Name: en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos
Uploaded: 2022-07-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי מענקים PID2019-104776RB-I00 ו- CB16/11/00399 (CIBER CV) מ- MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 ל- J. L. P. J.G.-B. מומן על ידי Programa de Atracción de Talento מקומונידד דה מדריד (2020-5ª/BMD-19729). ט.ג.-ג. מומן על ידי Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). אנו מודים ליחידת CNIC של מיקרוסקופיה והדמיה דינמית, CNIC, ICTS-ReDib, במימון משותף של MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 ו- FEDER "דרך להפוך את אירופה" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). אנו מודים גם לא' גליציה ול' מנדס על גידול העכברים. עלות פרסום זה נתמכה בחלקה על ידי כספים מהקרן האירופית לפיתוח אזורי. ה- CNIC נתמך על ידי ISCIII, MCIN וקרן Pro CNIC והוא מרכז מצוינות של Severo Ochoa (מענק CEX2020-001041-S) במימון MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033.

מחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת האתיקה לניסויים בבעלי חיים של המרכז הלאומי לניסויים בבעלי חיים (Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares) ועל ידי קהילת מדריד (ref. PROEX 155.7/20). כל נהלי בעלי החיים תאמו את הנחיית האיחוד האירופי 2010/63EU והמלצה 2007/526/EC בנוגע להגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות ניסוייות ומדעיות א?...

<ol>
	<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells.">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).</li><li>Ivanovitch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=outflow+tract+heart+progenitors+arise+from+spatially+and+molecularly+distinct+regions+of+the+primitive+streak.">outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak.</a> PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).</li><li>Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+controlling+second+heart+field+development.">Signaling pathways controlling second heart field development.</a> Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).</li><li>Moorman, A. F., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+chamber+formation:+Development,+genes,+and+evolution.">Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution.</a> Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).</li><li>Timmerman, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+promotes+epithelial-mesenchymal+transition+during+cardiac+development+and+oncogenic+transformation.">Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation.</a> Genes &amp; Development. 18 (1), 99-115 (2004).</li><li>Luna-Zurita, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+a+Notch-dependent+mesenchymal+gene+program+and+Bmp2-driven+cell+invasiveness+regulates+murine+cardiac+valve+formation.">Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).</li><li>Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp2+and+Notch+cooperate+to+pattern+the+embryonic+endocardium.">Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium.</a> Development. 145 (13), (2018).</li><li>MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+cardiac+valve+development+and+disease.">Notch signaling in cardiac valve development and disease.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).</li><li>de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+tissue+interactions:+Notch+signaling+in+cardiac+development+and+disease.">Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease.</a> Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nfatc1+coordinates+valve+endocardial+cell+lineage+development+required+for+heart+valve+formation.">Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation.</a> Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).</li><li>Amack, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+of+EMT:+Lessons+from+live+in+vivo+imaging+of+embryonic+development.">Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development.</a> Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).</li><li>Cano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+controls+epithelial-mesenchymal+transitions+by+repressing+E-cadherin+expression.">The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).</li><li>Batlle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+is+a+repressor+of+E-cadherin+gene+expression+in+epithelial+tumour+cells.">The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).</li><li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-dependent+remodeling+of+adherens+junctions+protects+junctions+from+Snail-dependent+disassembly.">Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly.</a> Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).</li><li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+protein+Par3/Bazooka+follows+myosin-dependent+junction+repositioning.">Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning.</a> Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).</li><li>Jimenez-Amilburu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+cardiomyocyte+apicobasal+polarity+reveals+epithelial+to+mesenchymal-like+transition+during+cardiac+trabeculation.">In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation.</a> Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).</li><li>Davey, C. F., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+in+moving+cells:+Think+globally,+act+locally.">Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally.</a> Development. 144 (2), 187-200 (2017).</li><li>Grego-Bessa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+PTEN+and+the+PDK1+kinase+regulate+formation+of+the+columnar+neural+epithelium.">The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium.</a> Elife. 5, 12034 (2016).</li><li>Jones, C., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+in+vertebrates.">Planar cell polarity signaling in vertebrates.</a> Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).</li><li>Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+and+Vangl2+cooperate+in+the+initiation+of+planar+cell+polarity+in+the+mouse+embryo.">Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo.</a> Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).</li><li>Devenport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+morphodynamics:+Translating+planar+polarity+cues+into+polarized+cell+behaviors.">Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).</li><li>Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Notch1+activity+in+development:+Evidence+for+a+feedback+regulatory+loop.">Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop.</a> Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).</li><li>Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+node+and+notochordal+plate+in+gastrulating+mouse+embryos+using+scanning+electron+microscopy+and+whole+mount+immunofluorescence.">Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).</li><li>Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+avian+embryonic+valvular+progenitor+cells.">Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-B2+controls+VEGF-induced+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).</li><li>Yilmaz, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMT,+the+cytoskeleton,+and+cancer+cell+invasion.">EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).</li><li>Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+links+axes+of+spatial+dynamics+in+neural-tube+closure.">Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure.</a> Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).</li><li>Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis.">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).</li><li>Prados, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Bmp2+gain+causes+ectopic+EMT+and+promotes+cardiomyocyte+proliferation+and+immaturity.">Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity.</a> Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).</li><li>Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cardiac+cushion+development+by+hyaluronan.">Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan.</a> Experimental &amp; Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).</li><li>Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+blood+flow+on+cardiac+development.">Influence of blood flow on cardiac development.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).</li><li>Goddard, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+sculpt+developing+heart+valves+through+a+KLF2-WNT9B+paracrine+signaling+axis.">Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis.</a> Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).</li></ol>

אנדוקרדיום הוא מונולאייר אפיתל המכסה את כל פני השטח הפנימיים של צינור הלב העוברי. במהלך התפתחות המסתם, תאים אנדוקרדיאליים באזורים הוולוולאריים הפרוספקטיביים עוברים EMT, וכך תאים אנדוקרדיאליים הופכים ומסדרים מחדש את השלד הציטוסקולרי שלהם כדי להתפרק מהאנדוקרדיום לכיוון ג'לי הלב. אנו ואחרי?...

הלב הוא האיבר הפונקציונלי הראשון של עובר יונקים. בסביבות היום העוברי (E) 7.5 בעכברים, תאי מזודרם קדם-לבביים דו-צדדיים יוצרים את הסהר הלבבי בצד הגחוני1. הסהר הלבבי מכיל שתי אוכלוסיות של תאים קדם-לבביים הכוללים אבות של שריר הלב והאנדוקרדיום2. בסביבות E8.0, מבשרי הלב מתמזגים בקו האמצע, ויוצרים את צינור הלב הפרימיטיבי המורכב משתי רקמות אפיתל, שריר הלב החיצוני והאנדוקרדיום הפנימי, שהוא אנדותל מיוחד המופרד על ידי מטריצה חוץ-תאית בשם ג'לי לב. מאוחר יותר, ב- E8.5, צינור הלב עובר לולאה ימינה. ללב הלולאה יש אזורים אנטומיים שונים עם חתימות מולקולריות ספציפיות כגון מערכת הזרימה (OFT), החדרים והתעלה האטריו-חדרית (AVC)3. למרות שבתחילה צינור הלב מתרחב בצד הזרימה שלו באמצעות תוספת של תאים4, ב- E9.5, התפשטות לב אינטנסיבית גורמת לבלון של החדרים והקמת הרשת הטרבקולרית5. היווצרות המסתם מתרחשת ב- AVC (שסתומים מיטרליים וטריקוספידים עתידיים) וב- OFT (שסתומים אבי העורקים והריאתי העתידיים).
האנדוקרדיום ממלא תפקידים מכריעים בהתפתחות המסתם. תאים אנדוקרדיאליים עוברים מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT) ב-AVC וב-OFT כדי ליצור את כריות הלב האנדוקרדיאליות, מבנה המופיע בתחילת התפתחות המסתם. מסלולי איתות שונים מפעילים את התהליך הזה; ב-E9.5 בעכברים, NOTCH המופעל באנדוקרדיום בתגובה ל-BMP2 שמקורו בשריר הלב מקדם EMT פולשני של תאים אנדוקרדיאליים באזורי AVC ו-OFT באמצעות הפעלה של TGFβ2 ו-SNAIL (SNAI1), אשר מדכא ישירות את הביטוי של קדהרין אנדותל וסקולרי (VE-cadherin), מרכיב טרנס-ממברני של צמתים דבקים (AJs)6,7,8 . ב- OFT, הפעלת האנדוקרדיום להפעלת EMT מתווכת על ידי FGF8 ו- BMP4, שהביטוי שלהם מופעל על ידי NOTCH 9,10,11,12.
התקדמות ה-EMT כרוכה בדינמיקה תאית כאשר תאים משנים צורה, שוברים ויוצרים מחדש צמתים עם שכניהם, מתפרקים ומתחילים לנדוד13. שינויים אלה כוללים שיפוץ AJ ופירוק הדרגתישל 14,15, איתות קוטביות תאים מישורית (PCP), אובדן קוטביות אפיקו-בסיסית (ABP), כיווץ אפיקלי וארגון ציטוסקטלי16,17. ABP מתייחס להתפלגות החלבונים לאורך הציר הקדמי-אחורי של התא. בלב המתפתח, ויסות ABP בקרדיומיוציטים נדרש להתפתחות החדר18. PCP מתייחס להתפלגות מקוטבת של חלבונים בתוך תאים על פני מישור הרקמה ומווסת את התפלגות התאים; אפיתליה עם גיאומטריה יציבה מורכבת מתאים בצורת משושה, כאשר רק שלושה תאים מתכנסים בקודקודים 19,20,21,22. תהליכים תאיים שונים, כגון חלוקת תאים, חילופי שכנים או דלמינציה המתרחשת במהלך מורפוגנזה אפיתליאלית, מייצרים עלייה במספר התאים המתכנסים על קודקוד ובמספר התאים השכנים שישלתא נתון 22. התנהגויות תאיות אלה הקשורות ל-PCP ניתנות לוויסות על-ידי מסלולי איתות שונים, דינמיקה של אקטין או סחר תוך-תאי23.
הנתונים שהופקו בחקר התפתחות המסתם בעכברים התקבלו מקטעים רוחביים, קורונליים או סגיטליים של לבבות עובריים E8.5 ו- E9.5, שבהם האנדוקרדיום מוצג כקו של תאים במקום כשדה של תאים - האנדוקרדיום מכסה את כל פני השטח הפנימיים של צינור הלב24. חלקים עובריים אינם מאפשרים ניתוח של PCP באנדוקרדיום של עוברי עכבר. שיטת הניסוי החדשנית שלנו מאפשרת ניתוח של התפלגות תאים אנדוקרדיאליים, אניזוטרופיה של AJ וניתוח צורת תא בודד, כפי שמוצג בתוצאות המייצגות. סוג זה של נתונים נדרש לניתוח PCP, יחד עם תיאור של מולקולות אחרות הקשורות ל- PCP, שאינן מוצגות בדוח זה. אימונופלואורסצנציה שלמה, הכנת דגימה ספציפית ושימוש בעכברים מהונדסים גנטית מאפשרים ניתוח קוטביות מישורית באנדוקרדיום עם תחילת התפתחות המסתם בעכברים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-OH-Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-6278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldheyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-10</td>
			<td>Dilute to 4% in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>FGP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VECadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-605-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4099,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides Superfrost PLUS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td>25 mm x 75 mm x 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>A4974,0500</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos

חקר המנגנונים התאיים והמולקולריים העומדים בבסיס התפתחות לב היונקים חיוני לטיפול במחלות לב מולדות אנושיות. התפתחות מסתמי הלב הפרימיטיביים כרוכה במעבר אפיתליאלי למזנכימלי (EMT) של תאים אנדוקרדיאליים מאזורי התעלה האטריובנטריקולרית (AVC) ודרכי היציאה (OFT) של הלב בתגובה לאותות שריר הלב והאנדוקרדיאליים האינדוקטיביים המקומיים. ברגע שהתאים מתפרקים ופולשים למטריצה החוץ-תאית (ג'לי לבבי) הממוקמת בין האנדוקרדיום לשריר הלב, נוצרות כריות אנדוקרדיאליות פרימיטיביות (EC). תהליך זה מרמז על כך שהאנדוקרדיום צריך למלא את הפערים שהותירו התאים הדה-לאומיים ועליו לארגן את עצמו מחדש כדי להתכנס (להצטמצם) או להתארך (להאריך) לאורך ציר. המחקר הנוכחי עירב את מסלול קוטביות התאים המישוריים (PCP) בוויסות הלוקליזציה התת-תאית של הגורמים המעורבים בתהליך זה. באופן קלאסי, השלבים הראשונים של התפתחות מסתמי הלב נחקרו בחתכים של לבבות עובריים או בצמחי ex vivo AVC או OFT שגודלו בתרבית על ג'ל קולגן. גישות אלה מאפשרות ניתוח של קוטביות אפיקו-בסיסית, אך אינן מאפשרות ניתוח של התנהגות התא בתוך מישור האפיתל או של השינויים המורפולוגיים של תאים נודדים. כאן, אנו מראים גישה ניסיונית המאפשרת הדמיה של אנדוקרדיום באזורים valvulogenic כשדה מישורי של תאים. גישה ניסיונית זו מספקת את ההזדמנות לחקור PCP, טופולוגיה מישורית ותקשורת בין-תאית בתוך אנדוקרדיום של OFT ו- AVC במהלך פיתוח שסתום. פענוח מנגנונים תאיים חדשים המעורבים במורפוגנזה של מסתמי הלב עשוי לתרום להבנת מחלות לב מולדות הקשורות למומים בכרית הלב האנדוקרדיאלית.

הנתונים שנוצרו באמצעות פרוטוקול זה מראים כי ניתן לבצע הדמיה פנים אל פנים של אנדוקרדיום של AVC. המטרה הראשונה הייתה לנתח את צורת התא של האנדוקרדיום במהלך היווצרות השסתומים ברזולוציה תאית (איור 1). כדי להדגיש תאים אנדוקרדיאליים בודדים ב-E9.5, השתמשנו בשני זני עכברים מהונדסי...

Watch this Scientific Journal Video about En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos at JoVE.com

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

באופן קלאסי, האנדוקרדיום של פרימורדיום המסתם העוברי של העכבר נותח באמצעות חתכים רוחביים, קורונליים או סגיטליים. הגישה החדשנית שלנו להדמיה דו-ממדית של האנדוקרדיום באזורים וולוולוגניים מאפשרת קוטביות מישורית וניתוח סידור מחדש של התאים של האנדוקרדיום במהלך התפתחות המסתם.

פנים אל פנים הכנה לכרית אנדוקרדיאלית לניתוח מורפוגנזה מישורית בעוברי עכברים

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

פרוטוקול זה מאפשר ניתוח של אנדוקרדיום פרימיטיבי בכיוון מישורי. אנו יכולים לנתח את התפלגות התאים האנדוקרדיאליים, את האניזוטרופיה של צווים אחרים, ולתאר את צורתו של תא אנדוקרדיאלי יחיד במהלך התפתחות המסתם. בהשוואה למקטעי הרקמה הקלאסיים, הדמיית הפנים של האזור הרגנרטיבי של המסתם הפנימי מאפשרת ניתוח של קוטביות תאים מישורית ודינמיקה של תאים אנדוקרדיאליים במהלך התפתחות המסתם בעוברים שלמים.ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להעמיק את הידע על קוטביות התאים המישוריים במהלך התפתחות לב-ריאה. התחילו בהנחת הרחם שנכרת מעכברות הרות שהומתו בצלחת פטרי המכילה PBT קר כקרח. הסר את הפענוח הבודד מהרחם תחת מיקרוסקופ מנתח באמצעות מלקחיים עדינים.באמצעות פינצטה עדינה, לעשות חתך בחלק הלבן של decidua, שבו העובר הוא. הסר אותו בעדינות, הימנע ממשיכה, והעבר את העוברים לצלחת פטרי חדשה עם PBT טרי באמצעות P-1000 עם קצה מנותק, משאיר קוטר גדול מספיק כדי שהעובר יעבור דרכו מבלי להישבר. עבור גנוטיפ, לקחת חתיכה קטנה של שק החלמון כ 0.5 מילימטרים רבועים או חתיכה של הזנב מן הקצה האחורי, לספור חמישה עד 10 סומיטים לכיוון הראש ולעכל אותו 100 מיליליטר של החיץ המתאים.מתחת למכסה האדים, העבירו את העוברים לקור כקרח 4%PFA בצינור מיקרוצנטריפוגה של שני מיליליטר בארבע מעלות צלזיוס. לתקן את העוברים משעתיים עד לילה בארבע מעלות צלזיוס על נוטור. מתחת למכסה האדים, הסר את המקבע 4%PFA מצינורות המיקרוצנטריפוגה מבלי לגעת בעוברים.יש להשליך את ה-PFA בגורם מכיל מתאים. שטפו את העוברים חמש פעמים ב-PBT קר במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. באמצעות מלקחיים עדינים, להסיר את הלב ולהעביר אותו לצינור microcentrifuge חדש 1.5 מיליליטר עם PBT טרי.החליפו את PBT ב-PBS Triton ושטפו את הדגימות שלוש פעמים, חמש דקות כל אחת, בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולי. החלף את PBS Triton בתמיסת חסימה המכילה PBS Triton עם סרום בקר 10% מומת בחום. דגירה משעתיים עד לילה בארבע מעלות צלזיוס על שייקר מסלולי.החלף את התמיסה החוסמת בתמיסה חוסמת המכילה נוגדן ראשוני בריכוז הרצוי. דגירה למשך הלילה על שייקר מסלולי בארבע מעלות צלזיוס. לאחר דגירה של לילה בארבע מעלות צלזיוס, דגרו את הדגימות במשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולי.שלב זה חיוני להגדלת יחס האות לרעש. הסר ושמור את תמיסת הנוגדנים העיקרית בארבע מעלות צלזיוס, עד שלושה ניסויים עתידיים. הוסיפו נתרן אזיד לריכוז סופי של 0.02% לשימור מיטבי.לאחר מכן, שטפו את העוברים שלוש פעמים עם PBS Triton במשך שלוש דקות כל אחד. שטפו את העוברים עם PBS Triton שלוש פעמים במשך 30 דקות ושמרו אותם על שייקר מסלולי בארבע מעלות צלזיוס. לאחר השטיפה האחרונה, הוסיפו מיליליטר אחד של תמיסת חסימה המכילה נוגדן משני מצומד פלואורסצנטי כנגד המין המארח העיקרי של הנוגדנים.לאחר מכן מוסיפים DAPI לתמיסה ומדגרים את העוברים למשך הלילה על שייקר מסלולי בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה הלילה בארבע מעלות צלזיוס, דגירה על העוברים במשך שעה וחצי בטמפרטורת החדר על שייקר מסלולי. שלב זה חיוני להגדלת יחס האות לרעש.חזור על שלבי הכביסה של PBS Triton כפי שצוין בכתב היד של הטקסט. שים את הלבבות על צלחת פטרי 35 מ"מ המכילה PBS. באמצעות חוט טונגסטן ומלקחיים עדינים, לבודד את התעלה atrioventricular או את דרכי היציאה לחתוך אותם לאורך.הכן תלושי כיסוי, שקופיות, מלקחיים, פיפטה P-200 עם הקצוות המתאימים, מגבת נייר וכל מדיה מימית המבוססת על גליצרול לפלואורסצנציה ללא DAPI. הדביקו שתי רצועות של סרט הדבקה על שקופית המופרדות ב-0.3 עד 0.6 ס"מ כדי ליצור חלל חדר תלת-ממדי שיאפשר לדגימות לשמר את צורתן המקורית מבלי למעוך אותן. לאחר מכן, באמצעות כ 20 microliters של חיץ, בזהירות לזרוק את הדגימות על השקופית בין רצועות הקלטת באמצעות קצה P-200 פיפטה לחתוך.השתמש במיקרוסקופ מנתח כדי להגדיל את הדיוק. באמצעות מלקחיים עדינים, מניחים את הדגימות כאשר האנדוקרדיום פונה כלפי מעלה ושריר הלב כלפי מטה על המגלשה. הסירו עודפי PBS בעזרת מגבת נייר והימנעו מלגעת בדגימה.לאחר מכן, ייבשו את הדגימות במשך דקה עד שתי דקות בטמפרטורת החדר כדי לגרום לדגימות להידבק לשקופית. הוסף 40 מיקרוליטרים של מדיה הרכבה על בסיס מימי לרקמה. מניחים את הכיסוי להחליק על שתי פיסות הסרט ומורידים אותו באיטיות על הרקמה בעזרת מחט או מלקחיים.הימנעו מיצירת בועות אוויר. אטמו את הכיסוי באמצעות טיפת לק אחת על כל קודקוד של הכיסוי. לאחר שהלק יבש, נקו את עודפי ההרכבה מצידי הכיסוי על ידי שימוש במגבת נייר סופגת.יש להימנע מהזזת הכיסוי. הוסיפו לק לאורך קצוות הכיסוי כדי לאטום אותו לחלוטין, ובכך למנוע התאדות של חומרי ההדפסה. באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף או הפוך, צלם תמונות בהגדלה של 10X לתצוגה כללית וב- 63X עם זום 3X לתמונות מפורטות.צורת התא של אנדוקרדיום נותחה במהלך היווצרות השסתומים ברזולוציה תאית. תאים בודדים או שיבוטים של כמה תאים ביטאו GFP באנדוקרדיום. הביטוי והשילוב של GFP עם לוקליזציה תת-תאית של VE-cadherin היו גישה יעילה לחקר הקשר בין דינמיקה של AJ לבין היווצרות פילופודיה ותאי קדם-EMT, מאחר שתאים אלה פיתחו בליטות ממברנה כאשר AJs מתמוססים.הבדלים בעוצמת הכתם של VE-cadherin באנדוקרדיום הצביעו על נוכחות של התכווצות אניזוטרופית באנדוקרדיום העוברי של התעלה האטריובנטריקולרית בשלבים טרום-וולוולריים. כל הלב הוכתם בנוגדן VE-cadherin ב-E8.5 ו-E9.5. ב- E8.5, האנדוקרדיום של התעלה האטריובנטריקולרית נטה להיות בעל ארגון אפיתל יציב, וקודקודים שנוצרו על ידי יותר מארבעה תאים לא זוהו.ב-E9.5 נצפו קודקודים של עד שישה תאים היוצרים מבנים דמויי רוזטה, בדומה לארגון התאי שתואר קודם לכן באפיתל העובר סידור מחדש פעיל של תאים, מה שמרמז על כך שאנדוקרדיום התעלה האטריובנטריקולרית עבר סידור מחדש דינמי של התאים במהלך התפתחות המסתם. עקומת למידה נחוצה כדי להפוך למומחה בטכניקה זו. יתר על כן, מומלץ מאוד להשתמש מלקחיים ריבוניים חוט טונגסטן.כיום, הדמיה של אנדוקרדיום טרום valvular היה מוגבל חתכים. הגישה שלנו מציעה את האפשרות לחקור התנהגות אנדוקרדיומית עוברית מנקודת מבט מישורית.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

הדמיה ניגודיות בעכבר עוברים באמצעות תדר גבוהים אולטראסאונד

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

הכנת הברים מועשר מיטוכונדריאלי לניתוח חילוף חומרים ב<em&gt; דרוזופילה</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

הנדסה גנטית יציבה ויעילה של תאי V-SVZ העכבר למבוגרים עבור הניתוח של הגזע עצבי נייד אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

שיטות להעברת לוקליזציה דווקא של תאים או DNA לPostimplantation המוקדם עכבר עוברים

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

ניתוח כמותי Immunofluorescence כולה-הר של אוכלוסיות לב ב העכבר עוברי

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

הפרקים הבאים רקמה Endocardial ויה Photoconversion תאים של העובר דג זברה

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

אין ויוו הדמיה של גיד השריר מורפוגנזה ב דרוזופילה הגלמים

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount ב באתרו הכלאה עבור עוברי Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...