Name: en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos
Uploaded: 2022-07-27T14:30:00
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Questo studio è stato supportato dalle sovvenzioni PID2019-104776RB-I00 e CB16/11/00399 (CIBER CV) da MCIN/AEI/10.13039/501100011033 a J. L. P. J.G.-B. è stato finanziato dal Programa de Atracción de Talento della Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. è stato finanziato da Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Si ringraziano l'Unità CNIC di Microscopia e Imaging Dinamico, CNIC, ICTS-ReDib, co-finanziata da MCIN/AEI/10.13039/501100011033 e FESR "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Ringraziamo anche A. Galicia e L. Méndez per l'allevamento dei topi. Il costo di questa pubblicazione è stato in parte sostenuto da fondi del Fondo europeo di sviluppo regionale. Il CNIC è sostenuto dall'ISCIII, dal MCIN e dalla Fondazione Pro CNIC ed è un Centro di Eccellenza Severo Ochoa (sovvenzione CEX2020-001041-S) finanziato da MCIN/AEI /10.13039/501100011033.

Gli studi sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) e dalla Comunità di Madrid (rif. PROEX 155.7/20). Tutte le procedure animali sono conformi alla direttiva UE 2010/63UE e alla raccomandazione 2007/526/CE relativa alla protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici, emanata dalla legge spagnola con Real Decreto 1201/2005.
1. Ottenimento di AVC e...

<ol>
	<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells.">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).</li><li>Ivanovitch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=outflow+tract+heart+progenitors+arise+from+spatially+and+molecularly+distinct+regions+of+the+primitive+streak.">outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak.</a> PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).</li><li>Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+promotes+epithelial-mesenchymal+transition+during+cardiac+development+and+oncogenic+transformation.">Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation.</a> Genes &amp; Development. 18 (1), 99-115 (2004).</li><li>Luna-Zurita, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+a+Notch-dependent+mesenchymal+gene+program+and+Bmp2-driven+cell+invasiveness+regulates+murine+cardiac+valve+formation.">Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).</li><li>Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp2+and+Notch+cooperate+to+pattern+the+embryonic+endocardium.">Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium.</a> Development. 145 (13), (2018).</li><li>MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+cardiac+valve+development+and+disease.">Notch signaling in cardiac valve development and disease.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).</li><li>de la Pompa, J. L., Epstein, J. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nfatc1+coordinates+valve+endocardial+cell+lineage+development+required+for+heart+valve+formation.">Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation.</a> Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).</li><li>Amack, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+of+EMT:+Lessons+from+live+in+vivo+imaging+of+embryonic+development.">Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development.</a> Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).</li><li>Cano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+controls+epithelial-mesenchymal+transitions+by+repressing+E-cadherin+expression.">The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).</li><li>Batlle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+is+a+repressor+of+E-cadherin+gene+expression+in+epithelial+tumour+cells.">The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).</li><li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-dependent+remodeling+of+adherens+junctions+protects+junctions+from+Snail-dependent+disassembly.">Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly.</a> Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).</li><li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+protein+Par3/Bazooka+follows+myosin-dependent+junction+repositioning.">Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning.</a> Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).</li><li>Jimenez-Amilburu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+cardiomyocyte+apicobasal+polarity+reveals+epithelial+to+mesenchymal-like+transition+during+cardiac+trabeculation.">In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation.</a> Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).</li><li>Davey, C. F., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+in+moving+cells:+Think+globally,+act+locally.">Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally.</a> Development. 144 (2), 187-200 (2017).</li><li>Grego-Bessa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+PTEN+and+the+PDK1+kinase+regulate+formation+of+the+columnar+neural+epithelium.">The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium.</a> Elife. 5, 12034 (2016).</li><li>Jones, C., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+in+vertebrates.">Planar cell polarity signaling in vertebrates.</a> Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).</li><li>Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+and+Vangl2+cooperate+in+the+initiation+of+planar+cell+polarity+in+the+mouse+embryo.">Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo.</a> Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).</li><li>Devenport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+morphodynamics:+Translating+planar+polarity+cues+into+polarized+cell+behaviors.">Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).</li><li>Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Notch1+activity+in+development:+Evidence+for+a+feedback+regulatory+loop.">Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop.</a> Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).</li><li>Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+node+and+notochordal+plate+in+gastrulating+mouse+embryos+using+scanning+electron+microscopy+and+whole+mount+immunofluorescence.">Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).</li><li>Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+avian+embryonic+valvular+progenitor+cells.">Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-B2+controls+VEGF-induced+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).</li><li>Yilmaz, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMT,+the+cytoskeleton,+and+cancer+cell+invasion.">EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).</li><li>Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+links+axes+of+spatial+dynamics+in+neural-tube+closure.">Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure.</a> Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).</li><li>Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis.">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).</li><li>Prados, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Bmp2+gain+causes+ectopic+EMT+and+promotes+cardiomyocyte+proliferation+and+immaturity.">Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity.</a> Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).</li><li>Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cardiac+cushion+development+by+hyaluronan.">Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan.</a> Experimental &amp; Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).</li><li>Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+blood+flow+on+cardiac+development.">Influence of blood flow on cardiac development.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).</li><li>Goddard, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+sculpt+developing+heart+valves+through+a+KLF2-WNT9B+paracrine+signaling+axis.">Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis.</a> Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).</li></ol>

L'endocardio è un monostrato epiteliale che copre l'intera superficie interna del tubo cardiaco embrionale. Durante lo sviluppo valvolare, le cellule endocardiche nelle regioni valvolari prospettiche subiscono EMT, quindi le cellule endocardiche trasformano e riorganizzano il loro citoscheletro per delaminarsi dall'endocardio verso la gelatina cardiaca. Noi e altri abbiamo ottenuto dati rilevanti sullo sviluppo valvolare in embrioni di topo analizzando sezioni trasversali di cuori embrionali E8.5 ed E9.5, dove l'endocar...

Il cuore è il primo organo funzionale di un embrione di mammifero. Intorno al giorno embrionale (E) 7,5 nei topi, le cellule bilaterali del mesoderma precardiaco formano la mezzaluna cardiaca nel lato ventrale1. La mezzaluna cardiaca contiene due popolazioni di cellule precardiache che includono progenitori del miocardio e dell'endocardio2. Intorno a E8.0, i precursori cardiaci si fondono nella linea mediana, formando il tubo cardiaco primitivo costituito da due tessuti epiteliali, il miocardio esterno e l'endocardio interno, che è un endotelio specializzato separato da una matrice extracellulare chiamata gelatina cardiaca. Successivamente, a E8.5, il tubo cardiaco subisce un ciclo verso destra. Il cuore ad anello ha diverse regioni anatomiche con firme molecolari specifiche come il tratto di efflusso (OFT), i ventricoli e il canale atrio-ventricolare (AVC)3. Sebbene inizialmente il tubo cardiaco si espanda sul suo lato di afflusso attraverso l'aggiunta di cellule4, a E9.5, un'intensa proliferazione cardiaca provoca il palloncino delle camere e la creazione della rete trabecolare5. La formazione valvolare avviene nell'AVC (future valvole mitrale e tricuspide) e nell'OFT (future valvole aortica e polmonare).
L'endocardio svolge un ruolo cruciale nello sviluppo della valvola. Le cellule endocardiche subiscono una transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) nell'AVC e nell'OFT per formare i cuscini endocardici, una struttura che appare all'inizio dello sviluppo valvolare. Diverse vie di segnalazione attivano questo processo; a E9.5 nei topi, NOTCH attivato nell'endocardio in risposta al BMP2 derivato dal miocardio promuove l'EMT invasiva delle cellule endocardiche nelle regioni AVC e OFT attraverso l'attivazione di TGFβ2 e SNAIL (SNAI1), che reprime direttamente l'espressione della caderina endoteliale vascolare (VE-caderina), una componente transmembrana delle giunzioni aderenti (AJ)6,7,8 . Nell'OFT, l'attivazione dell'endocardio per iniziare l'EMT è mediata da FGF8 e BMP4, la cui espressione è attivata da NOTCH 9,10,11,12.
La progressione dell'EMT coinvolge la dinamica cellulare mentre le cellule cambiano forma, rompono e ricreano le giunzioni con i loro vicini, si delaminano e iniziano a migrare13. Questi cambiamenti includono il rimodellamento di AJ e il graduale disassemblaggio 14,15, la segnalazione della polarità cellulare planare (PCP), la perdita della polarità apico-basale (ABP), la costrizione apicale e l'organizzazione citoscheletrica 16,17. ABP si riferisce alla distribuzione delle proteine lungo l'asse antero-posteriore di una cellula. Nel cuore in via di sviluppo, la regolazione dell'ABP nei cardiomiociti è necessaria per lo sviluppo ventricolare18. PCP si riferisce a una distribuzione polarizzata di proteine all'interno delle cellule attraverso il piano di un tessuto e regola la distribuzione cellulare; Gli epiteli con una geometria stabile sono costituiti da cellule di forma esagonale, dove solo tre celle convergono ai vertici 19,20,21,22. Diversi processi cellulari, come la divisione cellulare, lo scambio di vicini o la delaminazione che si verificano durante la morfogenesi epiteliale, producono un aumento del numero di cellule che convergono su un vertice e il numero di cellule vicine che una data cellula ha22. Questi comportamenti cellulari correlati alla PCP possono essere regolati da diverse vie di segnalazione, dinamica dell'actina o traffico intracellulare23.
I dati generati studiando lo sviluppo valvolare nei topi sono stati ottenuti da sezioni trasversali, coronali o sagittali di cuori embrionali E8.5 ed E9.5, dove l'endocardio è mostrato come una linea di cellule anziché come un campo di cellule: l'endocardio copre l'intera superficie interna del tubo cardiaco24. Le sezioni embrionali non consentono l'analisi del PCP nell'endocardio degli embrioni di topo. Il nostro nuovo metodo sperimentale consente l'analisi della distribuzione delle cellule endocardiche, dell'anisotropia AJ e dell'analisi della forma a singola cellula, come mostrato nei risultati rappresentativi. Questo tipo di dati è necessario per l'analisi del PCP, insieme alla descrizione di altre molecole correlate al PCP, non mostrate in questo rapporto. L'immunofluorescenza a montaggio intero, la preparazione di campioni specifici e l'uso di topi geneticamente modificati consentono l'analisi della polarità planare nell'endocardio all'inizio dello sviluppo valvolare nei topi.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-OH-Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-6278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldheyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-10</td>
			<td>Dilute to 4% in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>FGP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VECadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-605-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4099,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides Superfrost PLUS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td>25 mm x 75 mm x 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>A4974,0500</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos

Lo studio dei meccanismi cellulari e molecolari alla base dello sviluppo del cuore dei mammiferi è essenziale per affrontare la cardiopatia congenita umana. Lo sviluppo delle valvole cardiache primitive comporta la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) delle cellule endocardiche dalle regioni del canale atrioventricolare (AVC) e del tratto di efflusso (OFT) del cuore in risposta a segnali miocardici ed endocardici induttivi locali. Una volta che le cellule si delaminatono e invadono la matrice extracellulare (gelatina cardiaca) situata tra l'endocardio e il miocardio, si formano i cuscinetti endocardici primitivi (EC). Questo processo implica che l'endocardio deve riempire gli spazi vuoti lasciati dalle cellule delaminate e deve riorganizzarsi per convergere (stretto) o estendersi (allungarsi) lungo un asse. La ricerca attuale ha implicato il percorso di polarità cellulare planare (PCP) nella regolazione della localizzazione subcellulare dei fattori coinvolti in questo processo. Classicamente, le fasi iniziali dello sviluppo valvolare cardiaco sono state studiate in sezioni trasversali di cuori embrionali o in espianti ex vivo AVC o OFT coltivati su gel di collagene. Questi approcci permettono l'analisi della polarità apico-basale ma non permettono l'analisi del comportamento cellulare all'interno del piano dell'epitelio o dei cambiamenti morfologici delle cellule migranti. Qui, mostriamo un approccio sperimentale che consente la visualizzazione dell'endocardio nelle regioni valvulogeniche come un campo planare di cellule. Questo approccio sperimentale offre l'opportunità di studiare PCP, topologia planare e comunicazione intercellulare all'interno dell'endocardio dell'OFT e dell'AVC durante lo sviluppo della valvola. Decifrare nuovi meccanismi cellulari coinvolti nella morfogenesi delle valvole cardiache può contribuire alla comprensione della cardiopatia congenita associata a difetti del cuscino endocardico.

I dati generati utilizzando questo protocollo mostrano che è possibile eseguire l'imaging en face dell'endocardio dell'AVC. Il primo obiettivo era quello di analizzare la forma cellulare dell'endocardio durante la formazione delle valvole ad una risoluzione cellulare (Figura 1). Al fine di evidenziare le singole cellule endocardiche a E9.5, abbiamo utilizzato due ceppi di topo transgenici. (1) ROSA mT/mG è un allele reporter Cre fluorescente a due colori (tdTomato/mT e <e...

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En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Classicamente, l'endocardio del primordium della valvola embrionale di topo è stato analizzato utilizzando sezioni trasversali, coronali o sagittali. Il nostro nuovo approccio per l'imaging bidimensionale dell'endocardio nelle regioni valvulogeniche consente l'analisi della polarità planare e del riarrangiamento cellulare dell'endocardio durante lo sviluppo della valvola.

En Face Preparazione del cuscino endocardico per l'analisi della morfogenesi planare negli embrioni di topo

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

Questo protocollo consente l'analisi dell'endocardio primitivo in un orientamento planare. Possiamo analizzare la distribuzione delle cellule endocardiche, l'anisotropia di altre ingiunzioni e descrivere la forma di una singola cellula endocardica durante lo sviluppo valvolare. Rispetto alle sezioni tissutali classiche, l'imaging en face della regione rigenerativa della valvola interna consente l'analisi della polarità cellulare planare e della dinamica delle cellule endocardiche durante lo sviluppo valvolare in embrioni intatti.Questo metodo può essere utilizzato per approfondire la conoscenza della polarità cellulare planare durante lo sviluppo cardio. Inizia mettendo l'utero asportato da topi gravidi eutanasizzati, in una capsula di Petri contenente PBT ghiacciato. Rimuovere l'individuo deciduye dall'utero sotto un microscopio da dissezione usando una pinza fine.Usando una pinzetta sottile, fai un'incisione nella parte bianca della decidua, che è dove si trova l'embrione. Rimuoverlo delicatamente, evitare di tirare e trasferire gli embrioni in una nuova capsula di Petri con PBT fresco usando un P-1000 con la punta tagliata, lasciando un diametro abbastanza grande da consentire a un embrione di passare attraverso senza rompersi. Per la genotipizzazione, prendere un piccolo pezzo del sacco vitellino di circa 0,5 millimetri quadrati o un pezzo della coda dall'estremità posteriore, contando da cinque a 10 somiti verso la testa e digerirlo in 100 millilitri del tampone appropriato.Sotto la cappa aspirante, trasferire gli embrioni al 4% di PFA ghiacciato in una provetta da microcentrifuga da due millilitri a quattro gradi Celsius. Fissare gli embrioni da due ore a una notte a quattro gradi Celsius su un nutatore. Sotto la cappa aspirante, rimuovere il fissativo 4% PFA dalle provette della microcentrifuga senza toccare gli embrioni.Gettare il PFA in un contenitore appropriato. Lavare gli embrioni cinque volte in PBT freddo per 10 minuti a temperatura ambiente. Utilizzando una pinza fine, rimuovere il cuore e trasferirlo in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri con PBT fresco.Sostituire PBT con PBS Triton e lavare i campioni tre volte, cinque minuti ciascuna, a temperatura ambiente su uno shaker orbitale. Sostituire PBS Triton con una soluzione bloccante contenente PBS Triton con siero bovino inattivato al 10% dal calore. Incubare da due ore a una notte a quattro gradi Celsius su uno shaker orbitale.Sostituire la soluzione bloccante con una soluzione bloccante contenente anticorpi primari alla concentrazione desiderata. Incubare durante la notte su uno shaker orbitale a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione notturna a quattro gradi Celsius, incubare i campioni per 1,5 ore a temperatura ambiente su uno shaker orbitale.Questo passaggio è fondamentale per aumentare il rapporto segnale-rumore. Rimuovere e mantenere la soluzione anticorpale primaria a quattro gradi Celsius, fino a tre esperimenti futuri. Aggiungere azoturo di sodio ad una concentrazione finale dello 0,02% per una migliore conservazione.Quindi, lavare gli embrioni tre volte con PBS Triton per tre minuti ciascuno. Lavare gli embrioni con PBS Triton tre volte per 30 minuti e tenerli su uno shaker orbitale a quattro gradi Celsius. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere un millilitro di soluzione bloccante contenente anticorpi secondari coniugati con fluorescenza contro la specie ospite di anticorpi primari.Quindi aggiungere DAPI alla soluzione e incubare gli embrioni durante la notte su uno shaker orbitale a quattro gradi Celsius. Dopo l'incubazione notturna a quattro gradi Celsius, incubare gli embrioni per 1,5 ore a temperatura ambiente su uno shaker orbitale. Questo passaggio è essenziale per aumentare il rapporto segnale-rumore.Ripetere i passaggi di lavaggio PBS Triton come indicato nel manoscritto di testo. Metti i cuori su una piastra di Petri da 35 millimetri contenente PBS. Utilizzando un filo di tungsteno e una pinza fine, isolare il canale atrioventricolare o il tratto di deflusso e tagliarli longitudinalmente.Preparare vetrini di copertura, vetrini, pinze, una pipetta P-200 con le punte appropriate, un tovagliolo di carta e qualsiasi mezzo di montaggio acquoso a base di glicerolo per fluorescenza senza DAPI. Incolla due strisce di nastro adesivo su una diapositiva separata da 0,3 a 0,6 centimetri per creare uno spazio 3D che consentirà ai campioni di conservare la loro forma originale senza schiacciarli. Quindi, utilizzando circa 20 microlitri di tampone, rilasciare con cautela i campioni sul vetrino tra le strisce di nastro utilizzando una punta per pipetta P-200 tagliata.Utilizzare un microscopio da dissezione per aumentare la precisione. Usando una pinza fine, posizionare i campioni con l'endocardio rivolto verso l'alto e il miocardio verso il basso sul vetrino. Rimuovere il PBS in eccesso con un tovagliolo di carta ed evitare di toccare il campione.Quindi, asciugare i campioni per uno o due minuti a temperatura ambiente per far aderire i campioni al vetrino. Aggiungere 40 microlitri di media di montaggio a base acquosa al tessuto. Posizionare la linguetta di copertura sopra i due pezzi di nastro adesivo e abbassarla lentamente sul fazzoletto con un ago o una pinza.Evitare di creare bolle d'aria. Sigillare la sottoveste di copertura con una goccia di smalto su ciascun vertice della sottoveste. Una volta che lo smalto è asciutto, pulire il supporto di montaggio in eccesso dai lati della vetrina utilizzando un tovagliolo di carta assorbente.Evitare di spostare il vetrino di copertina. Aggiungere lo smalto lungo i bordi della fodera del coperchio per sigillarlo completamente, evitando l'evaporazione del supporto di montaggio. Utilizzando un microscopio confocale verticale o invertito, scattare immagini con ingrandimento 10X per la visualizzazione generale e a 63X con zoom 3X per immagini dettagliate.La forma cellulare dell'endocardio è stata analizzata durante la formazione delle valvole a una risoluzione cellulare. Singole cellule o cloni di poche cellule hanno espresso GFP nell'endocardio. L'espressione e la combinazione di GFP con la localizzazione subcellulare della VE-caderina è stato un approccio efficace per studiare la relazione tra la dinamica di AJ e la formazione di filopodi e le cellule pre-EMT, poiché queste cellule hanno sviluppato protrusioni di membrana quando le AJ si dissolvono.Le differenze nell'intensità della colorazione VE-caderina nell'endocardio hanno indicato la presenza di contrattilità anisotropa nell'endocardio embrionale del canale atrioventricolare negli stadi pre-valvolari. L'intero cuore era colorato con l'anticorpo VE-caderina a E8.5 ed E9.5. A E8.5, l'endocardio del canale atrioventricolare tendeva ad avere un'organizzazione epiteliale stabile e non sono stati rilevati vertici formati da più di quattro cellule.A E9.5, sono stati osservati vertici di un massimo di sei cellule che formano strutture simili a rosette, simili all'organizzazione cellulare precedentemente descritta nell'epiteliale sottoposto a riarrangiamenti cellulari attivi, suggerendo che l'endocardio del canale atrioventricolare stava subendo un riarrangiamento cellulare dinamico durante lo sviluppo della valvola. Una curva di apprendimento è necessaria per diventare un esperto in questa tecnica. Inoltre, si consiglia vivamente di utilizzare pinze sovrane e filo di tungsteno.Oggi, la visualizzazione dell'endocardio pre-valvolare era limitata alle sezioni trasversali. Il nostro approccio offre la possibilità di studiare il comportamento dell'endocardio valvolare embrionale da un punto di vista planare.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

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Biologia dello sviluppo

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