Name: protocols for crispr/cas9 mutagenesis of the oriental fruit fly bactrocera dorsalis
Uploaded: 2022-09-28T12:40:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis at JoVE.com

Bu çalışma, Shenzhen Bilim ve Teknoloji Programı (Hibe No. KQTD20180411143628272) ve Shenzhen Dapeng Yeni Bölgesi'nin bilim teknolojisi inovasyonu ve endüstriyel gelişimi için özel fonlar (Hibe No. PT202101-02) tarafından desteklenmiştir.

1. Hedef tasarım ve sgRNA'nın in vitro sentezi
<ol><li>İlgilenilen hedef genlerin yapısını tahmin edin ve B. dorsalis genomunun biyoinformatik analizi yoluyla ekzonlar ve intronlar arasındaki sınırları belirleyin (burada kullanılan yazılım uygulamaları Malzeme Tablosunda listelenmiştir). NOT: BLAT20 , genomdaki potansiyel gen lokuslarını aramak için kullanıldı. Yüksek kaliteli RNA-seq okumaları (transkriptom),...

<ol>
	<li>Christenson, L. D., Foote, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+fruit+flies.">Biology of fruit flies.</a> Annual Review of Entomology. 5 (1), 171-192 (1960).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+assessment+of+the+economic+losses+caused+by+Bactrocera+dorsalis,+B.+cucurbitae+and+B.+tau+to+Guangdong+province.">The assessment of the economic losses caused by Bactrocera dorsalis, B. cucurbitae and B. tau to Guangdong province.</a> Plant Quarantine. 27 (3), 50-56 (2013).</li><li>Jin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+control+measures+and+drug+resistance+management+of+Bactrocera+dorsalis.">Chemical control measures and drug resistance management of Bactrocera dorsalis.</a> Agrochemicals. 60 (1), 1-5 (2021).</li><li>Yang, B., Liu, Y., Wang, B., Wang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfaction-based+behaviorally+manipulated+technology+of+pest+insects:+research+progress,+opportunities+and+challenges.">Olfaction-based behaviorally manipulated technology of pest insects: research progress, opportunities and challenges.</a> Bulletin of National Natural Science Foundation of China. 34 (4), 441-446 (2020).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li><li>Pyzocha, N. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+genome+editing+of+mammalian+cells.">RNA-guided genome editing of mammalian cells.</a> Gene Correction. , 269-277 (2014).</li><li>Weiss, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas+systems:+new+players+in+gene+regulation+and+bacterial+physiology.">CRISPR-Cas systems: new players in gene regulation and bacterial physiology.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 4, 37 (2014).</li><li>Doudna, J. A., Charpentier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+frontier+of+genome+engineering+with+CRISPR-Cas9.">The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.</a> Science. 346 (6213), 1258096 (2014).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Li, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heritable+gene+targeting+in+the+mouse+and+rat+using+a+CRISPR-Cas+system.">Heritable gene targeting in the mouse and rat using a CRISPR-Cas system.</a> Nature Biotechnology. 31 (8), 681-683 (2013).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR/Cas-mediated+genome+engineering.">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+mutant+Aedes+aegypti+mosquitoes+using+the+CRISPR/Cas9+system.">Generating mutant Aedes aegypti mosquitoes using the CRISPR/Cas9 system.</a> STAR protocols. 2 (2), 100432 (2021).</li><li>Zhu, G. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+toolkit+for+genome+editing+in+a+disease+vector,+Aedes+aegypti:+transgenic+lines+expressing+Cas9+and+single+guide+RNA+induce+efficient+mutagenesis.">Expanding the toolkit for genome editing in a disease vector, Aedes aegypti: transgenic lines expressing Cas9 and single guide RNA induce efficient mutagenesis.</a> The CRISPR Journal. 4 (6), 846-853 (2021).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9+in+locusts:+Successful+establishment+of+an+olfactory+deficiency+line+by+targeting+the+mutagenesis+of+an+odorant+receptor+co-receptor+(Orco).">CRISPR/Cas9 in locusts: Successful establishment of an olfactory deficiency line by targeting the mutagenesis of an odorant receptor co-receptor (Orco).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 27-35 (2016).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deletion+of+the+Bombyx+mori+odorant+receptor+co-receptor+(BmOrco)+impairs+olfactory+sensitivity+in+silkworms.">Deletion of the Bombyx mori odorant receptor co-receptor (BmOrco) impairs olfactory sensitivity in silkworms.</a> Insect Biochemistry &amp; Molecular Biology. 86, 58-67 (2017).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+somatic+and+germline+genome+engineering+of+Bactrocera+dorsalis+by+the+CRISPR/Cas9+system.">Efficient somatic and germline genome engineering of Bactrocera dorsalis by the CRISPR/Cas9 system.</a> Pest Management Science. 75 (7), 1921-1932 (2019).</li><li>Bai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-mediated+knockout+of+the+eye+pigmentation+gene+white+leads+to+alterations+in+colour+of+head+spots+in+the+oriental+fruit+fly,+Bactrocera+dorsalis.">CRISPR/Cas9-mediated knockout of the eye pigmentation gene white leads to alterations in colour of head spots in the oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis.</a> Insect Molecular Biology. 28 (6), 837-849 (2019).</li><li>Zheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+regularly+interspaced+short+palindromic+repeats+(CRISPR)/CRISPR-associated+9-mediated+mutagenesis+of+the+multiple+edematous+wings+gene+induces+muscle+weakness+and+flightlessness+in+Bactrocera+dorsalis+(Diptera:+Tephritidae).">Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated 9-mediated mutagenesis of the multiple edematous wings gene induces muscle weakness and flightlessness in Bactrocera dorsalis (Diptera: Tephritidae).</a> Insect Molecular Biology. 28 (2), 222-234 (2019).</li><li>Kent, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLAT-the+BLAST-like+alignment+tool.">BLAT-the BLAST-like alignment tool.</a> Genome Research. 12 (4), 656-664 (2002).</li><li>Kim, D., Langmead, B., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HISAT:+A+fast+spliced+aligner+with+low+memory+requirements.">HISAT: A fast spliced aligner with low memory requirements.</a> Nature Methods. 12 (4), 357-360 (2015).</li><li>Danecek, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twelve+years+of+SAMtools+and+BCFtools.">Twelve years of SAMtools and BCFtools.</a> Gigascience. 10 (2), (2021).</li><li>Kovaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+assembly+from+long-read+RNA-seq+alignments+with+StringTie2.">Transcriptome assembly from long-read RNA-seq alignments with StringTie2.</a> Genome Biology. 20 (1), 278 (2019).</li><li>. TransDecoder Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0">https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0</a> (2018)</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nature Biotechnology. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pheromone+antagonist+regulates+optimal+mating+time+in+the+moth+Helicoverpa+armigera.">A pheromone antagonist regulates optimal mating time in the moth Helicoverpa armigera.</a> Current Biology. 27 (11), 1610-1615 (2017).</li><li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sgRNAcas9:+a+software+package+for+designing+CRISPR+sgRNA+and+evaluating+potential+off-target+cleavage+sites.">sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites.</a> PloS One. 9 (6), 100448 (2014).</li><li>Zheng, Q. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+gene+deletion+and+replacement+using+the+CRISPR/Cas9+system+in+human+cells.">Precise gene deletion and replacement using the CRISPR/Cas9 system in human cells.</a> Biotechniques. 57 (3), 115-124 (2014).</li><li>Ren, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rectal+bacteria+produce+sex+pheromones+in+the+male+oriental+fruit+fly.">Rectal bacteria produce sex pheromones in the male oriental fruit fly.</a> Current Biology. 31 (10), 2220-2226 (2021).</li><li>Xiao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+CRISPR/Cas9-based+gene+editing+in+HIV-1/AIDS+therapy.">Application of CRISPR/Cas9-based gene editing in HIV-1/AIDS therapy.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 69 (2019).</li><li>El-Mounadi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles,+applications,+and+biosafety+of+plant+genome+editing+using+CRISPR-Cas9.">Principles, applications, and biosafety of plant genome editing using CRISPR-Cas9.</a> Frontiers in Plant Science. 11, 56 (2020).</li><li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li><li>Labun, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CHOPCHOP+v3:+expanding+the+CRISPR+web+toolbox+beyond+genome+editing.">CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).</li><li>Ai, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryo+microinjection+and+knockout+mutant+identification+of+CRISPR/Cas9+genome-edited+Helicoverpa+armigera+(H&#252;bner).">Embryo microinjection and knockout mutant identification of CRISPR/Cas9 genome-edited Helicoverpa armigera (H&#252;bner).</a> Journal of Visualized Experiments. (173), e62068 (2021).</li><li>Xie, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=sgRNAcas9:+a+software+package+for+designing+CRISPR+sgRNA+and+evaluating+potential+off-target+cleavage+sites.">sgRNAcas9: a software package for designing CRISPR sgRNA and evaluating potential off-target cleavage sites.</a> PloS One. 9 (6), 100448 (2014).</li><li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+of+Drosophila+with+the+CRISPR+RNA-guided+Cas9+nuclease.">Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease.</a> Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).</li><li>Zhu, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+of+juvenile+hormone+receptor,+Methoprene-tolerant,+induces+black+larval+phenotype+in+the+yellow+fever+mosquito,+Aedes+aegypti.">Knockout of juvenile hormone receptor, Methoprene-tolerant, induces black larval phenotype in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (43), 21501-21507 (2019).</li><li>Laohakieat, K., Isasawin, S., Thanaphum, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transformer-2+and+fruitless+characterisation+with+developmental+expression+profiles+of+sex-determining+genes+in+Bactrocera+dorsalis+and+B.+correcta.">The transformer-2 and fruitless characterisation with developmental expression profiles of sex-determining genes in Bactrocera dorsalis and B. correcta.</a> Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).</li><li>Gabrieli, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm-less+males+modulate+female+behaviour+in+Ceratitis+capitata+(Diptera:+Tephritidae).">Sperm-less males modulate female behaviour in Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae).</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 79, 13-26 (2016).</li></ol>

CRISPR / Cas9 sistemi en yaygın kullanılan gen düzenleme aracıdır ve gen threpy30, mahsul ıslahı31 ve gen fuksiyonlarının temel çalışmaları32 gibi çeşitli uygulamalara sahiptir. Bu sistem zaten çeşitli böcek türlerinde gen düzenleme için uygulanmış ve zararlılarda fonksiyonel gen çalışmaları için etkili bir araç olarak hizmet etmiştir. Burada sunduğumuz protokoller, kılavuz RNA'ların tasarımı ve sentezi, embriyolar...

Oryantal meyve sineği, Bactrocera dorsalis , guava, mango, Eugenia spp., Surinam kirazı, narenciye, yenidünya ve papaya1 dahil olmak üzere 150'den fazla meyve mahsulü türüne zarar veren kozmopolit bir böcek haşere türüdür. Sadece Guangdong Eyaletinde (Çin) meydana gelen hasarın 200 milyon yuan'ın üzerinde olduğu tahmin edilmektedir. Yetişkin dişiler yumurtalarını olgunlaşan veya olgunlaşmış meyvelerin derisinin altına yerleştirir, bu da meyvenin çürümesine ve yok olmasına neden olur, bu da meyve kalitesini ve mahsulün genel verimini azaltır2. Yetişkin meyve sinekleri büyük uçuş kapasitesine sahip olduklarından ve larvaları meyve derisine girdiğinden, haşere ile doğrudan temas gerektiren böcek öldürücüler tarlada zayıf performans gösterir. Ek olarak, insektisitlerin yaygın kullanımı, B. dorsalis'in çeşitli tarımsal kimyasallara karşı direncini arttırmış ve bu zararlı zararlıların kontrolünü daha da zorlaştırmıştır3. Bu nedenle, etkili ve çevre dostu haşere yönetimi stratejilerinin geliştirilmesine umutsuzca ihtiyaç duyulmaktadır.
Son zamanlarda, moleküler biyolojik araçların ve yüksek verimli dizileme teknolojilerinin geliştirilmesiyle, bilim adamları, çeşitli böcek zararlılarının önemli genlerinin (moleküler hedeflerin) işlevselliğini hedefleyen RNAi gibi çevre dostu haşere yönetimi stratejileri geliştirmeye çalışıyorlar. Zararlıların hayatta kalması ve üremesi için kritik olan genler, fonksiyonel gen çalışmaları yoluyla tanımlanabilir ve ayrıca özel olarak hedeflenmiş ve çevre dostu haşere yönetim araçlarının iyileştirilmesi için potansiyel moleküler hedefler olarak hizmet edebilir4. Bu tür stratejileri Oryantal meyve sineği kontrolüne uyarlamak için, fonksiyonel gen araştırması için etkili yöntemlere ihtiyaç vardır.
CRISPR / Cas (kümelenmiş düzenli aralıklarla kısa palindromik tekrarlar / CRISPR ile ilişkili) endonükleaz sistemi başlangıçta bakteri ve arkelerde keşfedildi ve bakteriyofajların enfekte edilmesiyle ortaya çıkanlar gibi yabancı hücre içi DNA'nın tanınması ve parçalanmasında rol oynayan adaptif bir mekanizma olduğu bulundu5. Tip II CRISPR sisteminde, Cas9 endonükleaz, küçük ilişkili RNA'lar (crRNA ve tracrRNA) tarafından izinsiz DNA 6,7,8'i parçalamak için yönlendirilir ve bugüne kadar 9,10,11,12 gen düzenleme için en yaygın kullanılan araçlardan biri haline gelmiştir. CRISPR / Cas9 sistemi, gen susturmanın yüksek verimliliği ve düşük maliyet gibi çeşitli avantajlara sahip olduğundan, Aedes aegypti13,14, Locusta migratoria15 ve Bombyx mori16 dahil olmak üzere çeşitli böcek türlerinde gen düzenleme için zaten uygulanmıştır. B. dorsalis'te, vücut rengi, kanat dimorfizmi ve cinsiyet tayini ile ilgili genler, CRISPR / Cas917,18,19 kullanılarak başarıyla nakavt edilmiştir. Bununla birlikte, bu böcekte CRISPR / Cas9 uygulaması için ayrıntılı prosedürler eksik kalmaktadır. Ayrıca, araştırmacılar tarafından B. dorsalis gen düzenlemesi için sağlanan bazı adımlar da çeşitlidir ve standardizasyona ihtiyaç duymaktadır. Örneğin, Cas9'un formlarıyayınlanmış referanslarda farklıydı 17,18,19.
Bu yazıda CRISPR/Cas9 sistemi kullanılarak B. dorsalis'in mutagenezisi için kılavuz RNA'ların tasarımı ve sentezi, embriyo toplama, embriyo enjeksiyonu, böcek yetiştirme ve mutant taraması dahil olmak üzere sistematik bir yöntem sunulmaktadır. Bu protokol, B. dorsalis'teki fonksiyonel gen çalışmalarıyla ilgilenen araştırmacılar için mutant sinekler üretmek için yararlı bir rehber görevi görecektir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6x DNA Loading Buffer</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>GH101-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial climate chamber</td>
			<td>ShangHai BluePard</td>
			<td>MGC-350P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxyPrep Genomic DNA Mini-Extraction Kit</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AP-MN-MS-GDNA-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAT</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For searching potential gene loci in the genome</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary Glass</td>
			<td>WPI&#160;</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf InjectMan 4 micromanipulator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>InjectMan 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A29377</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hisat2</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For aligning the transcriptome to the acquired gene loci</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGV</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For visualizing the results from Transdecoder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microgrinder</td>
			<td>NARISHIGE</td>
			<td>EG-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Olympus Microscope</td>
			<td>Olympus Corporation</td>
			<td>SZ2-ILST</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEASY-Blunt Cloning Kit</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>CB101-02</td>
			<td>https://www.transgenbiotech.com/data/upload/pdf/CB101_2022-07-14.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0290-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette cookbook 2018 P-97 &#38; P-1000 Micropipette Pullers</td>
			<td>Instrument Company&#160;</td>
			<td></td>
			<td>https://www.sutter.com/PDFs/cookbook.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeSTAR HS (Premix)</td>
			<td>Takara Biomedical Technology</td>
			<td>R040A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAMtools</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For generating the sorted bam files</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sgRNAcas9-AI</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>sgRNA design 
			http://123.57.239.141:8080/home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sutter Micropipette Puller Sutter&#160;</td>
			<td>Instrument Company&#160;</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trans2K DNA Marker</td>
			<td>TransGen Biotech</td>
			<td>BM101-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transdecoder</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>For combining the results of assemble transcripts and gene loci information 
			https://github.com/TransDecoder/TransDecoder/releases/tag/TransDecoder-v5.5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrueCut Cas9 Protein v2</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A36498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-trace biological detector</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Nanodrop 2000C</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocols for crispr/cas9 mutagenesis of the oriental fruit fly bactrocera dorsalis

Oryantal meyve sineği, Bactrocera dorsalis, narenciye ve dünya çapında 150'den fazla diğer meyve ürününe zarar veren oldukça istilacı ve uyarlanabilir bir haşere türüdür. Yetişkin meyve sinekleri büyük uçuş kapasitesine sahip olduklarından ve dişiler yumurtalarını meyve derilerinin altına bıraktıklarından, haşere ile doğrudan temas gerektiren böcek öldürücüler genellikle tarlada zayıf performans gösterir. Moleküler biyolojik araçların ve yüksek verimli dizileme teknolojisinin geliştirilmesiyle, birçok bilim adamı çevre dostu haşere yönetimi stratejileri geliştirmeye çalışmaktadır. Bunlar, çeşitli böcek zararlılarında, arama davranışında yer alan koku alma genleri gibi genleri (moleküler hedefleri) aşağı regüle eden veya susturan RNAi veya gen düzenleme tabanlı pestisitleri içerir. Bu stratejileri Oryantal meyve sineği kontrolüne uyarlamak için, fonksiyonel gen araştırması için etkili yöntemlere ihtiyaç vardır. B. dorsalis'in hayatta kalması ve üremesinde kritik fonksiyonlara sahip genler, gen yıkımı ve / veya susturulması için iyi moleküler hedefler olarak hizmet eder. CRISPR / Cas9 sistemi, özellikle böceklerde gen düzenleme için kullanılan güvenilir bir tekniktir. Bu yazıda B. dorsalis'in CRISPR/Cas9 mutagenezisi için kılavuz RNA'ların tasarımı ve sentezi, embriyo toplama, embriyo enjeksiyonu, böcek yetiştirme ve mutant taraması gibi sistematik bir yöntem sunulmaktadır. Bu protokoller, B. dorsalis'teki fonksiyonel gen çalışmaları ile ilgilenen araştırmacılar için mutant sinekler üretmek için yararlı bir rehber görevi görecektir.

Bu protokol, gDNA seçimi, embriyo toplama ve mikroenjeksiyon, böcek bakımı ve mutant taramasından elde edilen temsili sonuçlar da dahil olmak üzere CRISPR / Cas9 teknolojisini kullanarak B. dorsalis mutantlarının geliştirilmesi için ayrıntılı adımlar sunmaktadır.
Seçilen genin hedef bölgesinin örneği üçüncü ekzonda bulunur (Şekil 1C). Bu bölge oldukça korunmuştur ve sentetik gRNA (Şekil 1D) ve in vitro transkripsiyon ...

Watch this Scientific Journal Video about Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis at JoVE.com

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

Bu yazıda, Oryantal meyve sineği Bactrocera dorsalis'in CRISPR / Cas9 mutagenezi için adım adım protokoller sunulmaktadır. Bu standartlaştırılmış protokol tarafından sağlanan ayrıntılı adımlar, B. dorsalis'teki fonksiyonel gen çalışmaları için mutant sineklerin üretilmesi için yararlı bir rehber görevi görecektir.

CRISPR / Cas9 Oryantal Meyve Sineği Bactrocera dorsalis'in mutagenezi için protokoller

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...

Oryantal meyve sineği oldukça istilacı ve uyarlanabilir bir haşere türüdür. Fonksiyonel gen araştırması için etkili yöntemler, çevre dostu haşere yönetimi stratejileri geliştirmemize yardımcı olabilir. Bu yöntem yüksek verimlilik ve düşük maliyetlidir.Protokolümüz, oryantal meyve sineği araştırmacıları için mutant sinekler üretmek için yararlı bir rehber olarak hizmet edecektir. Başlamak için, ilgilenilen hedef genlerin yapısını tahmin edin ve Bactroceras dorsalis genomunun biyoinformatik analizi yoluyla ekzonlar ve intronlar arasındaki sınırları belirleyin. Tasarlanan sgRNA'yı üretmek için piyasada bulunan gRNA sentez kitini kullanın.gRNA ürününü nükleaz içermeyen suda yeniden askıya alın. UV görünür bir spektrofotometre kullanarak konsantrasyonu ölçün ve kullanmadan önce 80 santigrat derecede saklayın. B.dorsalis pupalarını% 55 bağıl nem, 26,5 santigrat derece ve 14:10 ışık / gün döngüsü yetiştirme koşuluyla plastik bir kafese yerleştirin.Yetişkinler kapandığında, su ile birlikte yiyecek olarak şeker ve maya karışımı sağlayın. Çoğu yetişkin, ortaya çıktıktan 10 gün sonra cinsel olgunluğa ulaşır. Dişilerin doğurganlığını artırmak için 30 ila 50 lüks ışıklı bir ışık standı kullanın, bu nedenle embriyo toplama verimliliğini artırın.Daha sonra, yumurtlama odasına, oda kapağından yaklaşık 1 ila 2 milimetre uzakta 200 örgülü bir gazlı bez yerleştirin. Mikroenjeksiyon kurulumu hazır olduğunda kafese yeni bir yumurtlama odası koyun. İnce bir ıslak fırça kullanarak embriyoları her 10 dakikada bir toplayın ve kendi kendine yapılan bir enjeksiyon plakasına hizalayın.Daha fazla kurumayı önlemek için enjeksiyon sırasında embriyoları halokarbon yağına batırın. Cas9 proteinini ve karşılık gelen sgRNA'yı her birinin mikrolitresi başına 300 nanogram konsantrasyonuna karıştırarak çalışma çözeltisini hazırlayın. Daha sonra, enjekte edilen embriyoları işaretlemek için uygun bir yol olarak hizmet etmek için karışıma 1 mikrolitre fenol kırmızısı ekleyin.SgRNA'nın bozulmasını önlemek için hazırlanan karışımı buz üzerine yerleştirin. Cam enjeksiyon iğnesini bir mikropipet çektirici kullanarak hazırlayın. Hava kabarcıkları sokmadan enjeksiyon iğnesine 3 mikrolitre karışım ekleyin.Ardından, iğneyi bir Microgrinder kullanarak açın ve kullanım kılavuzuna göre mikromanipülatöre bağlayın. Enjektör parametrelerini Pi olarak 500 hektopaskal olarak ayarlayın. Ti'den 0,5 saniyeye ve PC'den 200 hektopaskallara.Sıralı embriyoların bulunduğu plakayı objektif masaya yerleştirin. Ardından, mikropipet konumunu ince bir optik mikroskop altında ayarlayarak mikropipeti ve embriyoyu aynı düzleme ayarlayın. İğne ucunu embriyonun arka veya bitkisel kutbuna yerleştirin.Ardından, karışımları embriyoya iletmek için enjektörden pedala basın. Hafif kırmızımsı rengin ortaya çıkması, karışıma fenol kırmızısının eklenmesinden kaynaklanmaktadır. Enjeksiyon plakasını enjekte edilen embriyolarla yapay bir iklim odasına yerleştirin.36 saat sonra, taranmış larvaları ince uçlu bir fırça kullanarak larva diyetine aktarın. Larvaları daha fazla larva yumurtadan çıkmayana kadar günde üç veya dört kez toplayın. Daha sonra, olgun larvaları yavrulamak için ıslak kuma yerleştirin.Yavru aşaması 10 gün sürer. Yavrulaşmadan sonra, eklozyon başlamadan önce pupaları plastik bir kafese taşıyın. Genomik DNA'yı taze bir puparyumdan veya bireysel yetişkinlerin tek bir orta bacağından izole ettikten ve hedef alanı büyütmek için spesifik primerleri tasarladıktan sonra, metin makalesinde açıklanan döngü koşullarını takiben polimeraz zincir reaksiyonu veya PCR gerçekleştirin.Ardından, saflaştırılmış PCR ürünlerini sıralayın. Hedef bölgeye bitişik birden fazla örtüşen tepe noktasının tespit edilmesi, başarılı mutagenezi göstermektedir. Alt klonlama için, saflaştırılmış PCR ürünlerini künt uçlu bir vektörle karıştırın ve 15 dakika boyunca 25 santigrat derecede yağlayın.Ardından, trans-T1 hücreleri ekleyin ve 30 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, 500 mikrolitre LB ortamı ekleyin ve çalkalayarak 1 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Süpernatanı santrifüj yapın ve atın.Peleti yeniden askıya alın ve bir LB plakasına yayın. Gece boyunca inkübasyon için plakayı 37 santigrat dereceye yerleştirin. Daha sonra, mutantların genotipini doğrulamak için dizileme için bireysel bakteri kolonilerini seçin.Bu çalışmada, seçilen genin hedef bölgesinin örneği üçüncü ekzonda yer almaktadır. Hedef bölge oldukça korunmuştur ve in vitro transkripsiyon elde edilen sentetik gRNA ve gRNA için DNA şablonu için jel elektroforezi ile tek bir bant tespit edilmiştir. Burada mikroenjeksiyonlardan sonra B.dorsalis sağkalımı ve mutagenezisi gösterilmiştir.PCR ürünlerini sıraladıktan sonra, G0 bireylerinin% 80'i mozaik mutantlardır. Mutant taramasında, 8 baz çifti delesyonlu mutant, amino asit translasyonunun erken sonlandırılmasına neden oldu. İğneyi bir embriyonun arka bölgesine veya bitkisel kutbuna sokmak merkezi bir adımdır çünkü bu yumurtaların hayatta kalmasını doğrudan etkiler.Bu teknoloji, B.Dorsalis'teki gen fonksiyonlarının alanlarını incelemek için bir referans sağlar Bu yöntemle istedikleri mutantları hızlı bir şekilde yakalayabilirler.

Research

JoVE Journal

Biology

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Proteinlerin Yönetmen Evolution Mutagenez ve Fonksiyonel Seçim Protokolleri E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Isolation and Biophysical Study of Fruit Cuticles

İzolasyon ve Meyve cuticles biyofiziksel Çalışması

The cuticle, a hydrophobic protective layer on the aerial parts of terrestrial plants, functions as a versatile defensive barrier to various biotic and ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

CRISPR / Cas9 üzerinden Memeli Hücre Hatlarında Genomik Delesyonlar Üretimi

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Kıvılcım Susturma: CRISPR/Cas9 Zayıf Elektrikli Balıklarda Genom Düzenleme

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 Kullanarak Boş Mutasyonlar Oluşturmak için Culex Sivrisineklerinin Embriyolarının Hazırlanması ve EnjekteSi

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 Kullanarak Birincil İnsan B Hücrelerinin Genom Mühendisliği

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9 Gen Tedavisi Uygulamaları için Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Gen Düzenlemesi

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

CRISPR-Cas9-Mediated Precise Knock-In Edits in Zebrafish Hearts

Zebra Balığı Kalplerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Hassas Knock-In Düzenlemeleri

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) in animal models enable precise genetic manipulation for the study of physiological ...

Centromere-Associated Protein-E Gene Editing Using the CRISPR/Cas9 System

Generation of Centromere-Associated Protein-E CENP-E-/- Knockout Cell Lines using the CRISPR/Cas9 System

Author Spotlight: Establishing CENP-E Knockout HeLa Cells &#8211; A Novel Approach to Study Kinesin-7 CENP-E Biology and its Inhibitors

CRISPR/Cas9 Sistemini Kullanarak Sentromerle İlişkili Protein-E CENP-E-/- Nakavt Hücre Hatlarının Üretilmesi

The CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9 system has emerged as a powerful tool for precise and efficient gene editing ...