene med en to ganger objektiv under overført lys og FITC. Velg autofokus for å sikre at kameraets fokus er på undersiden av platen og forskjøvet av bunntykkelsen. Velg en FITC-bølgelengde med en eksponeringsvarighet på 100 millisekunder, og sett autofokusen til laser med en Z-forskyvning.Observere og bekrefte riktig bildeinnsamling og flere brønner før plateinnsamling påbegynnes. Etter bildeinnsamling, utfør dataanalyse ved hjelp av screeningsystemet med høyt innhold og en tilpasset automatisert bildeanalyseprosedyre. Velg hvert embryo på 96-brønnplaten som skal analyseres for totalt areal og integrert intensitet av fluorescens.Deretter tabulerer du datapunktene og eksporterer dem fra screeningsystemet med høyt innhold ved å måle og velge åpen datalogg for å eksportere dataene til et regneark. Last opp det eksporterte regnearket til deployer-pakken for å sortere og summere data for hver brønn og filtrere etter brønnnummer. Bruk deretter riktig Excel-pakke for å eksportere de summerte dataene til et regneark.Fordelingen og den integrerte intensiteten av 5-metylcytosinspesifikt totalareal ble vurdert for sebrafiskembryoer seks timer etter befruktning. X-aksen viser eksponering for enten DMSO som kjøretøy eller TDCIPP som positiv kontroll. Y-aksen betegner relativ fluorescens.Tersklene var signifikant forskjellig fra de kjøretøybehandlede embryoene som vist ved det totale arealet av 5-metylcytosin oppdaget i embryoer og den integrerte intensiteten innenfor det samme området som indikerer maksimalt signal / støyforhold. Det er ekstremt viktig å opprettholde integriteten til åket og cellemassen for riktig IHC-deteksjon. Denne metoden er relativt ufølsom og tilbyr bare relativ overflod RFU-data.Dersom kvantifisering er nødvendig kan man følge opp med en mer målrettet tilnærming.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering og karakterisering av enkeltceller fra sebrafisk embryo

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Generering av Parabiotic Sebrafisk embryoer ved Kirurgisk Fusion of Utvikling Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Affinity Merking Påvisning av endogene reseptorer fra Sebrafisk embryo

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing Motor Neuron Membran Potensial i Live Zebrafish Embryoer

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induksjon av hypoksi i levende frosk og sebrafiskembryoer

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Encellede Photoconversion i levende intakt sebrafisk

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisering av mobilnettet elektrisk aktivitet i sebrafisk tidlig embryo og svulster

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Rask og effektiv uttrykk for flere proteiner i avian embryo bruke mRNA electroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Hele Immunohistokjemi i sebrafiskembryoer og larver

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

Kvantifisering av etanolnivåer i sebrafiskembryoer ved hjelp av hodeplassgasskromatografi

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...