Name: en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos
Uploaded: 2022-07-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة بالمنح PID2019-104776RB-I00 و CB16/11/00399 (CIBER CV) من MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 إلى J. L. P. J.G.-B. تم تمويله من قبل برنامج Atracción de Talento من Comunidad de Madrid (2020-5ª / BMD-19729). تي جي سي. بتمويل من منظمة Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). نشكر وحدة CNIC للفحص المجهري والتصوير الديناميكي ، CNIC ، ICTS-ReDib ، بتمويل مشترك من MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 و FEDER "طريقة لجعل أوروبا" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). نشكر أيضا A. Galicia و L. Méndez على تربية الفئران. ودعمت تكلفة هذا المنشور جزئيا بأموال من الصندوق الأوروبي للتنمية الإقليمية. يتم دعم CNIC من قبل ISCIII و MCIN ومؤسسة Pro CNIC وهو مركز Severo Ochoa للتميز (منحة CEX2020-001041-S) بتمويل من MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033.

تمت الموافقة على الدراسات على الحيوانات من قبل لجنة أخلاقيات التجارب على الحيوانات التابعة للمركز الوطني للبحوث القلبية الوعائية (CNIC) ومجتمع مدريد (المرجع PROEX 155.7/20). تتوافق جميع الإجراءات المتعلقة بالحيوان مع توجيه الاتحاد الأوروبي 2010/63EU والتوصية 2007/526 / EC فيما يتعلق بحماية الحيوانات المس?...

<ol>
	<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells.">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).</li><li>Ivanovitch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=outflow+tract+heart+progenitors+arise+from+spatially+and+molecularly+distinct+regions+of+the+primitive+streak.">outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak.</a> PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).</li><li>Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+controlling+second+heart+field+development.">Signaling pathways controlling second heart field development.</a> Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).</li><li>Moorman, A. F., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+chamber+formation:+Development,+genes,+and+evolution.">Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution.</a> Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).</li><li>Timmerman, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+promotes+epithelial-mesenchymal+transition+during+cardiac+development+and+oncogenic+transformation.">Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation.</a> Genes &amp; Development. 18 (1), 99-115 (2004).</li><li>Luna-Zurita, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+a+Notch-dependent+mesenchymal+gene+program+and+Bmp2-driven+cell+invasiveness+regulates+murine+cardiac+valve+formation.">Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).</li><li>Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp2+and+Notch+cooperate+to+pattern+the+embryonic+endocardium.">Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium.</a> Development. 145 (13), (2018).</li><li>MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+cardiac+valve+development+and+disease.">Notch signaling in cardiac valve development and disease.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).</li><li>de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+tissue+interactions:+Notch+signaling+in+cardiac+development+and+disease.">Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease.</a> Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nfatc1+coordinates+valve+endocardial+cell+lineage+development+required+for+heart+valve+formation.">Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation.</a> Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).</li><li>Amack, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+of+EMT:+Lessons+from+live+in+vivo+imaging+of+embryonic+development.">Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development.</a> Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).</li><li>Cano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+controls+epithelial-mesenchymal+transitions+by+repressing+E-cadherin+expression.">The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).</li><li>Batlle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+is+a+repressor+of+E-cadherin+gene+expression+in+epithelial+tumour+cells.">The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).</li><li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-dependent+remodeling+of+adherens+junctions+protects+junctions+from+Snail-dependent+disassembly.">Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly.</a> Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).</li><li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+protein+Par3/Bazooka+follows+myosin-dependent+junction+repositioning.">Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning.</a> Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).</li><li>Jimenez-Amilburu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+cardiomyocyte+apicobasal+polarity+reveals+epithelial+to+mesenchymal-like+transition+during+cardiac+trabeculation.">In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation.</a> Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).</li><li>Davey, C. F., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+in+moving+cells:+Think+globally,+act+locally.">Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally.</a> Development. 144 (2), 187-200 (2017).</li><li>Grego-Bessa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+PTEN+and+the+PDK1+kinase+regulate+formation+of+the+columnar+neural+epithelium.">The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium.</a> Elife. 5, 12034 (2016).</li><li>Jones, C., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+in+vertebrates.">Planar cell polarity signaling in vertebrates.</a> Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).</li><li>Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+and+Vangl2+cooperate+in+the+initiation+of+planar+cell+polarity+in+the+mouse+embryo.">Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo.</a> Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).</li><li>Devenport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+morphodynamics:+Translating+planar+polarity+cues+into+polarized+cell+behaviors.">Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).</li><li>Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Notch1+activity+in+development:+Evidence+for+a+feedback+regulatory+loop.">Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop.</a> Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).</li><li>Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+node+and+notochordal+plate+in+gastrulating+mouse+embryos+using+scanning+electron+microscopy+and+whole+mount+immunofluorescence.">Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).</li><li>Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+avian+embryonic+valvular+progenitor+cells.">Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-B2+controls+VEGF-induced+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).</li><li>Yilmaz, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMT,+the+cytoskeleton,+and+cancer+cell+invasion.">EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).</li><li>Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+links+axes+of+spatial+dynamics+in+neural-tube+closure.">Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure.</a> Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).</li><li>Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis.">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).</li><li>Prados, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Bmp2+gain+causes+ectopic+EMT+and+promotes+cardiomyocyte+proliferation+and+immaturity.">Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity.</a> Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).</li><li>Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cardiac+cushion+development+by+hyaluronan.">Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan.</a> Experimental &amp; Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).</li><li>Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+blood+flow+on+cardiac+development.">Influence of blood flow on cardiac development.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).</li><li>Goddard, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+sculpt+developing+heart+valves+through+a+KLF2-WNT9B+paracrine+signaling+axis.">Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis.</a> Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).</li></ol>

الشغاف عبارة عن طبقة أحادية ظهارية تغطي السطح الداخلي لأنبوب القلب الجنيني بالكامل. أثناء تطور الصمام ، تخضع خلايا الشغاف في مناطق الصمامات المحتملة ل EMT ، وبالتالي تقوم خلايا الشغاف بتحويل وإعادة ترتيب هيكلها الخلوي للانفصال من الشغاف نحو الهلام القلبي. لقد حصلنا نحن وآخرون على البيانات...

القلب هو أول عضو وظيفي لجنين الثدييات. حول اليوم الجنيني (E) 7.5 في الفئران ، تشكل خلايا الأديم المتوسط قبل القلب الثنائية الهلال القلبي في الجانب البطني1. يحتوي الهلال القلبي على مجموعتين من الخلايا قبل القلبية التي تشمل أسلاف عضلة القلب والشغاف2. حوالي E8.0 ، تندمج السلائف القلبية في خط الوسط ، وتشكل أنبوب القلب البدائي الذي يتكون من نسيجين ظهاريين ، عضلة القلب الخارجية ، والشغاف الداخلي ، وهو بطانة متخصصة مفصولة بمصفوفة خارج الخلية تسمى هلام القلب. في وقت لاحق ، في E8.5 ، يخضع أنبوب القلب لحلقات يمنية. يحتوي القلب الحلقي على مناطق تشريحية مختلفة ذات توقيعات جزيئية محددة مثل قناة التدفق (OFT) والبطينين والقناة الأذينية البطينية (AVC)3. على الرغم من أن أنبوب القلب يتوسع في البداية في جانب التدفق من خلال إضافة الخلايا4 ، عند E9.5 ، يؤدي الانتشار القلبي المكثف إلى تضخم الغرف وإنشاء الشبكة التربيقية5. يحدث تكوين الصمام في AVC (الصمامات التاجية وثلاثية الشرف المستقبلية) وفي OFT (الصمامات الأبهرية والرئوية المستقبلية).
يلعب الشغاف أدوارا حاسمة في تطوير الصمام. تخضع خلايا الشغاف للانتقال الظهاري الوسيط (EMT) في AVC و OFT لتشكيل وسائد الشغاف ، وهي بنية تظهر في بداية تطور الصمام. تعمل مسارات الإشارات المختلفة على تنشيط هذه العملية ؛ في E9.5 في الفئران ، يعزز NOTCH المنشط في الشغاف استجابة ل BMP2 المشتق من عضلة القلب EMT الغازية لخلايا الشغاف في مناطق AVC و OFT من خلال تنشيط TGFβ2 و SNAIL (SNAI1) ، الذي يقمع مباشرة التعبير عن الكاديرين البطاني الوعائي (VE-cadherin) ، وهو مكون عبر الغشاء من تقاطعات الملتصقة (AJs) 6،7،8 . في OFT ، يتم تنشيط الشغاف لبدء EMT بواسطة FGF8 و BMP4 ، الذي يتم تنشيط تعبيره بواسطة NOTCH9،10،11،12.
يتضمن تقدم EMT ديناميكيات خلوية حيث تغير الخلايا شكلها ، وتكسر وتعيد تشكيل التقاطعات مع جيرانها ، وتتحلل ، وتبدأ في الهجرة13. تشمل هذه التغييرات إعادة تشكيل AJ والتفكيك التدريجي 14,15 ، وإشارات قطبية الخلية المستوية (PCP) ، وفقدان القطبية القاعدية (ABP) ، والانقباض القمي ، والتنظيم الهيكلي الخلوي 16,17. يشير ABP إلى توزيع البروتينات على طول المحور الأمامي الخلفي للخلية. في القلب النامي ، مطلوب تنظيم ABP في خلايا عضلة القلب لتطوير البطين18. يشير PCP إلى التوزيع المستقطب للبروتينات داخل الخلايا عبر مستوى الأنسجة وينظم التوزيع الخلوي. تتكون الظهارة ذات الهندسة المستقرة من خلايا سداسية الشكل ، حيث تتلاقى ثلاث خلايا فقط عند الرؤوس19،20،21،22. تنتج العمليات الخلوية المختلفة ، مثل انقسام الخلايا أو تبادل الجيران أو التفريغ الذي يحدث أثناء التشكل الطلائي ، زيادة في عدد الخلايا التي تتقارب على قمة وعدد الخلايا المجاورة التي تحتوي عليها خلية معينة22. يمكن تنظيم هذه السلوكيات الخلوية المتعلقة ب PCP من خلال مسارات إشارات مختلفة أو ديناميكيات الأكتين أو الاتجار داخل الخلايا23.
تم الحصول على البيانات الناتجة عن دراسة تطور الصمام في الفئران من المقاطع المستعرضة أو الإكليلية أو السهمية للقلوب الجنينية E8.5 و E9.5 ، حيث يظهر الشغاف كخط من الخلايا بدلا من كونه مجالا من الخلايا - يغطي الشغاف السطح الداخلي بالكامل لأنبوب القلب24. لا تسمح الأقسام الجنينية بتحليل PCP في شغاف أجنة الفئران. تسمح طريقتنا التجريبية الجديدة بتحليل توزيع خلايا الشغاف ، وتباين الخواص AJ ، وتحليل شكل الخلية الواحدة ، كما هو موضح في النتائج التمثيلية. هذا النوع من البيانات مطلوب لتحليل PCP ، جنبا إلى جنب مع وصف الجزيئات الأخرى المتعلقة ب PCP ، غير الموضحة في هذا التقرير. يتيح التألق المناعي الكامل ، وإعداد العينات المحددة واستخدام الفئران المعدلة وراثيا تحليل القطبية المستوية في الشغاف في بداية تطور الصمام في الفئران.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-OH-Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-6278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldheyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-10</td>
			<td>Dilute to 4% in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>FGP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VECadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-605-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4099,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides Superfrost PLUS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td>25 mm x 75 mm x 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>A4974,0500</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos

تعد دراسة الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء تطور قلب الثدييات أمرا ضروريا لمعالجة أمراض القلب الخلقية البشرية. يتضمن تطوير صمامات القلب البدائية الانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة (EMT) لخلايا الشغاف من القناة الأذينية البطينية (AVC) ومناطق تدفق القلب (OFT) استجابة لإشارات عضلة القلب والشغاف الاستقرائية المحلية. بمجرد أن تنفصل الخلايا وتغزو المصفوفة خارج الخلية (هلام القلب) الموجودة بين الشغاف وعضلة القلب ، تتشكل وسائد الشغاف البدائية (EC). تشير هذه العملية إلى أن الشغاف يجب أن يملأ الفجوات التي خلفتها الخلايا غير المبطنة ويجب أن يعيد تنظيم نفسه للتقارب (الضيق) أو التمدد (الإطالة) على طول المحور. وقد تورط البحث الحالي مسار قطبية الخلية المستوية (PCP) في تنظيم التوطين تحت الخلوي للعوامل المشاركة في هذه العملية. كلاسيكيا، تمت دراسة المراحل الأولية لتطور صمام القلب في المقاطع العرضية للقلوب الجنينية أو في النباتات خارج الجسم الحي AVC أو OFT المستزرعة على جل الكولاجين. تسمح هذه الأساليب بتحليل القطبية القاعدية ولكنها لا تسمح بتحليل سلوك الخلية داخل مستوى الظهارة أو التغيرات المورفولوجية للخلايا المهاجرة. هنا ، نعرض نهجا تجريبيا يسمح بتصور الشغاف في المناطق الصمامية كحقل مستو للخلايا. يوفر هذا النهج التجريبي الفرصة لدراسة PCP ، والطوبولوجيا المستوية ، والاتصال بين الخلايا داخل الشغاف في OFT و AVC أثناء تطوير الصمام. قد يساهم فك رموز الآليات الخلوية الجديدة المشاركة في تكوين صمام القلب في فهم أمراض القلب الخلقية المرتبطة بعيوب وسادة الشغاف.

تظهر البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام هذا البروتوكول أنه من الممكن إجراء en تصوير الوجه من الشغاف من AVC. كان الهدف الأول هو تحليل شكل خلية الشغاف أثناء تكوين الصمامات بدقة خلوية (الشكل 1). من أجل تسليط الضوء على خلايا الشغاف الفردية في E9.5 ، استخدمنا سلالتين من الفئران ال...

Watch this Scientific Journal Video about En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos at JoVE.com

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

كلاسيكيا ، تم تحليل الشغاف من بدائية الصمام الجنيني للفأر باستخدام أقسام مستعرضة أو إكليلية أو سهمية. يسمح نهجنا الجديد للوجه والتصوير ثنائي الأبعاد للشغاف في المناطق الصمامية بالقطبية المستوية وتحليل إعادة ترتيب الخلايا للشغاف أثناء تطوير الصمام.

En Face تحضير وسادة الشغاف لتحليل التشكل المستوي في أجنة الفئران

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

يسمح هذا البروتوكول بتحليل الشغاف البدائي في اتجاه مستو. يمكننا تحليل توزيع خلايا الشغاف، وتباين الخواص للأوامر الزجرية الأخرى، ووصف شكل خلية شغاف واحدة أثناء نمو الصمام. بالمقارنة مع أقسام الأنسجة الكلاسيكية ، يسمح تصوير الوجه الداخلي لمنطقة تجديد الصمام الداخلي بتحليل قطبية الخلايا المستوية وديناميكيات خلايا الشغاف أثناء تطور الصمام في الأجنة السليمة.يمكن استخدام هذه الطريقة لتعميق معرفة قطبية الخلايا المستوية أثناء تطور القلب. ابدأ بوضع الرحم المستأصل من الفئران الحامل الرحيمة في طبق بتري يحتوي على PBT المثلج. إزالة deciduye الفردية من الرحم تحت المجهر تشريح باستخدام ملقط غرامة.باستخدام ملاقط دقيقة ، قم بعمل شق في الجزء الأبيض من النفضي ، حيث يوجد الجنين. قم بإزالته برفق ، وتجنب السحب ، ونقل الأجنة إلى طبق بتري جديد مع PBT طازج باستخدام P-1000 مع قطع الطرف ، تاركا قطرا كبيرا بما يكفي لمرور الجنين دون أن ينكسر. للتنميط الجيني ، خذ قطعة صغيرة من كيس الصفار حوالي 0.5 ملليمتر مربع أو قطعة من الذيل من الطرف الخلفي ، عد خمسة إلى 10 سوميت باتجاه الرأس وهضمها في 100 ملليلتر من المخزن المؤقت المناسب.تحت غطاء الدخان ، انقل الأجنة إلى الثلج البارد 4٪ PFA في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 ملليلتر عند أربع درجات مئوية. ثبت الأجنة من ساعتين إلى ليلة وضحاها عند أربع درجات مئوية على مغذي. تحت غطاء الدخان ، قم بإزالة مثبت 4٪ PFA من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة دون لمس الأجنة.تخلص من PFA في حاوية مناسبة. اغسل الأجنة خمس مرات في PBT البارد لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. باستخدام ملقط ناعم ، قم بإزالة القلب ونقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد سعة 1.5 ملليلتر مع PBT جديد.استبدل PBT ب PBS Triton واغسل العينات ثلاث مرات ، خمس دقائق لكل منها ، في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري. استبدل PBS Triton بمحلول مانع يحتوي على PBS Triton بمصل بقري معطل بالحرارة بنسبة 10٪. احتضان من ساعتين إلى ليلة وضحاها عند أربع درجات مئوية على شاكر المداري.استبدل محلول الحجب بمحلول مانع يحتوي على جسم مضاد أولي بالتركيز المطلوب. احتضان بين عشية وضحاها على شاكر المداري عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية ، احتضان العينات لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر المداري.هذه الخطوة ضرورية لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي واحتفظ به عند أربع درجات مئوية ، حتى ثلاث تجارب مستقبلية. أضف أزيد الصوديوم إلى تركيز نهائي قدره 0.02٪ للحصول على أفضل حفظ.ثم اغسل الأجنة ثلاث مرات باستخدام PBS Triton لمدة ثلاث دقائق لكل منها. اغسل الأجنة باستخدام PBS Triton ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة واحتفظ بها على شاكر مداري عند أربع درجات مئوية. بعد الغسل الأخير ، أضف ملليلترا واحدا من محلول الحجب الذي يحتوي على جسم مضاد ثانوي مترافق مضان ضد الأنواع المضيفة للأجسام المضادة الأولية.ثم أضف DAPI إلى المحلول واحتضان الأجنة طوال الليل على شاكر مداري عند أربع درجات مئوية. بعد الحضانة الليلية عند أربع درجات مئوية ، احتضان الأجنة لمدة 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري. هذه الخطوة ضرورية لزيادة نسبة الإشارة إلى الضوضاء.كرر خطوات غسل PBS Triton كما هو مذكور في مخطوطة النص. ضع القلوب على طبق بتري 35 ملم يحتوي على برنامج تلفزيوني. باستخدام سلك التنغستن والملقط الناعم ، اعزل القناة الأذينية البطينية أو قناة التدفق وقطعها طوليا.قم بإعداد قسائم الغطاء ، والشرائح ، والملقط ، وماصة P-200 مع النصائح المناسبة ، ومنشفة ورقية ، وأي وسائط تثبيت مائية تعتمد على الجلسرين للتألق بدون DAPI. قم بلصق شريطين من الشريط على شريحة مفصولة ب 0.3 إلى 0.6 سم لإنشاء مساحة غرفة ثلاثية الأبعاد تسمح للعينات بالحفاظ على شكلها الأصلي دون سحقها. بعد ذلك ، باستخدام ما يقرب من 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت ، قم بإسقاط العينات بعناية على الشريحة بين شرائط الشريط باستخدام طرف ماصة P-200 مقطوع.استخدم مجهر تشريح لزيادة الدقة. باستخدام ملقط دقيق ، ضع العينات بحيث يكون الشغاف متجها لأعلى وعضلة القلب لأسفل على الشريحة. قم بإزالة PBS الزائد بمنشفة ورقية وتجنب لمس العينة.بعد ذلك ، جفف العينات لمدة دقيقة إلى دقيقتين في درجة حرارة الغرفة لجعل العينات تلتصق بالشريحة. أضف 40 ميكرولترا من وسائط التركيب المائية إلى الأنسجة. ضع الغطاء على قطعتي الشريط وقم بخفضه ببطء على المنديل بإبرة أو ملقط.تجنب خلق فقاعات الهواء. أغلق زلة الغطاء باستخدام قطرة واحدة من طلاء الأظافر على كل رأس من زلة الغطاء. بمجرد أن يجف طلاء الأظافر ، نظف وسائط التثبيت الزائدة من جوانب زلة الغطاء باستخدام منشفة ورقية ماصة.تجنب تحريك زلة الغطاء. أضف طلاء الأظافر على طول حواف الغطاء المنزلقة لإغلاقه بالكامل ، مما يمنع تبخر الوسائط المتصاعدة. باستخدام مجهر متحد البؤر عمودي أو مقلوب ، التقط صورا بتكبير 10X للعرض العام وعند 63X مع تكبير 3X للحصول على صور مفصلة.تم تحليل شكل خلية الشغاف أثناء تكوين الصمامات بدقة خلوية. خلايا مفردة أو استنساخ عدد قليل من الخلايا عبرت عن GFP في الشغاف. كان تعبير GFP ودمجه مع توطين VE-cadherin تحت الخلوي نهجا فعالا لدراسة العلاقة بين ديناميكيات AJ وتكوين الفيلوبوديا وخلايا ما قبل EMT ، حيث طورت هذه الخلايا نتوءات غشائية مع ذوبان AJs.أشارت الاختلافات في شدة تلطيخ VE-cadherin في الشغاف إلى وجود انقباض متباين الخواص في الشغاف الجنيني للقناة الأذينية البطينية في مراحل ما قبل الصمام. كان القلب كله ملطخا بالجسم المضاد VE-cadherin عند E8.5 و E9.5. في E8.5 ، يميل الشغاف في القناة الأذينية البطينية إلى أن يكون له تنظيم ظهاري مستقر ، ولم يتم اكتشاف الرؤوس التي شكلتها أكثر من أربع خلايا.في E9.5 ، لوحظت رؤوس تصل إلى ست خلايا تشكل هياكل تشبه الوردة ، على غرار التنظيم الخلوي الموصوف سابقا في الظهارة التي تخضع لإعادة ترتيب الخلايا النشطة ، مما يشير إلى أن شغاف القناة الأذينية البطينية كان يخضع لإعادة ترتيب خلوي ديناميكي أثناء تطوير الصمام. منحنى التعلم ضروري لتصبح خبيرا في هذه التقنية. علاوة على ذلك ، يوصى بشدة باستخدام ملقط سيادي وسلك التنغستن.اليوم ، اقتصر تصور الشغاف قبل الصمامات على المقاطع العرضية. يوفر نهجنا إمكانية دراسة سلوك الشغاف الصمامي الجنيني من وجهة نظر مستوية.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

التباين التصوير في أجنة الفئران عن طريق الموجات فوق الصوتية عالية التردد

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

إعداد الميتوكوندريا المخصب الكسور لتحليل التمثيل الغذائي في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

مستقر وكفاءة التحوير الوراثي للخلايا في الكبار ماوس V-SVZ لتحليل العصبية الخلايا الجذعية الذاتية الحكم والآثار لغير المتمتعة بالحكم الذاتي

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

طرق لنقل المترجمة على وجه التحديد من الخلايا أو الحمض النووي في Postimplantation المبكر أجنة الفئران

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

تحليل كمي للتعبير البروتين لدراسة النسب مواصفات في ماوس سابق للانغراس الأجنة

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

تحليل كمي الجامع-جبل الفلورة السكان السلف القلب في الأجنة الماوس

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

حركات للوفلر الأنسجة التالية عن طريق فوتوكونفيرسيون خلية في الجنين الزرد

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

في فيفو تصوير Morphogenesis وتر العضلات في المورفولوجية الخوادر

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

تصور بالعقدة ولوحة نوتوتشوردال في جاسترولاتينج الأجنة الماوس باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني المسح وكله جبل الفلورة

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

ووليماونت في الموقع التهجين للأجنة أستياناكس

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...