Name: en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos
Uploaded: 2022-07-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos at JoVE.com

Denne undersøgelse blev støttet af tilskud PID2019-104776RB-I00 og CB16/11/00399 (CIBER CV) fra MCIN/AEI/10.13039/501100011033 til J. L. P. J.G.-B. blev finansieret af Programa de Atracción de Talento fra Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. blev finansieret af Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Vi takker CNIC-enheden for mikroskopi og dynamisk billeddannelse, CNIC, ICTS-ReDib, medfinansieret af MCIN/AEI /10.13039/501100011033 og FEDER "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Vi takker også A. Galicien og L. Méndez for museopdræt. Udgifterne til denne publikation blev delvist støttet af midler fra Den Europæiske Fond for Regionaludvikling. CNIC er støttet af ISCIII, MCIN og Pro CNIC Foundation og er et Severo Ochoa Center of Excellence (tilskud CEX2020-001041-S) finansieret af MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033.

Dyreforsøg blev godkendt af Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) Animal Experimentation Ethics Committee og af Madrid Community (ref. PROEX 155.7/20). Alle dyreforsøg var i overensstemmelse med EU-direktiv 2010/63EU og henstilling 2007/526/EF om beskyttelse af dyr, der anvendes til forsøg og andre videnskabelige formål, der er vedtaget i spansk lovgivning i henhold til Real Decreto 1201/2005.
1. Obtention af AVC og / eller OFT'er (tilpasset fra Xiao et al.</stro...

<ol>
	<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells.">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).</li><li>Ivanovitch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=outflow+tract+heart+progenitors+arise+from+spatially+and+molecularly+distinct+regions+of+the+primitive+streak.">outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak.</a> PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).</li><li>Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+controlling+second+heart+field+development.">Signaling pathways controlling second heart field development.</a> Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).</li><li>Moorman, A. F., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+chamber+formation:+Development,+genes,+and+evolution.">Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution.</a> Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).</li><li>Timmerman, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+promotes+epithelial-mesenchymal+transition+during+cardiac+development+and+oncogenic+transformation.">Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation.</a> Genes &amp; Development. 18 (1), 99-115 (2004).</li><li>Luna-Zurita, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+a+Notch-dependent+mesenchymal+gene+program+and+Bmp2-driven+cell+invasiveness+regulates+murine+cardiac+valve+formation.">Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).</li><li>Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp2+and+Notch+cooperate+to+pattern+the+embryonic+endocardium.">Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium.</a> Development. 145 (13), (2018).</li><li>MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+cardiac+valve+development+and+disease.">Notch signaling in cardiac valve development and disease.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).</li><li>de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+tissue+interactions:+Notch+signaling+in+cardiac+development+and+disease.">Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease.</a> Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nfatc1+coordinates+valve+endocardial+cell+lineage+development+required+for+heart+valve+formation.">Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation.</a> Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).</li><li>Amack, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+of+EMT:+Lessons+from+live+in+vivo+imaging+of+embryonic+development.">Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development.</a> Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).</li><li>Cano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+controls+epithelial-mesenchymal+transitions+by+repressing+E-cadherin+expression.">The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).</li><li>Batlle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+is+a+repressor+of+E-cadherin+gene+expression+in+epithelial+tumour+cells.">The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).</li><li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-dependent+remodeling+of+adherens+junctions+protects+junctions+from+Snail-dependent+disassembly.">Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly.</a> Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).</li><li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+protein+Par3/Bazooka+follows+myosin-dependent+junction+repositioning.">Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning.</a> Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).</li><li>Jimenez-Amilburu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+cardiomyocyte+apicobasal+polarity+reveals+epithelial+to+mesenchymal-like+transition+during+cardiac+trabeculation.">In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation.</a> Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).</li><li>Davey, C. F., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+in+moving+cells:+Think+globally,+act+locally.">Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally.</a> Development. 144 (2), 187-200 (2017).</li><li>Grego-Bessa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+PTEN+and+the+PDK1+kinase+regulate+formation+of+the+columnar+neural+epithelium.">The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium.</a> Elife. 5, 12034 (2016).</li><li>Jones, C., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+in+vertebrates.">Planar cell polarity signaling in vertebrates.</a> Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).</li><li>Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+and+Vangl2+cooperate+in+the+initiation+of+planar+cell+polarity+in+the+mouse+embryo.">Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo.</a> Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).</li><li>Devenport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+morphodynamics:+Translating+planar+polarity+cues+into+polarized+cell+behaviors.">Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).</li><li>Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Notch1+activity+in+development:+Evidence+for+a+feedback+regulatory+loop.">Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop.</a> Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).</li><li>Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+node+and+notochordal+plate+in+gastrulating+mouse+embryos+using+scanning+electron+microscopy+and+whole+mount+immunofluorescence.">Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).</li><li>Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+avian+embryonic+valvular+progenitor+cells.">Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-B2+controls+VEGF-induced+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).</li><li>Yilmaz, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMT,+the+cytoskeleton,+and+cancer+cell+invasion.">EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).</li><li>Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+links+axes+of+spatial+dynamics+in+neural-tube+closure.">Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure.</a> Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).</li><li>Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis.">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).</li><li>Prados, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Bmp2+gain+causes+ectopic+EMT+and+promotes+cardiomyocyte+proliferation+and+immaturity.">Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity.</a> Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).</li><li>Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cardiac+cushion+development+by+hyaluronan.">Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan.</a> Experimental &amp; Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).</li><li>Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+blood+flow+on+cardiac+development.">Influence of blood flow on cardiac development.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).</li><li>Goddard, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+sculpt+developing+heart+valves+through+a+KLF2-WNT9B+paracrine+signaling+axis.">Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis.</a> Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).</li></ol>

Endokardiet er et epitelmonolag, der dækker hele den indre overflade af det embryonale hjerterør. Under ventiludvikling gennemgår endokardialceller i de potentielle valvulære regioner EMT, således omdanner endokardialceller og omarrangerer deres cytoskelet for at delaminere fra endokardiet mod hjertegeléen. Vi og andre har opnået relevante data om ventiludvikling i museembryoner ved at analysere tværgående sektioner af E8.5 og E9.5 embryonale hjerter, hvor endokardiet er vist som en række celler<sup class="xref...

Hjertet er det første funktionelle organ i et pattedyrembryo. Omkring fosterdag (E) 7,5 hos mus danner bilaterale prækardiale mesodermceller hjertehalvmånen i den ventrale side1. Hjertehalvmånen indeholder to populationer af prækardiale celler, der omfatter forfædre til myokardiet og endokardiet2. Omkring E8.0 smelter hjerteforstadierne sammen i midterlinjen og danner det primitive hjerterør bestående af to epitelvæv, det ydre myokardium og det indre endokardium, som er et specialiseret endotel adskilt af en ekstracellulær matrix ved navn hjertegelé. Senere, ved E8.5, gennemgår hjerterøret højre looping. Det loopede hjerte har forskellige anatomiske regioner med specifikke molekylære signaturer såsom udstrømningskanalen (OFT), ventriklerne og atrio-ventrikulær kanal (AVC)3. Selvom hjerterøret oprindeligt udvider sig ved sin tilstrømningsside gennem tilsætning af celler4, ved E9.5, resulterer intensiv hjerteproliferation i ballondannelse af kamrene og etablering af det trabekulære netværk5. Ventildannelse finder sted i AVC (fremtidige mitral- og tricuspidventiler) og i OFT (fremtidige aorta- og lungeventiler).
Endokardiet spiller afgørende roller i ventiludvikling. Endokardiale celler gennemgår epitel-mesenkymal overgang (EMT) i AVC og OFT for at danne endokardialpuderne, en struktur, der vises ved begyndelsen af ventiludviklingen. Forskellige signalveje aktiverer denne proces; ved E9.5 hos mus fremmer NOTCH aktiveret i endokardiet som reaktion på myokardieafledt BMP2 invasiv EMT af endokardieceller i AVC- og OFT-regionerne gennem aktivering af TGFβ2 og SNAIL (SNAI1), som direkte undertrykker ekspressionen af vaskulær endotelcadherin (VE-cadherin), en transmembrankomponent i klæbende kryds (AJ'er)6,7,8 . I OFT medieres aktivering af endokardiet for at initiere EMT af FGF8 og BMP4, hvis udtryk aktiveres af NOTCH 9,10,11,12.
Progression af EMT involverer cellulær dynamik, når celler ændrer form, bryder og genskaber kryds med deres naboer, delaminerer og begynder at migrere13. Disse ændringer omfatter AJ-ombygning og gradvis demontering af 14,15, plan cellepolaritet (PCP) signalering, tab af apico-basal polaritet (ABP), apikal indsnævring og cytoskeletal organisation 16,17. ABP refererer til fordelingen af proteiner langs den forreste bageste akse af en celle. I det udviklende hjerte kræves ABP-regulering i kardiomyocytter til ventrikulær udvikling18. PCP refererer til en polariseret fordeling af proteiner i celler på tværs af et vævs plan og regulerer cellulær fordeling; epitel med en stabil geometri består af sekskantformede celler, hvor kun tre celler konvergerer ved hjørnerne 19,20,21,22. Forskellige cellulære processer, såsom celledeling, naboudveksling eller delaminering, der forekommer under epitelmorfogenese, producerer en stigning i antallet af celler, der konvergerer på et toppunkt, og antallet af naboceller, som en given celle har22. Disse cellulære adfærd relateret til PCP kan reguleres af forskellige signalveje, actindynamik eller intracellulær handel23.
De data, der genereres ved at studere ventiludvikling hos mus, er opnået fra tværgående, koronale eller sagittale sektioner af E8.5 og E9.5 embryonale hjerter, hvor endokardiet vises som en cellelinje i stedet for som et felt af celler - endokardiet dækker hele den indre overflade af hjerterøret24. Embryonale sektioner tillader ikke analyse af PCP i endokardiet af museembryoner. Vores nye eksperimentelle metode tillader analyse af endokardialcellefordeling, AJ-anisotropi og enkeltcelleformanalyse, som vist i de repræsentative resultater. Denne type data er nødvendig for PCP-analyse sammen med beskrivelsen af andre molekyler relateret til PCP, som ikke er vist i denne rapport. Helmonteret immunfluorescens, specifik prøveforberedelse og anvendelse af genetisk modificerede mus muliggør plan polaritetsanalyse i endokardiet ved begyndelsen af ventiludvikling hos mus.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-OH-Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-6278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldheyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-10</td>
			<td>Dilute to 4% in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>FGP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VECadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-605-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4099,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides Superfrost PLUS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td>25 mm x 75 mm x 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>A4974,0500</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos

Undersøgelsen af de cellulære og molekylære mekanismer, der ligger til grund for udviklingen af pattedyrshjertet, er afgørende for at løse menneskelig medfødt hjertesygdom. Udviklingen af de primitive hjerteventiler involverer epitel-til-mesenkymal overgang (EMT) af endokardialceller fra atrioventrikulær kanal (AVC) og udstrømningskanal (OFT) regioner i hjertet som reaktion på lokale induktive myokardie- og endokardiale signaler. Når cellerne delaminerer og invaderer den ekstracellulære matrix (hjertegelé), der er placeret mellem endokardiet og myokardiet, dannes de primitive endokardiepuder (EC). Denne proces indebærer, at endokardiet skal udfylde hullerne efter de delaminerede celler og skal omorganisere sig for at konvergere (smal) eller strække sig (forlænges) langs en akse. Nuværende forskning har impliceret den plane cellepolaritet (PCP) vej til regulering af den subcellulære lokalisering af de faktorer, der er involveret i denne proces. Klassisk set er de indledende faser af udviklingen af hjerteklappen blevet undersøgt i tværsnit af embryonale hjerter eller i ex vivo AVC- eller OFT-eksplanter, der dyrkes på kollagengeler. Disse tilgange tillader analyse af apico-basal polaritet, men tillader ikke analyse af celleadfærd inden for epitelets plan eller af de morfologiske ændringer af migrerende celler. Her viser vi en eksperimentel tilgang, der tillader visualisering af endokardiet ved valvulogene regioner som et plant felt af celler. Denne eksperimentelle tilgang giver mulighed for at studere PCP, plan topologi og intercellulær kommunikation inden for endokardiet i OFT og AVC under ventiludvikling. Dekryptering af nye cellulære mekanismer involveret i hjerteventilmorfogenese kan bidrage til at forstå medfødt hjertesygdom forbundet med endokardiale pudefejl.

De data, der genereres ved hjælp af denne protokol, viser, at det er muligt at udføre en ansigtsbilleddannelse af AVC's endokardium. Det første mål var at analysere endokardiets celleform under dannelsen af ventilerne ved en cellulær opløsning (figur 1). For at fremhæve individuelle endokardieceller ved E9.5 brugte vi to transgene musestammer. (1) ROSAmT/mG er en tofarvet fluorescerende Cre reporter-allel (tdTomato/mT og EGFP/mG), hvis fl...

Watch this Scientific Journal Video about En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos at JoVE.com

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Klassisk er endokardiet af musens embryonale ventil primordium blevet analyseret ved hjælp af tværgående, koronale eller sagittale sektioner. Vores nye tilgang til en face, todimensionel billeddannelse af endokardiet i valvulogene regioner tillader plan polaritet og celleomlejringsanalyse af endokardiet under ventiludvikling.

En ansigt Endokardial pudepræparat til plan morfogeneseanalyse i museembryoner

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

Denne protokol tillader analyse af primitivt endokardium i en plan orientering. Vi kan analysere fordelingen af endokardiale celler, anisotropien af andre påbud og beskrive formen af en enkelt endokardiecelle under ventiludvikling. Sammenlignet med de klassiske vævsafsnit tillader en face-billeddannelsen af det indre ventilregenerative område analysen af plancellepolaritet og dynamik i endokardialceller under ventiludvikling i intakte embryoner.Denne metode kan bruges til at uddybe kendskabet til plancellepolaritet under kardioudvikling. Begynd med at placere livmoderen udskåret fra aflivede gravide mus i en petriskål, der indeholder iskold PBT. Fjern den enkelte løvfældende fra livmoderen under et dissekerende mikroskop ved hjælp af fine tang.Brug en fin pincet til at lave et snit i den hvide del af løvfælden, hvor embryoet er. Fjern det forsigtigt, undgå at trække, og overfør embryonerne til en ny petriskål med frisk PBT ved hjælp af en P-1000 med spidsen afskåret, hvilket efterlader en diameter, der er stor nok til, at et embryo kan passere igennem uden at bryde. Til genotypning skal du tage et lille stykke æggeblomme sac ca. 0,5 kvadrat millimeter eller et stykke af halen fra den bageste ende, tælle fem til 10 somitter mod hovedet og fordøje det i 100 ml af den passende buffer.Under røghætten overføres embryonerne til iskold 4% PFA i et to-milliliter mikrocentrifugerør ved fire grader Celsius. Fastgør embryonerne fra to timer til natten over ved fire grader Celsius på en nutator. Under røghætten fjernes 4% PFA-fikseringsmidlet fra mikrocentrifugerørene uden at røre embryonerne.Kassér PFA'en i en passende beholder. Embryonerne vaskes fem gange i kold PBT i 10 minutter ved stuetemperatur. Brug fine tang til at fjerne hjertet og overføre det til et nyt 1,5 milliliter mikrocentrifugerør med frisk PBT.Udskift PBT med PBS Triton, og prøverne vaskes tre gange, fem minutter hver, ved stuetemperatur på en orbital shaker. PBS Triton erstattes med en blokerende opløsning indeholdende PBS Triton med 10 % varmeinaktiveret bovint serum. Inkuberes fra to timer til natten over ved fire grader Celsius på en orbital shaker.Blokerende opløsning erstattes med blokerende opløsning indeholdende primært antistof i den ønskede koncentration. Inkuberes natten over på en orbital shaker ved fire grader Celsius. Efter inkubation natten over ved fire grader Celsius inkuberes prøverne i 1,5 timer ved stuetemperatur på en orbital shaker.Dette trin er afgørende for at øge signal-støj-forholdet. Fjern og hold den primære antistofopløsning ved fire grader Celsius, op til tre fremtidige eksperimenter. Tilsæt natriumazid til en endelig koncentration på 0,02% for den bedste konservering.Vask derefter embryonerne tre gange med PBS Triton i tre minutter hver. Vask embryonerne med PBS Triton tre gange i 30 minutter og hold dem på en orbital shaker ved fire grader Celsius. Efter den sidste vask tilsættes en milliliter blokerende opløsning indeholdende fluorescenskonjugeret sekundært antistof mod den primære antistofværtsart.Tilsæt derefter DAPI til opløsningen og inkuber embryonerne natten over på en orbital shaker ved fire grader Celsius. Efter inkubationen natten over ved fire grader Celsius inkuberes embryonerne i 1,5 timer ved stuetemperatur på en orbital shaker. Dette trin er vigtigt for at øge signal-støj-forholdet.Gentag PBS Triton-vasketrinnene som nævnt i tekstmanuskriptet. Sæt hjerterne på en 35 millimeter petriskål indeholdende PBS. Brug en wolframtråd og fine tang til at isolere atrioventrikulær kanal eller udstrømningskanalen og skære dem i længderetningen.Forbered dækglider, dias, tang, en P-200-pipette med de relevante spidser, et papirhåndklæde og ethvert vandigt glycerolbaseret monteringsmedium til fluorescens uden DAPI. Sæt to strimler tape på et dias adskilt af 0,3 til 0,6 centimeter for at skabe et 3D-rumrum, der gør det muligt for prøverne at bevare deres oprindelige form uden at knuse dem. Derefter slippes prøverne forsigtigt på diaset mellem båndstrimlerne ved hjælp af ca. 20 mikroliter buffer ved hjælp af en skåret P-200 pipettespids.Brug et dissekeringsmikroskop til at øge nøjagtigheden. Brug fine tang til at placere prøverne med endokardiet opad og myokardiet ned på diaset. Fjern overskydende PBS med et papirhåndklæde, og undgå at røre ved prøven.Tør derefter prøverne i et til to minutter ved stuetemperatur for at få prøverne til at klæbe til diaset. Tilsæt 40 mikroliter vandige baserede monteringsmedier til vævet. Placer dækselsedlen over de to stykker tape, og sænk den langsomt ned på vævet med en nål eller tang.Undgå at skabe luftbobler. Forsegl dækslikket med en dråbe neglelak på hvert toppunkt på dækslip. Når neglelakken er tør, skal du rengøre det overskydende monteringsmedie fra siderne af dækselet ved hjælp af et absorberende papirhåndklæde.Undgå at flytte dækselsedlen. Tilføj neglelak langs dækselkanterne for at forsegle det helt, hvilket forhindrer fordampning af monteringsmedier. Brug et opretstående eller et omvendt konfokalmikroskop til at tage billeder med 10X forstørrelse til generel visning og ved 63X med 3X zoom for detaljerede billeder.Endokardiets celleform blev analyseret under dannelsen af ventilerne ved en cellulær opløsning. Enkeltceller eller kloner af nogle få celler udtrykt GFP i endokardiet. GFP-ekspressionen og kombinationen med VE-cadherin subcellulær lokalisering var en effektiv tilgang til at studere forholdet mellem AJ-dynamik og filopodidannelsesdannelse og præ-EMT-celler, da disse celler udviklede membranfremspring, når AJ'er opløses.Forskelle i intensiteten af VE-cadherinfarvning i endokardiet indikerede tilstedeværelsen af anisotrop kontraktilitet i det embryonale endokardium i atrioventrikulær kanal ved præ-valvulære stadier. Hele hjertet var farvet med VE-cadherin antistof ved E8.5 og E9.5. Ved E8.5 havde endokardiet i den atrioventrikulære kanal en tendens til at have en stabil epitelorganisation, og hjørner dannet af mere end fire celler blev ikke detekteret.Ved E9.5 blev der observeret hjørner af op til seks celler, der dannede rosetlignende strukturer, svarende til den cellulære organisation, der tidligere er beskrevet i epitel, der gennemgår aktive celleomlejringer, hvilket tyder på, at det atrioventrikulære kanalendokardium gennemgik dynamisk cellulær omlejring under ventiludvikling. En indlæringskurve er nødvendig for at blive ekspert i denne teknik. Desuden anbefales det stærkt at bruge suveræne tang og wolframtråd.I dag var visualisering af præ-valvulært endokardium begrænset til tværsnit. Vores tilgang giver mulighed for at studere embryonal valvulær endokardiumadfærd fra et plant synspunkt.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Kontrast Imaging i museembryoer Brug højfrekvent ultralyd

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Forberedelse om mitokondriel berigede Brøker for Metabolic Analyse i<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Stabil og effektiv genetisk modificering af celler i Voksen Mouse V-SVZ til analyse af neural stamcelle selvstyrende og ikke-selvstændige effekter

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Metoder til Præcist Lokaliseret Overførsel af Celler eller DNA i Early implantation museembryoer

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analyse af Protein Expression til Studieinformationen Lineage Specification i Mouse præimplantationsperioden Embryoner

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitative hele-mount immunofluorescens analyse af Cardiac stamfader populationer i mus embryoner

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Følgende endokardial væv bevægelser via celle Photoconversion i zebrafisk Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Billeddannelse af muskel-sene morfogenese i Drosophila pupper

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount i Situ hybridisering til Astyanax embryoner

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...