Name: en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos
Uploaded: 2022-07-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos at JoVE.com

Deze studie werd ondersteund door subsidies PID2019-104776RB-I00 en CB16/11/00399 (CIBER CV) van MCIN/AEI/10.13039/501100011033 aan J. L. P. J.G.-B. werd gefinancierd door Programa de Atracción de Talento uit Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. werd gefinancierd door Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). We danken de CNIC Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, ICTS-ReDib, medegefinancierd door MCIN/AEI /10.13039/501100011033 en FEDER "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). We bedanken ook A. Galicia en L. Méndez voor het houden van muizen. De kosten van deze publicatie werden gedeeltelijk ondersteund door middelen van het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling. De CNIC wordt ondersteund door de ISCIII, de MCIN en de Pro CNIC Foundation en is een Severo Ochoa Center of Excellence (subsidie CEX2020-001041-S) gefinancierd door MCIN/AEI /10.13039/501100011033.

Dierstudies werden goedgekeurd door het Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) Animal Experimentation Ethics Committee en door de Gemeenschap van Madrid (ref. PROEX 155.7/20). Alle dierprocedures zijn in overeenstemming met EU-richtlijn 2010/63EU en Aanbeveling 2007/526/EG betreffende de bescherming van dieren die worden gebruikt voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden, vastgesteld in de Spaanse wetgeving onder Real Decreto 1201/2005.
1. Obtention va...

<ol>
	<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells.">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).</li><li>Ivanovitch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=outflow+tract+heart+progenitors+arise+from+spatially+and+molecularly+distinct+regions+of+the+primitive+streak.">outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak.</a> PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).</li><li>Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+controlling+second+heart+field+development.">Signaling pathways controlling second heart field development.</a> Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).</li><li>Moorman, A. F., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+chamber+formation:+Development,+genes,+and+evolution.">Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution.</a> Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).</li><li>Timmerman, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+promotes+epithelial-mesenchymal+transition+during+cardiac+development+and+oncogenic+transformation.">Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation.</a> Genes &amp; Development. 18 (1), 99-115 (2004).</li><li>Luna-Zurita, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+a+Notch-dependent+mesenchymal+gene+program+and+Bmp2-driven+cell+invasiveness+regulates+murine+cardiac+valve+formation.">Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).</li><li>Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp2+and+Notch+cooperate+to+pattern+the+embryonic+endocardium.">Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium.</a> Development. 145 (13), (2018).</li><li>MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+cardiac+valve+development+and+disease.">Notch signaling in cardiac valve development and disease.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).</li><li>de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+tissue+interactions:+Notch+signaling+in+cardiac+development+and+disease.">Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease.</a> Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nfatc1+coordinates+valve+endocardial+cell+lineage+development+required+for+heart+valve+formation.">Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation.</a> Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).</li><li>Amack, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+of+EMT:+Lessons+from+live+in+vivo+imaging+of+embryonic+development.">Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development.</a> Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).</li><li>Cano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+controls+epithelial-mesenchymal+transitions+by+repressing+E-cadherin+expression.">The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).</li><li>Batlle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+is+a+repressor+of+E-cadherin+gene+expression+in+epithelial+tumour+cells.">The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).</li><li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-dependent+remodeling+of+adherens+junctions+protects+junctions+from+Snail-dependent+disassembly.">Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly.</a> Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).</li><li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+protein+Par3/Bazooka+follows+myosin-dependent+junction+repositioning.">Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning.</a> Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).</li><li>Jimenez-Amilburu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+cardiomyocyte+apicobasal+polarity+reveals+epithelial+to+mesenchymal-like+transition+during+cardiac+trabeculation.">In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation.</a> Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).</li><li>Davey, C. F., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+in+moving+cells:+Think+globally,+act+locally.">Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally.</a> Development. 144 (2), 187-200 (2017).</li><li>Grego-Bessa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+PTEN+and+the+PDK1+kinase+regulate+formation+of+the+columnar+neural+epithelium.">The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium.</a> Elife. 5, 12034 (2016).</li><li>Jones, C., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+in+vertebrates.">Planar cell polarity signaling in vertebrates.</a> Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).</li><li>Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+and+Vangl2+cooperate+in+the+initiation+of+planar+cell+polarity+in+the+mouse+embryo.">Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo.</a> Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).</li><li>Devenport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+morphodynamics:+Translating+planar+polarity+cues+into+polarized+cell+behaviors.">Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).</li><li>Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Notch1+activity+in+development:+Evidence+for+a+feedback+regulatory+loop.">Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop.</a> Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).</li><li>Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+node+and+notochordal+plate+in+gastrulating+mouse+embryos+using+scanning+electron+microscopy+and+whole+mount+immunofluorescence.">Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).</li><li>Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+avian+embryonic+valvular+progenitor+cells.">Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-B2+controls+VEGF-induced+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).</li><li>Yilmaz, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMT,+the+cytoskeleton,+and+cancer+cell+invasion.">EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).</li><li>Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+links+axes+of+spatial+dynamics+in+neural-tube+closure.">Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure.</a> Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).</li><li>Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis.">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).</li><li>Prados, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Bmp2+gain+causes+ectopic+EMT+and+promotes+cardiomyocyte+proliferation+and+immaturity.">Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity.</a> Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).</li><li>Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cardiac+cushion+development+by+hyaluronan.">Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan.</a> Experimental &amp; Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).</li><li>Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+blood+flow+on+cardiac+development.">Influence of blood flow on cardiac development.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).</li><li>Goddard, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+sculpt+developing+heart+valves+through+a+KLF2-WNT9B+paracrine+signaling+axis.">Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis.</a> Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).</li></ol>

Het endocardium is een epitheliale monolaag die het gehele binnenoppervlak van de embryonale hartbuis bedekt. Tijdens de ontwikkeling van de klep ondergaan endocardcellen in de prospectieve valvulaire regio's EMT, dus endocardcellen transformeren en herschikken hun cytoskelet om te delamineren van het endocardium naar de cardiale gelei. Wij en anderen hebben relevante gegevens verkregen over de ontwikkeling van kleppen in muizenembryo's door transversale secties van E8.5 en E9.5 embryonale harten te analyseren, waarbij h...

Het hart is het eerste functionele orgaan van een zoogdierembryo. Rond embryonale dag (E) 7,5 bij muizen vormen bilaterale precardiale mesodermcellen de cardiale halve maan in de ventrale kant1. De cardiale halve maan bevat twee populaties van precardiale cellen die voorlopers van het myocardium en het endocardium2 omvatten. Rond E8.0 smelten de cardiale voorlopers samen in de middellijn en vormen de primitieve hartbuis bestaande uit twee epitheliale weefsels, het buitenste myocardium en het binnenste endogarium, een gespecialiseerd endotheel gescheiden door een extracellulaire matrix genaamd cardiale gelei. Later, bij E8.5, ondergaat de hartbuis een rechterwaartse lus. Het lusvormige hart heeft verschillende anatomische regio's met specifieke moleculaire handtekeningen zoals het uitstroomkanaal (OFT), de ventrikels en het atrio-ventrikelkanaal (AVC)3. Hoewel aanvankelijk de hartbuis aan de instroomzijde uitzet door de toevoeging van cellen4, resulteert intensieve hartproliferatie bij E9,5 in ballonvorming van de kamers en vestiging van het trabeculaire netwerk5. Klepvorming vindt plaats in de AVC (toekomstige mitralis- en tricuspidaliskleppen) en in de OFT (toekomstige aorta- en longkleppen).
Het endocardium speelt een cruciale rol in de ontwikkeling van kleppen. Endocardiale cellen ondergaan epitheliaal-mesenchymale overgang (EMT) in de AVC en OFT om de endocardiale kussens te vormen, een structuur die verschijnt bij het begin van de klepontwikkeling. Verschillende signaleringsroutes activeren dit proces; bij E9,5 bij muizen bevordert NOTCH geactiveerd in het endocardium als reactie op van myocards afgeleide BMP2 invasieve EMT van endocardcellen in de AVC- en OFT-regio's door activering van TGFβ2 en SNAIL (SNAI1), die de expressie van vasculair endotheel cadherine (VE-cadherine), een transmembraancomponent van adherens junctions (AJs)6,7,8 direct onderdrukt . In de OFT wordt de activering van het endocardium om EMT te initiëren gemedieerd door FGF8 en BMP4, waarvan de expressie wordt geactiveerd door NOTCH 9,10,11,12.
Progressie van EMT omvat cellulaire dynamiek als cellen van vorm veranderen, kruispunten met hun buren verbreken en opnieuw maken, delamineren en beginnen te migreren13. Deze veranderingen omvatten AJ-remodellering en geleidelijke demontagevan 14,15, planaire celpolariteit (PCP) signalering, het verlies van apico-basale polariteit (ABP), apicale vernauwing en cytoskeletale organisatie16,17. ABP verwijst naar de verdeling van eiwitten langs de voorste-achterste as van een cel. In het zich ontwikkelende hart is ABP-regulatie in cardiomyocyten vereist voor ventriculaire ontwikkeling18. PCP verwijst naar een gepolariseerde verdeling van eiwitten in cellen over het vlak van een weefsel en reguleert de cellulaire distributie; epithelia met een stabiele geometrie bestaan uit zeshoekige cellen, waarbij slechts drie cellen samenkomen op de hoekpunten 19,20,21,22. Verschillende cellulaire processen, zoals celdeling, burenuitwisseling of delaminatie die plaatsvindt tijdens epitheliale morfogenese, produceren een toename van het aantal cellen dat convergeert op een hoekpunt en het aantal naburige cellen dat een bepaalde cel heeft22. Dit cellulaire gedrag gerelateerd aan PCP kan worden gereguleerd door verschillende signaalroutes, actinedynamiek of intracellulaire handel23.
De gegevens die zijn gegenereerd bij het bestuderen van de klepontwikkeling bij muizen zijn verkregen uit transversale, coronale of sagittale secties van E8,5 en E9,5 embryonale harten, waar het endocardium wordt weergegeven als een lijn van cellen in plaats van als een veld van cellen - het endocardium bedekt het hele binnenoppervlak van de hartbuis24. Embryonale secties staan de analyse van PCP in het endocardium van muizenembryo's niet toe. Onze nieuwe experimentele methode maakt de analyse van endocardiale celverdeling, AJ-anisotropie en eencellige vormanalyse mogelijk, zoals weergegeven in de representatieve resultaten. Dit type gegevens is vereist voor PCP-analyse, samen met de beschrijving van andere moleculen die verband houden met PCP, niet weergegeven in dit rapport. Immunofluorescentie op de hele berg, specifieke monstervoorbereiding en het gebruik van genetisch gemodificeerde muizen maken planaire polariteitsanalyse in het endocardium mogelijk bij het begin van de klepontwikkeling bij muizen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-OH-Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-6278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldheyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-10</td>
			<td>Dilute to 4% in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>FGP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VECadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-605-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4099,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides Superfrost PLUS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td>25 mm x 75 mm x 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>A4974,0500</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos

De studie van de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de ontwikkeling van het hart van zoogdieren is essentieel om aangeboren hartaandoeningen bij de mens aan te pakken. De ontwikkeling van de primitieve hartkleppen omvat de epitheliale naar mesenchymale overgang (EMT) van endocardiale cellen uit het atrioventriculaire kanaal (AVC) en het uitstroomkanaal (OFT) van het hart als reactie op lokale inductieve myocardiale en endocardiale signalen. Zodra de cellen delamineren en de extracellulaire matrix (cardiale gelei) tussen het endocardium en het myocardium binnendringen, worden de primitieve endocardiale kussens (EC) gevormd. Dit proces houdt in dat het endocardium de gaten moet opvullen die de gedelamineerde cellen hebben achtergelaten en zichzelf moet reorganiseren om te convergeren (smal) of uit te breiden (verlengen) langs een as. Huidig onderzoek heeft de planaire celpolariteit (PCP) -route betrokken bij het reguleren van de subcellulaire lokalisatie van de factoren die bij dit proces betrokken zijn. Klassiek zijn de eerste fasen van de ontwikkeling van hartkleppen bestudeerd in doorsneden van embryonale harten of in ex vivo AVC- of OFT-explantaten gekweekt op collageengels. Deze benaderingen maken de analyse van apico-basale polariteit mogelijk, maar maken de analyse van celgedrag binnen het vlak van het epitheel of van de morfologische veranderingen van migrerende cellen niet mogelijk. Hier tonen we een experimentele benadering die de visualisatie van het endocardium in valvulogene regio's mogelijk maakt als een planair veld van cellen. Deze experimentele aanpak biedt de mogelijkheid om PCP, planaire topologie en intercellulaire communicatie binnen het endocardium van de OFT en AVC te bestuderen tijdens de ontwikkeling van de klep. Het ontcijferen van nieuwe cellulaire mechanismen die betrokken zijn bij de morfogenese van de hartklep kan bijdragen aan het begrijpen van aangeboren hartaandoeningen geassocieerd met endocardiale kussendefecten.

De gegevens die met behulp van dit protocol worden gegenereerd, laten zien dat het mogelijk is om en face imaging van het endocardium van de AVC uit te voeren. Het eerste doel was om de celvorm van het endocardium te analyseren tijdens de vorming van de kleppen met een cellulaire resolutie (figuur 1). Om individuele endocardcellen op E9.5 te benadrukken, gebruikten we twee transgene muizenstammen. (1) ROSAmT/mG is een tweekleurig fluorescerend Cre reporter-allel ...

Watch this Scientific Journal Video about En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos at JoVE.com

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Klassiek is het endocardium van de embryonale klep primordium van de muis geanalyseerd met behulp van transversale, coronale of sagittale secties. Onze nieuwe benadering voor en face, tweedimensionale beeldvorming van het endocardium in valvulogene gebieden maakt planaire polariteit en celherschikkingsanalyse van het endocardium mogelijk tijdens de ontwikkeling van de klep.

En Gezicht Endocardiale kussenvoorbereiding voor planaire morfogeneseanalyse bij muizenembryo's

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

Dit protocol maakt de analyse van primitief endocardium in een vlakke oriëntatie mogelijk. We kunnen de verdeling van endocardcellen analyseren, de anisotropie van andere injuncties, en de vorm van een enkele endocardiale cel beschrijven tijdens de ontwikkeling van de klep. Vergeleken met de klassieke weefselsecties maakt de enface-beeldvorming van het regeneratieve gebied van de binnenklep de analyse mogelijk van de polariteit van planaire cellen en de dynamiek van endocardcellen tijdens de ontwikkeling van kleppen in intacte embryo's.Deze methode kan worden gebruikt om de kennis van planaire celpolariteit tijdens cardio-ontwikkeling te verdiepen. Begin met het plaatsen van de baarmoeder die is weggesneden van geëuthanaseerde zwangere muizen in een petrischaal met ijskoude PBT. Verwijder de individuele deciduye uit de baarmoeder onder een ontleedmicroscoop met behulp van een fijne tang.Maak met een fijn pincet een incisie in het witte deel van de decidua, waar het embryo zich bevindt. Verwijder het voorzichtig, vermijd trekken en breng de embryo's over naar een nieuwe petrischaal met verse PBT met behulp van een P-1000 met de punt afgesneden, waardoor een diameter overblijft die groot genoeg is voor een embryo om door te gaan zonder te breken. Neem voor genotypering een klein stukje van de dooierzak van ongeveer 0,5 vierkante millimeter of een stuk van de staart vanaf het achterste uiteinde, tel vijf tot 10 somites naar de kop en verteer het in 100 milliliter van de juiste buffer.Breng de embryo's onder de zuurkast over naar ijskoude 4% PFA in een microcentrifugebuis van twee milliliter bij vier graden Celsius. Bevestig de embryo's van twee uur tot een nacht op vier graden Celsius op een nutator. Verwijder onder de zuurkast het 4% PFA-fixatief uit de microcentrifugebuizen zonder de embryo's aan te raken.Gooi de PFA weg in een geschikte container. Was de embryo's vijf keer in koude PBT gedurende 10 minuten op kamertemperatuur. Verwijder het hart met behulp van een fijne tang en breng het over naar een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 milliliter met verse PBT.Vervang PBT door PBS Triton en was de monsters driemaal, elk vijf minuten, bij kamertemperatuur op een orbitale schudder. Vervang PBS Triton door een blokkerende oplossing die PBS Triton bevat door 10% warmte-geïnactiveerd runderserum. Incubeer van twee uur tot 's nachts bij vier graden Celsius op een orbitale shaker.Vervang de blokkerende oplossing door een blokkerende oplossing die primair antilichaam bevat in de gewenste concentratie. Incubeer 's nachts op een orbitale shaker bij vier graden Celsius. Na nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius, incubeer de monsters gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur op een orbitale shaker.Deze stap is cruciaal om de signaal-ruisverhouding te verhogen. Verwijder en bewaar de primaire antilichaamoplossing op vier graden Celsius, tot drie toekomstige experimenten. Voeg natriumazide toe aan een eindconcentratie van 0,02% voor de beste conservering.Was vervolgens de embryo's driemaal met PBS Triton gedurende drie minuten elk. Was de embryo's driemaal met PBS Triton gedurende 30 minuten en bewaar ze op een orbitale shaker op vier graden Celsius. Voeg na de laatste wasbeurt één milliliter blokkerende oplossing toe die fluorescentie-geconjugeerd secundair antilichaam bevat tegen de primaire antilichaamgastheersoort.Voeg vervolgens DAPI toe aan de oplossing en incubeer de embryo's een nacht op een orbitale shaker bij vier graden Celsius. Na de nachtelijke incubatie bij vier graden Celsius, incubeer de embryo's gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur op een orbitale shaker. Deze stap is essentieel om de signaal-ruisverhouding te verhogen.Herhaal de PBS Triton-wasstappen zoals vermeld in het tekstmanuscript. Leg de hartjes op een petrischaaltje van 35 millimeter met PBS. Isoleer met behulp van een wolfraamdraad en een fijne tang het atrioventriculaire kanaal of het uitstroomkanaal en snijd ze in de lengterichting door.Bereid afdekslips, dia's, tangen, een P-200-pipet met de juiste tips, een papieren handdoek en alle waterige op glycerol gebaseerde montagemedia voor fluorescentie zonder DAPI. Plak twee stroken tape op een dia gescheiden door 0,3 tot 0,6 centimeter om een 3D-ruimteruimte te creëren waarmee de monsters hun oorspronkelijke vorm kunnen behouden zonder ze te verpletteren. Laat vervolgens met behulp van ongeveer 20 microliter buffer de monsters voorzichtig op de dia tussen de tapestroken vallen met behulp van een gesneden P-200 pipetpunt.Gebruik een ontleedmicroscoop om de nauwkeurigheid te verhogen. Plaats de monsters met behulp van een fijne tang met het endocardium naar boven en het myocardium naar beneden op de glijbaan. Verwijder overtollige PBS met een papieren handdoek en raak het monster niet aan.Droog de monsters vervolgens één tot twee minuten bij kamertemperatuur om de monsters aan de dia te laten kleven. Voeg 40 microliter waterige montagemedia toe aan het weefsel. Plaats de hoes over de twee stukjes tape en laat deze langzaam op het weefsel zakken met een naald of tang.Vermijd het creëren van luchtbellen. Sluit de afdekslip af met één druppel nagellak op elke hoekpunt van de afdekslip. Zodra de nagellak droog is, reinigt u de overtollige bevestigingsmedia van de zijkanten van de afdekslip met behulp van een absorberend keukenpapier.Vermijd het verplaatsen van de afdeksel. Voeg nagellak toe langs de randen van de afdekslip om deze volledig af te dichten, waardoor verdamping van montagemedia wordt voorkomen. Maak met behulp van een rechtopstaande of een omgekeerde confocale microscoop foto's met een vergroting van 10x voor algemeen zicht en met 63x met 3x zoom voor gedetailleerde beelden.De celvorm van het endocardium werd geanalyseerd tijdens de vorming van de kleppen met een cellulaire resolutie. Enkele cellen of klonen van enkele cellen brachten GFP tot expressie in het endocardium. De GFP-expressie en combinatie met VE-cadherine subcellulaire lokalisatie was een effectieve benadering om de relatie tussen AJ-dynamica en filopodiavorming en pre-EMT-cellen te bestuderen, omdat deze cellen membraanuitsteeksels ontwikkelden terwijl AJ's oplossen.Verschillen in de intensiteit van VE-cadherinekleuring in het endocardium wezen op de aanwezigheid van anisotrope contractiliteit in het embryonale endocardium van het atrioventriculaire kanaal in pre-valvulaire stadia. Het hele hart was gekleurd met VE-cadherine antilichaam op E8,5 en E9,5. Bij E8.5 had het endocardium van het atrioventriculaire kanaal de neiging om een stabiele epitheliale organisatie te hebben en hoekpunten gevormd door meer dan vier cellen werden niet gedetecteerd.Bij E9.5 werden hoekpunten van maximaal zes cellen waargenomen die rozetachtige structuren vormden, vergelijkbaar met de cellulaire organisatie die eerder werd beschreven in epitheliale onderging actieve celherschikkingen, wat suggereert dat het atrioventriculaire kanaal endocardium dynamische cellulaire herschikking onderging tijdens de ontwikkeling van de klep. Een leercurve is noodzakelijk om een expert te worden in deze techniek. Bovendien wordt het ten zeerste aanbevolen om soevereine tangen en wolfraamdraad te gebruiken.Tegenwoordig was de visualisatie van pre-valvulair endocardium beperkt tot doorsneden. Onze aanpak biedt de mogelijkheid om embryonaal valvulair endocardiumgedrag te bestuderen vanuit een planair oogpunt.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Contrast Imaging in muis embryo&#39;s met behulp van hoge-frequentie Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Voorbereiding van mitochondriaal verrijkte fracties voor Metabole analyse in<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Stabiele en efficiënte genetische modificatie van cellen in de Adult Mouse V-SVZ voor de Analyse van de neurale stamcel autonome en niet-autonome Effects

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Methoden voor Juist Gelokaliseerde Overdracht van cellen of DNA in Early postimplantatie muizenembryo&#39;s

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kwantitatieve Analyse van eiwitexpressie aan Lineage Specificatie studie in muizenmodellen preimplantatie embryo&#39;s

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kwantitatieve geheel-mount immunofluorescentie analyse van cardiale Progenitor populaties in muis embryo 's

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Volgende Endocardial weefsel mutaties via de cel Photoconversion in het Embryo van de zebravis

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Beeldvorming van de spier-pees morfogenese in Drosophila poppen

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualiseren van het knooppunt en de Notochordal plaat In Gastrulating muis embryo's met behulp van Scanning elektronen microscopie en hele Mount immunofluorescentie

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ hybridisatie voor Astyanax embryo 's

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...