Name: en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos
Uploaded: 2022-07-27T14:30:00
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Diese Studie wurde durch die Zuschüsse PID2019-104776RB-I00 und CB16/11/00399 (CIBER CV) von MCIN/AEI/10.13039/501100011033 an J. L. P. J.G.-B. unterstützt. wurde vom Programa de Atracción de Talento der Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729) finanziert. T.G.-C. wurde gefördert von Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Wir danken der CNIC Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, ICTS-ReDib, kofinanziert von MCIN/AEI /10.13039/501100011033 und FEDER "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Wir danken auch A. Galicia und L. Méndez für die Mäusehaltung. Die Kosten für diese Veröffentlichung wurden teilweise aus Mitteln des Europäischen Fonds für regionale Entwicklung getragen. Das CNIC wird vom ISCIII, dem MCIN und der Pro CNIC Foundation unterstützt und ist ein Severo Ochoa Center of Excellence (Stipendium CEX2020-001041-S), finanziert von MCIN/AEI /10.13039/501100011033.

Die Tierversuche wurden von der Ethikkommission für Tierversuche des Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) und von der Autonomen Gemeinschaft Madrid genehmigt (siehe PROEX 155.7/20). Alle Tierverfahren entsprechen der EU-Richtlinie 2010/63EU und der Empfehlung 2007/526/EG zum Schutz von Tieren, die für experimentelle und andere wissenschaftliche Zwecke verwendet werden, die im spanischen Recht unter dem Real Decreto 1201/2005 erlassen wurden.
1. Obtention von AVC u...

<ol>
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P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+and+Vangl2+cooperate+in+the+initiation+of+planar+cell+polarity+in+the+mouse+embryo.">Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo.</a> Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).</li><li>Devenport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+morphodynamics:+Translating+planar+polarity+cues+into+polarized+cell+behaviors.">Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).</li><li>Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Notch1+activity+in+development:+Evidence+for+a+feedback+regulatory+loop.">Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop.</a> Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).</li><li>Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+node+and+notochordal+plate+in+gastrulating+mouse+embryos+using+scanning+electron+microscopy+and+whole+mount+immunofluorescence.">Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).</li><li>Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+avian+embryonic+valvular+progenitor+cells.">Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-B2+controls+VEGF-induced+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).</li><li>Yilmaz, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMT,+the+cytoskeleton,+and+cancer+cell+invasion.">EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).</li><li>Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+links+axes+of+spatial+dynamics+in+neural-tube+closure.">Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure.</a> Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).</li><li>Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis.">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).</li><li>Prados, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Bmp2+gain+causes+ectopic+EMT+and+promotes+cardiomyocyte+proliferation+and+immaturity.">Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity.</a> Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).</li><li>Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cardiac+cushion+development+by+hyaluronan.">Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan.</a> Experimental &amp; Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).</li><li>Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+blood+flow+on+cardiac+development.">Influence of blood flow on cardiac development.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).</li><li>Goddard, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+sculpt+developing+heart+valves+through+a+KLF2-WNT9B+paracrine+signaling+axis.">Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis.</a> Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).</li></ol>

Das Endokard ist eine epitheliale Monoschicht, die die gesamte innere Oberfläche des embryonalen Herzschlauchs bedeckt. Während der Klappenentwicklung werden endokardiale Zellen in den prospektiven Klappenregionen EMT unterzogen, so dass endokardiale Zellen ihr Zytoskelett transformieren und neu anordnen, um vom Endokard in Richtung Herzgelee zu delaminatieren. Wir und andere haben relevante Daten über die Klappenentwicklung in Mausembryonen erhalten, indem wir transversale Abschnitte von E8.5 und E9.5 embryonalen Her...

Das Herz ist das erste funktionsfähige Organ eines Säugetierembryos. Um den embryonalen Tag (E) 7,5 bei Mäusen bilden bilaterale präkardiale Mesodermzellen die Herzsichel in der ventralen Seite1. Die Herzsichel enthält zwei Populationen von Präkardialzellen, die Vorläufer des Myokards und des Endokardsenthalten 2. Um E8.0 verschmelzen die Herzvorläufer in der Mittellinie und bilden die primitive Herzröhre, die aus zwei Epithelgeweben, dem äußeren Myokard und dem inneren Endokard besteht, das ein spezialisiertes Endothel ist, das durch eine extrazelluläre Matrix namens Herzgelee getrennt ist. Später, bei E8,5, erfährt der Herzschlauch eine Rechtsschleife. Das geschlungene Herz hat verschiedene anatomische Regionen mit spezifischen molekularen Signaturen wie den Ausflusstrakt (OFT), die Ventrikel und den atriventrikulären Kanal (AVC)3. Obwohl sich der Herzschlauch zunächst an seiner Zuflussseite durch die Hinzufügung von Zellen4 ausdehnt, führt die intensive Herzproliferation bei E9,5 zu einer Ballonbildung der Kammern und zur Etablierung des trabekulären Netzwerks5. Die Klappenbildung findet in der AVC (zukünftige Mitral- und Trikuspidalklappen) und in der OFT (zukünftige Aorten- und Pulmonalklappen) statt.
Das Endokard spielt eine entscheidende Rolle bei der Klappenentwicklung. Endokardzellen durchlaufen einen epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) im AVC und OFT, um die endokardialen Kissen zu bilden, eine Struktur, die zu Beginn der Klappenentwicklung auftritt. Verschiedene Signalwege aktivieren diesen Prozess; bei E9,5 bei Mäusen fördert NOTCH, das im Endokard als Reaktion auf myokardial abgeleitetes BMP2 aktiviert wird, die invasive EMT von Endokardzellen in den AVC- und OFT-Regionen durch Aktivierung von TGFβ2 und SNAIL (SNAI1), die die Expression von vaskulärem endothelialem Cadherin (VE-Cadherin), einer Transmembrankomponente von Adherens Junctions (AJs), direkt unterdrückt6,7,8 . Im OFT wird die Aktivierung des Endokards zur Initiierung von EMT durch FGF8 und BMP4 vermittelt, deren Expression durch NOTCH 9,10,11,12 aktiviert wird.
Das Fortschreiten von EMT beinhaltet die zelluläre Dynamik, wenn Zellen ihre Form ändern, Verbindungen mit ihren Nachbarn brechen und neu bilden, delaminieren und beginnen zu wandern13. Diese Veränderungen umfassen AJ-Remodellierung und allmähliche Demontage 14,15, planare Zellpolarität (PCP) -Signalisierung, den Verlust der apiko-basalen Polarität (ABP), apikale Konstriktion und zytoskelettale Organisation 16,17. ABP bezieht sich auf die Verteilung von Proteinen entlang der vorder-hinteren Achse einer Zelle. Im sich entwickelnden Herzen ist eine ABP-Regulation in Kardiomyozyten für die ventrikuläre Entwicklung erforderlich18. PCP bezieht sich auf eine polarisierte Verteilung von Proteinen innerhalb von Zellen über die Ebene eines Gewebes und reguliert die zelluläre Verteilung; Epithelien mit einer stabilen Geometrie bestehen aus sechseckigen Zellen, in denen nur drei Zellen an den Eckpunkten 19,20,21,22 zusammenlaufen. Verschiedene zelluläre Prozesse, wie Zellteilung, Nachbaraustausch oder Delaminierung, die während der epithelialen Morphogenese auftreten, führen zu einer Zunahme der Anzahl der Zellen, die auf einem Scheitelpunkt konvergieren, und der Anzahl der benachbarten Zellen, die eine bestimmte Zelle hat22. Diese zellulären Verhaltensweisen im Zusammenhang mit PCP können durch verschiedene Signalwege, Aktindynamik oder intrazellulären Transport reguliert werden23.
Die Daten, die zur Untersuchung der Klappenentwicklung bei Mäusen generiert wurden, stammen aus transversalen, koronalen oder sagittalen Abschnitten von E8,5- und E9,5-embryonalen Herzen, wobei das Endokard als Zelllinie und nicht als Zellfeld dargestellt wird - das Endokard bedeckt die gesamte innere Oberfläche der Herzröhre24. Embryonale Schnitte erlauben keine Analyse von PCP im Endokard von Mausembryonen. Unsere neuartige experimentelle Methode ermöglicht die Analyse der endokardialen Zellverteilung, der AJ-Anisotropie und der Einzelzellformanalyse, wie in den repräsentativen Ergebnissen gezeigt. Diese Art von Daten ist für die PCP-Analyse erforderlich, zusammen mit der Beschreibung anderer Moleküle, die mit PCP verwandt sind und in diesem Bericht nicht aufgeführt sind. Die vollständige Immunfluoreszenz, die spezifische Probenvorbereitung und der Einsatz gentechnisch veränderter Mäuse ermöglichen eine planare Polaritätsanalyse im Endokard zu Beginn der Klappenentwicklung bei Mäusen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-OH-Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-6278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldheyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-10</td>
			<td>Dilute to 4% in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>FGP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VECadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-605-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4099,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides Superfrost PLUS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td>25 mm x 75 mm x 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>A4974,0500</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos

Die Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen, die der Entwicklung des Säugetierherzens zugrunde liegen, ist unerlässlich, um angeborene Herzfehler beim Menschen zu behandeln. Die Entwicklung der primitiven Herzklappen beinhaltet den epithelialen zu mesenchymalen Übergang (EMT) von Endokardzellen aus den Regionen des atrioventrikulären Kanals (AVC) und des Ausflusstrakts (OFT) des Herzens als Reaktion auf lokale induktive myokardiale und endokardiale Signale. Sobald die Zellen delaminieren und in die extrazelluläre Matrix (Herzgelee) eindringen, die sich zwischen dem Endokard und dem Myokard befindet, bilden sich die primitiven endokardialen Kissen (EC). Dieser Prozess impliziert, dass das Endokard die Lücken füllen muss, die von den delaminierten Zellen hinterlassen werden, und sich neu organisieren muss, um entlang einer Achse zu konvergieren (zu verengen) oder sich zu verlängern (zu verlängern). Aktuelle Forschungen haben den planaren Zellpolaritätsweg (PCP) mit der Regulierung der subzellulären Lokalisation der an diesem Prozess beteiligten Faktoren in Verbindung gebracht. Klassischerweise wurden die Anfangsphasen der Herzklappenentwicklung in Querschnitten embryonaler Herzen oder in ex vivo AVC- oder OFT-Explantaten untersucht, die auf Kollagengelen kultiviert wurden. Diese Ansätze erlauben die Analyse der apiko-basalen Polarität, nicht jedoch die Analyse des Zellverhaltens innerhalb der Epithelebene oder der morphologischen Veränderungen wandernder Zellen. Hier zeigen wir einen experimentellen Ansatz, der die Visualisierung des Endokards in valvulogenen Regionen als planares Zellfeld ermöglicht. Dieser experimentelle Ansatz bietet die Möglichkeit, PCP, planare Topologie und interzelluläre Kommunikation innerhalb des Endokards von OFT und AVC während der Klappenentwicklung zu untersuchen. Die Entschlüsselung neuer zellulärer Mechanismen, die an der Morphogenese der Herzklappe beteiligt sind, kann zum Verständnis angeborener Herzfehler beitragen, die mit endokardialen Kissendefekten einhergehen.

Die mit diesem Protokoll generierten Daten zeigen, dass es möglich ist, eine Gesichtsbildgebung des Endokards des AVC durchzuführen. Das erste Ziel war es, die Zellform des Endokards während der Bildung der Klappen mit zellulärer Auflösung zu analysieren (Abbildung 1). Um einzelne Endokardzellen bei E9.5 hervorzuheben, verwendeten wir zwei transgene Mausstämme. (1) ROSAmT/mG ist ein zweifarbiges fluoreszierendes Cre-Reporter-Allel (tdTomato/mT und ...

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En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Klassischerweise wurde das Endokard des embryonalen Klappenprimordiums der Maus anhand transversaler, koronaler oder sagittaler Schnitte analysiert. Unser neuartiger Ansatz für die enface, zweidimensionale Bildgebung des Endokards in valvulogenen Regionen ermöglicht eine planare Polaritäts- und Zellumlagerungsanalyse des Endokards während der Klappenentwicklung.

En Gesicht Endokardkissenpräparation für die planare Morphogeneseanalyse in Mausembryonen

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Analyse von primitivem Endokard in planarer Orientierung. Wir können die Verteilung von Endokardzellen, die Anisotropie anderer Verfügungen analysieren und die Form einer einzelnen Endokardzelle während der Klappenentwicklung beschreiben. Im Vergleich zu den klassischen Gewebeschnitten ermöglicht die flächendeckende Bildgebung der inneren klappenregenerativen Region die Analyse der planaren Zellpolarität und Dynamik endokardialer Zellen während der Klappenentwicklung in intakten Embryonen.Diese Methode kann verwendet werden, um das Wissen über die planare Zellpolarität während der Kardioentwicklung zu vertiefen. Beginnen Sie, indem Sie die Gebärmutter, die von euthanasierten trächtigen Mäusen entfernt wurde, in eine Petrischale legen, die eiskaltes PBT enthält. Entfernen Sie das einzelne Deziduye aus der Gebärmutter unter einem Seziermikroskop mit einer feinen Pinzette.Machen Sie mit einer feinen Pinzette einen Schnitt im weißen Teil der Decidua, wo sich der Embryo befindet. Entfernen Sie es vorsichtig, vermeiden Sie das Ziehen und übertragen Sie die Embryonen in eine neue Petrischale mit frischem PBT mit einem P-1000 mit abgeschnittener Spitze, so dass ein Durchmesser groß genug ist, damit ein Embryo durchgehen kann, ohne zu brechen. Für die Genotypisierung nehmen Sie ein kleines Stück des Dottersacks von etwa 0,5 Quadratmillimetern oder ein Stück des Schwanzes vom hinteren Ende, zählen Sie fünf bis 10 Somiten in Richtung Kopf und verdauen Sie es in 100 Milliliter des entsprechenden Puffers.Unter dem Abzug werden die Embryonen in einem Zwei-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen bei vier Grad Celsius auf eiskalte 4% PFA überführt. Fixieren Sie die Embryonen von zwei Stunden bis Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Nutator. Entfernen Sie unter dem Abzug das 4% PFA-Fixiermittel aus den Mikrozentrifugenröhrchen, ohne die Embryonen zu berühren.Entsorgen Sie die PFA in einem geeigneten Behälter. Waschen Sie die Embryonen fünfmal in kaltem PBT für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das Herz mit einer feinen Pinzette und geben Sie es in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit frischem PBT.Ersetzen Sie PBT durch PBS Triton und waschen Sie die Proben dreimal jeweils fünf Minuten bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler. PBS Triton wird durch eine Blockierungslösung ersetzt, die PBS Triton mit 10%hitzeinaktiviertem Rinderserum enthält. Inkubieren Sie von zwei Stunden bis über Nacht bei vier Grad Celsius auf einem Orbitalschüttler.Ersetzen Sie die Blockierlösung durch eine Blocklösung, die einen primären Antikörper in der gewünschten Konzentration enthält. Über Nacht auf einem Orbitalshaker bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach einer nächtlichen Inkubation bei vier Grad Celsius inkubieren Sie die Proben 1,5 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler.Dieser Schritt ist entscheidend, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen. Entfernen und halten Sie die primäre Antikörperlösung bei vier Grad Celsius, bis zu drei zukünftige Experimente. Natriumazid zu einer Endkonzentration von 0,02% für beste Konservierung hinzufügen.Dann waschen Sie die Embryonen dreimal mit PBS Triton für jeweils drei Minuten. Waschen Sie die Embryonen dreimal 30 Minuten lang mit PBS Triton und halten Sie sie auf einem Orbitalschüttler bei vier Grad Celsius. Nach dem letzten Waschgang wird ein Milliliter Blockierungslösung mit fluoreszenzkonjugierten sekundären Antikörpern gegen die primäre Antikörperwirtsspezies hinzugefügt.Dann fügen Sie DAPI zur Lösung hinzu und inkubieren die Embryonen über Nacht auf einem Orbitalschüttler bei vier Grad Celsius. Nach der nächtlichen Inkubation bei vier Grad Celsius inkubieren Sie die Embryonen für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Orbitalshaker. Dieser Schritt ist unerlässlich, um das Signal-Rausch-Verhältnis zu erhöhen.Wiederholen Sie die PBS Triton Waschschritte, wie im Textmanuskript erwähnt. Legen Sie die Herzen auf eine 35-Millimeter-Petrischale mit PBS. Isolieren Sie mit einem Wolframdraht und einer feinen Pinzette den atrioventrikulären Kanal oder den Ausflusstrakt und schneiden Sie sie längs.Bereiten Sie Deckblätter, Objektträger, Pinzetten, eine P-200-Pipette mit den entsprechenden Spitzen, ein Papiertuch und alle wässrigen Montagemedien auf Glycerinbasis für die Fluoreszenz ohne DAPI vor. Kleben Sie zwei Streifen Klebeband auf einen Objektträger, der 0,3 bis 0,6 Zentimeter voneinander entfernt ist, um einen 3D-Raum zu schaffen, der es den Proben ermöglicht, ihre ursprüngliche Form zu bewahren, ohne sie zu zerquetschen. Anschließend lassen Sie die Proben mit etwa 20 Mikrolitern Puffer vorsichtig mit einer geschnittenen P-200-Pipettenspitze auf den Objektträger zwischen den Bandstreifen fallen.Verwenden Sie ein Seziermikroskop, um die Genauigkeit zu erhöhen. Legen Sie die Proben mit einer feinen Pinzette mit dem Endokard nach oben und dem Myokard nach unten auf den Objektträger. Entfernen Sie überschüssiges PBS mit einem Papiertuch und vermeiden Sie es, die Probe zu berühren.Dann trocknen Sie die Proben für ein bis zwei Minuten bei Raumtemperatur, damit die Proben am Objektträger haften. Fügen Sie dem Gewebe 40 Mikroliter wässrige Montagemedien hinzu. Legen Sie den Bezug über die beiden Klebebandstücke und senken Sie ihn langsam mit einer Nadel oder einer Pinzette auf das Gewebe.Vermeiden Sie es, Luftblasen zu erzeugen. Versiegeln Sie den Abdeckschein mit einem Tropfen Nagellack auf jedem Scheitelpunkt des Abdeckschlickers. Sobald der Nagellack trocken ist, reinigen Sie die überschüssigen Montagemedien von den Seiten des Abdecktuchs mit einem saugfähigen Papiertuch.Vermeiden Sie es, den Deckschein zu bewegen. Fügen Sie Nagellack entlang der Abdeckungskanten hinzu, um sie vollständig abzudichten und die Verdunstung der Montagemedien zu verhindern. Nehmen Sie mit einem aufrechten oder inversen konfokalen Mikroskop Bilder mit 10-facher Vergrößerung für die Gesamtansicht und mit 63-fachem Zoom für detaillierte Bilder auf.Die Zellform des Endokards wurde während der Bildung der Klappen mit zellulärer Auflösung analysiert. Einzelne Zellen oder Klone einiger weniger Zellen exprimierten GFP im Endokard. Die GFP-Expression und Kombination mit der subzellulären VE-Cadherin-Lokalisation war ein effektiver Ansatz, um die Beziehung zwischen AJ-Dynamik und Filopodienbildung und prä-EMT-Zellen zu untersuchen, da diese Zellen Membranvorsprünge entwickelten, wenn sich AJs auflösen.Unterschiede in der Intensität der VE-Cadherin-Färbung im Endokard zeigten das Vorhandensein einer anisotropen Kontraktilität im embryonalen Endokard des atrioventrikulären Kanals in prävalvulären Stadien. Das ganze Herz wurde mit VE-Cadherin-Antikörpern bei E8.5 und E9.5 angefärbt. Bei E8,5 neigte das Endokard des atrioventrikulären Kanals dazu, eine stabile Epithelorganisation zu haben, und von mehr als vier Zellen gebildete Eckpunkte wurden nicht nachgewiesen.Bei E9.5 wurden Eckpunkte von bis zu sechs Zellen beobachtet, die rosettenartige Strukturen bildeten, ähnlich der zuvor beschriebenen zellulären Organisation, die in Epithelzellen beschrieben wurde, die aktive Zellumlagerungen durchlaufen, was darauf hindeutet, dass das atrioventrikuläre Kanalendokard während der Klappenentwicklung eine dynamische zelluläre Umlagerung erfuhr. Eine Lernkurve ist notwendig, um ein Experte in dieser Technik zu werden. Darüber hinaus wird dringend empfohlen, Sovereign Pinzette und Wolframdraht zu verwenden.Heute war die Visualisierung des prävalvulären Endokards auf Querschnitte beschränkt. Unser Ansatz bietet die Möglichkeit, das embryonale valvuläre Endokardverhalten aus planarer Sicht zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Contrast Imaging in Maus Embryonen Verwendung von Hochfrequenz-Ultraschall

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Vorbereitung der Mitochondrial angereicherten Fraktionen für die Stoffwechselanalyse in<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Stabile und effiziente genetische Veränderung von Zellen in der erwachsenen Maus V-SVZ für die Analyse von Neural Stem Cell Autonome und Nicht autonome Effekte

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Methoden für die genau zu lokalisieren Übertragung von Zellen oder DNA in frühen Postimplantations Maus Embryonen

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Quantitative ganze-Mount Immunfluoreszenz Analyse der kardialen Vorläuferzellen Populationen in Mausembryonen

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Folgenden endokardialen Gewebe Bewegungen über Zelle Ladungszustand des Zebrafish Embryos

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Bildgebung der Muskel-Sehnen-Morphogenese in Drosophila Puppen

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridisierung für Astyanax Embryonen

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...