Name: rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos
Uploaded: 2022-08-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos at JoVE.com

Forskningsstöd tillhandahölls av ett UCR Graduate Division Fellowship till SAB, ett NRSA T32 Training Program Fellowship (T32ES018827) till SAB och ett National Institutes of Health-bidrag (R01ES027576) och USDA National Institute of Food and Agriculture Hatch Project (1009609) till DCV.

Vuxna uppfödare hanterades och behandlades i enlighet med ett IAUC-godkänt protokoll för djurvård och användning (Institutional Animal Care and Use Committee) (#20180063) vid University of California, Riverside.
1. Insamling av zebrafiskembryon och kemisk exponering
<ol><li>Lägg till avelsfällor i tanken till tankar som innehåller sexuellt mogna och reproduktivt livskraftiga vuxna manliga och kvinnliga zebrafiskar. Lägg till minst tre fällor per 6 L tank minst 12 t...

<ol>
	<li>Zhang, H. -. Y., Xiong, J., Qi, B. -. L., Feng, Y. -. Q., Yuan, B. -. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+existence+of+5-hydroxymethylcytosine+and+5-formylcytosine+in+both+DNA+and+RNA+in+mammals.">The existence of 5-hydroxymethylcytosine and 5-formylcytosine in both DNA and RNA in mammals.</a> Chemical Communications. 52 (4), 737-740 (2016).</li><li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+determination+of+the+oxidation+products+of+5-methylcytosine+in+RNA.">Formation and determination of the oxidation products of 5-methylcytosine in RNA.</a> Chemical Science. 7 (8), 5495-5502 (2016).</li><li>Avila-Barnard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tris(1,3-dichloro-2-propyl)+phosphate+disrupts+the+trajectory+of+cytosine+methylation+within+developing+zebrafish+embryos.">Tris(1,3-dichloro-2-propyl) phosphate disrupts the trajectory of cytosine methylation within developing zebrafish embryos.</a> Environmental Research. 211, 113078 (2022).</li><li>Dasgupta, S., Cheng, V., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Utilizing+zebrafish+embryos+to+reveal+disruptions+in+dorsoventral+patterning.">Utilizing zebrafish embryos to reveal disruptions in dorsoventral patterning.</a> Current Protocols. 1 (6), 179 (2021).</li><li>Vliet, S. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal-to-zygotic+transition+as+a+potential+target+for+niclosamide+during+early+embryogenesis.">Maternal-to-zygotic transition as a potential target for niclosamide during early embryogenesis.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 380, 114699 (2019).</li><li>Kupsco, A., Dasgupta, S., Nguyen, C., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+alterations+in+DNA+methylation+precede+Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced+delays+in+zebrafish+epiboly.">Dynamic alterations in DNA methylation precede Tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced delays in zebrafish epiboly.</a> Environmental Science &amp; Technology Letters. 4 (9), 367-373 (2017).</li><li>Dasgupta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+interplay+among+nuclear+receptor+ligands,+cytosine+methylation,+and+the+metabolome+in+driving+tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced+epiboly+defects+in+zebrafish.">Complex interplay among nuclear receptor ligands, cytosine methylation, and the metabolome in driving tris(1,3-dichloro-2-propyl)phosphate-induced epiboly defects in zebrafish.</a> Environmental Science &amp; Technology. 53 (17), 10497-10505 (2019).</li><li>McGee, S. P., Cooper, E. M., Stapleton, H. M., Volz, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+zebrafish+embryogenesis+is+susceptible+to+developmental+TDCPP+exposure.">Early zebrafish embryogenesis is susceptible to developmental TDCPP exposure.</a> Environmental Health Perspectives. 120 (11), 1585-1591 (2012).</li><li>Geiman, T. M., Muegge, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+in+early+development.">DNA methylation in early development.</a> Molecular Reproduction and Development. 77 (2), 105-113 (2010).</li><li>Wossidlo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Hydroxymethylcytosine+in+the+mammalian+zygote+is+linked+with+epigenetic+reprogramming.">5-Hydroxymethylcytosine in the mammalian zygote is linked with epigenetic reprogramming.</a> Nature Communications. 2 (1), 1-8 (2011).</li><li>Rottach, A., Leonhardt, H., Spada, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation-mediated+epigenetic+control.">DNA methylation-mediated epigenetic control.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 108 (1), 43-51 (2009).</li><li>Egger, G., Liang, G., Aparicio, A., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics+in+human+disease+and+prospects+for+epigenetic+therapy.">Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy.</a> Nature. 429 (6990), 457-463 (2004).</li><li>Ooi, S. K. T., O'Donnell, A. H., Bestor, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cytosine+methylation+at+a+glance.">Mammalian cytosine methylation at a glance.</a> Journal of Cell Science. 122 (16), 2787-2791 (2009).</li><li>Baylin, S. B., Jones, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+decade+of+exploring+the+cancer+epigenome-biological+and+translational+implications.">A decade of exploring the cancer epigenome-biological and translational implications.</a> Nature Reviews Cancer. 11 (10), 726-734 (2011).</li><li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+chromatin-unraveling+the+tangled+web.">DNA methylation and chromatin-unraveling the tangled web.</a> Oncogene. 21 (35), 5361-5379 (2002).</li><li>Robertson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+human+disease.">DNA methylation and human disease.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (8), 597-610 (2005).</li><li>Greenberg, M. V. C., Bourc'his, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diverse+roles+of+DNA+methylation+in+mammalian+development+and+disease.">The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (10), 590-607 (2019).</li><li>Yuan, B. -. F., Feng, Y. -. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+analysis+of+5-methylcytosine+and+its+oxidation+products.">Recent advances in the analysis of 5-methylcytosine and its oxidation products.</a> Trends in Analytical Chemistry. 54, 24-35 (2014).</li><li>Lantz-McPeak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+assay+using+high+content+screening+of+zebrafish+embryos.">Developmental toxicity assay using high content screening of zebrafish embryos.</a> Journal of Applied Toxicology. 35 (3), 261-272 (2015).</li></ol>

Under detta protokoll finns det några steg som är kritiska. För det första, när man dekorionerar embryon, är det viktigt att rikta nålen bort från vävnaden i embryot / äggula sac / cellmassan, eftersom dessa delar av det utvecklande embryot är mycket ömtåliga och lätta att punktera. För det andra, när du överför märkta embryon till enskilda brunnar, använd en glaspipett för att överföra embryon eftersom de kommer att fästa vid en plastpipett. För det tredje, när du utför helmonterad IHC, se til...

Enzymatiska modifieringar driver aktiv metylering och demetylering av cytosin till 5-metylcytosin (5-mC) och efterföljande oxidation av 5-mC till 5-hydroximetylcytosin, 5-formylcytosin och 5-karboxylcytosin 1,2. Tris(1,3-diklor-2-propyl)fosfat (TDCIPP) är ett allmänt använt flamskyddsmedel i USA som tidigare har visat sig förändra banan för cytosinmetylering efter tidig embryonal exponering från 0,75 timmar efter befruktning (hpf) genom tidig gastrulation (6 hpf)3,4,5,6,7,8 . Inom ryggradsdjur är 5-mC och dess modifierade derivat avgörande för att reglera tidig embryonal utveckling9. Befruktning av ett embryo utlöser demetylering av föräldra-DNA, följt av moderns mRNA-nedbrytning, zygotisk genomaktivering och metylering av det zygotiska genomet9. Biologiskt relevanta processer som använder cytosinmetylering inkluderar histonmodifiering, rekrytering av transkriptionsmaskiner, RNA-metylering, epigenetisk omprogrammering och bestämning av kromatinstruktur10,11. Cytosinmetylering bevaras också bland ryggradsdjur, vilket understryker vikten av att förstå och undersöka hur avvikande cytosinmetylering kan påverka banan för en organisms utveckling11. Dessutom är utvecklingen i livmodern känslig för exponering av mödrar och har potential att orsaka negativa resultat såsom omedelbara fenotypiska konsekvenser, långsiktiga effekter på vuxnas sjukdomskänslighet och transgenerationella effekter av ärftliga epigenetiska märken12,13,14.
Långa sträckor av cytosin-guaninpar, eller CpG-öar, har varit de primära fokuserna för utredare som syftar till att karakterisera dynamiken i cytosinmetylering över genomet15,16,17. Bisulfitbaserade strategier såsom helgenombisulfitsekvensering, reducerad representation bisulfitsekvensering och bisulfitampliconsekvensering representerar guldstandarden för att förhöra cytosinmetylering vid basparupplösning. Sekvenseringsbaserade metoder är dock kostnadsoöverkomliga och utesluter som sådana förmågan att övervaka cytosinmetylering över utvecklingsstadier, flera koncentrationer per kemikalie och replikera embryon per behandling. Dessutom ger sekvenseringsbaserade metoder inte information om rumslig lokalisering, vilket är avgörande för att förstå potentiellt påverkade celltyper och områden inom ett utvecklande embryo. På liknande sätt är globala DNA-metyleringsanalyser såsom metyleringsberoende restriktionsanalys, 5-mC-enzymbundna immunanalyser (ELISA) och 5-metyl-2'-deoxicytidin (5-mC) vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) beroende av cell- eller vävnadshomogenater och utesluter som sådan förmågan att övervaka lokaliseringen och storleken på cytosinmetylering över tid och rum inom intakta prover12,18.
På grund av den enkla automatiserade in vivo-avbildningen, genetiska manipulationer, snabb ex utero-utvecklingstid och djurhållning under embryogenesen fortsätter zebrafiskembryon att användas i stor utsträckning som fysiologiskt intakta modeller för att avslöja xenobiotiska medierade vägar som bidrar till negativa resultat under tidig embryonal utveckling. Därför, med hjälp av kommersiellt tillgängliga antikroppar som är specifika för 5-mC, beskriver protokollet nedan en kostnadseffektiv strategi för snabb och effektiv spatiotemporal övervakning av cytosinmetylering inom enskilda, intakta zebrafiskembryon genom att utnyttja helmonterad immunhistokemi (IHC), automatiserad avbildning med högt innehåll och effektiv databehandling med programmeringsspråk före statistisk analys.
Enligt nuvarande kunskap är denna metod den första som övervakar 5-mC inom intakta zebrafiskembryon. Metoden möjliggör detektion av DNA-metylering i cellmassan och har också förmågan att detektera cytosinmetylering av äggula-lokaliserade moderns mRNA under den moder-till-zygotiska övergången. Sammantaget kommer denna metod att vara användbar för snabb identifiering av kemikalier som har potential att störa cytosinmetylering in situ under epigenetisk omprogrammering.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5-mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>540225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-&#181;L glass microcapillary pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>211762B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-mm plastic Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08757100D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x phosphate-buffered saline&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-mL pipette&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13690032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250-mL Erlenmeyer flask</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB501250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-mL pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13690033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm glass petri dishes with lids</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08747A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>720089</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluor 488-conjugated goat anti-mouse IgG antibody&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A21121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP67110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1110016SH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-tank breeding traps</td>
			<td>Aquatic Habitats</td>
			<td>N/A</td>
			<td>This product is no longer available following acquisition of Aquatic Habitats by Pentair.&#160; Investigators can use standard off-system breeding tanks available from multiple vendors.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Screening System</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any high-content screening system equipped with transmitted light and FITC filter will be suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunochemistry (IHC) basket</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Manufactured in-house using microcentrifuge tubes with conical portion removed and bottom fitted with mesh, sized for 24- or 48-well plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MetaXpress 6.0.3.1658&#160;</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any software capable of quantifying total area and integrated intensity of fluorescence will be suitable.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microspatula</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>2140115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-5-mC antibody</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>MABE146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP359-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50998290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1337412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>18612139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1368050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rstudio</td>
			<td>RStudio</td>
			<td>N/A</td>
			<td>RStudio is open-source software and can be downloaded at https://www.rstudio.com.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sheep serum</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>S3772-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>10450103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature-controlled incubator&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PR505755L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P7949-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and efficient spatiotemporal monitoring of normal and aberrant cytosine methylation within intact zebrafish embryos

Cytosinmetylering är mycket bevarad över ryggradsdjur och spelar, som en viktig drivkraft för epigenetisk programmering och kromatintillstånd, en avgörande roll i tidig embryonal utveckling. Enzymatiska modifieringar driver aktiv metylering och demetylering av cytosin till 5-metylcytosin (5-mC) och efterföljande oxidation av 5-mC till 5-hydroximetylcytosin, 5-formylcytosin och 5-karboxylcytosin. Epigenetisk omprogrammering är en kritisk period under in utero-utveckling , och moderns exponering för kemikalier har potential att omprogrammera epigenomet inom avkomman. Detta kan potentiellt orsaka negativa resultat som omedelbara fenotypiska konsekvenser, långsiktiga effekter på vuxen sjukdomskänslighet och transgenerationella effekter av ärftliga epigenetiska märken. Även om bisulfitbaserad sekvensering gör det möjligt för utredare att förhöra cytosinmetylering vid basparupplösning, är sekvenseringsbaserade tillvägagångssätt kostnadsoöverkomliga och utesluter som sådan förmågan att övervaka cytosinmetylering över utvecklingsstadier, flera koncentrationer per kemikalie och replikera embryon per behandling. På grund av den enkla automatiserade in vivo-avbildningen, genetiska manipulationer, snabb ex utero-utvecklingstid och djurhållning under embryogenesen fortsätter zebrafiskembryon att användas som en fysiologiskt intakt modell för att avslöja xenobiotiska medierade vägar som bidrar till negativa resultat under tidig embryonal utveckling. Därför beskriver vi med hjälp av kommersiellt tillgängliga 5-mC-specifika antikroppar en kostnadseffektiv strategi för snabb och effektiv spatiotemporal övervakning av cytosinmetylering inom enskilda, intakta zebrafiskembryon genom att utnyttja helmonterad immunhistokemi, automatiserad avbildning med högt innehåll och effektiv databehandling med programmeringsspråk före statistisk analys. Enligt nuvarande kunskap är denna metod den första som framgångsrikt detekterar och kvantifierar 5-mC-nivåer in situ inom zebrafiskembryon under tidig utveckling. Metoden möjliggör detektion av DNA-metylering i cellmassan och har också förmågan att detektera cytosinmetylering av äggula-lokaliserade moderns mRNA under den moder-till-zygotiska övergången. Sammantaget kommer denna metod att vara användbar för snabb identifiering av kemikalier som har potential att störa cytosinmetylering in situ under epigenetisk omprogrammering.

Det övergripande syftet med detta protokoll är att avgöra om en behandling påverkar den relativa förekomsten av 5-mC genom att bedöma den totala ytan och den relativa intensiteten av fluorescens inom fasta och märkta zebrafiskembryon. Efter att ha slutfört protokollet kan ett fluorescensstereomikroskop användas för att först avgöra om IHC med helmontering lyckades. När märkta embryon observeras under ett FITC- eller GFP-filter indikeras ett positivt resultat av en positiv FITC-signal i embryot, medan ett ne...

Watch this Scientific Journal Video about Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos at JoVE.com

Rapid and Efficient Spatiotemporal Monitoring of Normal and Aberrant Cytosine Methylation within Intact Zebrafish Embryos

Detta dokument beskriver ett protokoll för snabb och effektiv spatiotemporal övervakning av normal och avvikande cytosinmetylering inom intakta zebrafiskembryon.

Snabb och effektiv spatiotemporal övervakning av normal och avvikande cytosinmetylering inom intakta zebrafiskembryon

Cytosine methylation is highly conserved across vertebrate species and, as a key driver of epigenetic programming and chromatin state, plays a critical ...

Detta protokoll erbjuder en relativt snabb och kostnadseffektiv metod, samt ett automatiserat förvärv och analys som därmed ger låg känslighetsscreening av 5-metylcytosin som är en vanlig epigenetisk biomarkör. Den största fördelen med denna teknik är i flexibiliteten den erbjuder en experimentell design som användare kan optimera till sin modell och utvecklingsstadium. Denna teknik kan användas för att upptäcka hur kemisk exponering förändrar den relativa förekomsten av 5-metylcytosin i en utvecklande organism som normalt endast kan göras genom dyra höga trpA-metoder som sekvensering.Denna metod är användbar för all forskning som syftar till att använda NCG-metoder för att förstå epigenetiska förändringar av 5-metylcytosin som svar på miljöstimuli. Börja med att förbereda en ny exponeringslösning på morgonen för insamling. Tillsätt fem milliliter partikelfritt systemvatten till en 60 millimeter glasskål.Använd sedan en 10 mikroliter mikrokapillärglaspipett för att överföra 10 mikroliter dimetylsulfoxid eller kemisk stamlösning till systemvatten. Virvla glasskålen för att säkerställa att stamlösningen försvinner. Tillsätt ytterligare fem milliliter systemvatten i glasskålen och virvla skålen för att homogenisera exponeringslösningen.Täck glasskålarna med glaslock för att minimera avdunstningen. Använd sedan en RO-vattenfylld sprutflaska för att överföra embryona från fisknätet till en 100 millimeter skål. Sortera slumpmässigt 50 levande embryon vid 0,75 timmar efter befruktning och ta bort överskott av RO-vatten.När exponeringstiden har avslutats, ta bort embryon från inkubatorn. Överför alla levande embryon till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Aspirera kvarvarande exponeringslösning utan att aspirera några embryon.Tillsätt 500 mikroliter kyld 4% paraformaldehyd och blanda embryona genom inversion flera gånger. Låt embryona fixera och 4% paraformaldehyd över natten vid fyra grader celsius. Efter fixering av embryona aspireras 4% paraformaldehyd, återspendera embryona i 1X PBS och blanda genom mild pipettering i 30 sekunder.Använd en glaspipett och överför försiktigt fasta embryon till en RO-vattenfylld glasskål. Virvla försiktigt i 30 sekunder och upprepa denna tvätt en gång. Under ett stereomikroskop inställt på fem gånger förstoring decorenate embryona med sprutnålar.Använd nålspetsen och punktera korionen och skala den försiktigt bort från äggulan och cellmassan. Efter att embryona har dekorerats, använd en glasmikrokapillärpipett för att överföra upp till 25 intakta embryon till en immunohistokemikorg. Placera IHC-korgen i en 24-brunnsplatta.Aspirera sedan vattnet från varje brunn. Återsuspendera embryona i 500 mikroliter blockerande buffert per brunn, linda plattan med paraform och aluminiumfolie för att skydda den från ljus. Inkubera plattan vid fyra grader Celsius i fyra timmar på en orbital shaker vid 100 rpm.Efter inkubation, aspirera blockeringsbufferten från varje brunn. Byt ut den med 500 mikroliter primär antikroppslösning. Kom ihåg att inkubera en delmängd av vehikelkontrollembryon med blockeringsbufferten för att ta hänsyn till bakgrundsbrus.Packa om plattan och paraform- och aluminiumfolien och låt plattan inkubera vid fyra grader Celsius över natten på en orbital shaker. Följande dag ta bort den primära antikroppslösningen från varje brunn och ersätt den med 1x PBST. Tvätta varje brunn tre gånger med 1x PBST i fem minuter per tvätt på en orbital shaker.Aspirera 1x PBST från varje brunn och placera IHC-korgen i en petriskål i glas fylld med RO-vatten. Under ett vanligt stereomikroskop sorterar slumpmässigt intakta embryon i en 96-brunnsplatta som säkerställer ett embryo per brunn. Ta sedan bort allt RO-vatten från enskilda brunnar och tillsätt 200 mikroliter 1x PBS.Centrifugera plattan i tre minuter vid en G.Avbilda embryona med två gånger målet under överfört ljus och FITC. Välj autofokus för att säkerställa att kamerans fokus ligger på undersidan av plattan och kompenseras av den nedre tjockleken. Välj en FITC-våglängd med en exponeringstid på 100 millisekunder och ställ in autofokus på laser med en Z-förskjutning.Observera och bekräfta korrekt bildförvärv och flera brunnar innan du påbörjar plåtförvärv. Efter bildförvärv, utför dataanalys med hjälp av screeningsystemet med högt innehåll och en anpassad automatiserad bildanalysprocedur. Välj varje embryo på 96-brunnsplattan som ska analyseras för total yta och integrerad intensitet av fluorescens.Tabulera sedan datapunkterna och exportera dem från screeningsystemet med högt innehåll genom att mäta och välja öppen datalogg för att exportera data till ett kalkylblad. Ladda upp det exporterade kalkylarket till distributionspaketet för att sortera och summera data för varje brunn och filtrera efter brunnsnummer. Använd sedan rätt Excel-paket för att exportera summerade data till ett kalkylblad.Fördelningen och den integrerade intensiteten av 5-metylcytosinspecifik total yta bedömdes för zebrafiskembryon vid sex timmar efter befruktning. X-axeln visar exponering för antingen DMSO som fordon eller TDCIPP som positiv kontroll. Y-axeln betecknar relativ fluorescens.Tröskelvärdena skilde sig avsevärt från de vehikelbehandlade embryona, vilket framgår av den totala arean av 5-metylcytosin som detekterats i embryon och den integrerade intensiteten inom samma område som indikerar maximalt signal/brusförhållande. Det är oerhört viktigt att upprätthålla okets och cellmassans integritet för korrekt IHC-detektering. Denna metod är relativt okänslig och erbjuder endast RFU-data med relativt överflöd.Om kvantifiering krävs kan man följa upp med ett mer målinriktat tillvägagångssätt.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering och karakterisering av enskilda celler från zebrafiskembryon

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

Generation Parabiotic Zebrafish embryon genom kirurgisk Fusion utveckla Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

Affinity Märkning detektion av endogena receptorer från Zebrafish embryon

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing Motor Neuron Membran Potential i Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induktion av hypoxi i levande groda och zebrafiskembryon

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Single-cell Photoconversion i levande intakt zebrafiskar

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Visualization of Cellular Electrical Activity in Zebrafish Early Embryos and Tumors

Visualisering av cellulära elektrisk aktivitet i zebrafiskar tidiga embryon och tumörer

Bioelectricity, endogenous electrical signaling mediated by ion channels and pumps located on the cell membrane, plays important roles in signaling ...

Fast and Efficient Expression of Multiple Proteins in Avian Embryos Using mRNA Electroporation

Snabb och effektiv uttryck av flera proteiner i aviär embryon med hjälp av mRNA elektroporation

We report that mRNA electroporation permits fluorescent proteins to label cells in living quail embryos more quickly and broadly than DNA electroporation. ...

Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae

Hela mount immunohistokemi i zebrafisk embryon och larver

Immunohistochemistry is a widely used technique to explore protein expression and localization during both normal developmental and disease states. ...

Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography

Kvantifiering av etanolnivåer i zebrafiskembryon med hjälp av kromator

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) describe a highly variable continuum of ethanol-induced developmental defects, including facial dysmorphologies ...