Name: en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos
Uploaded: 2022-07-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos at JoVE.com

Denne studien ble støttet av tilskudd PID2019-104776RB-I00 og CB16/11/00399 (CIBER CV) fra MCIN/AEI/10.13039/501100011033 til J. L. P. J.G.-B. ble finansiert av Programa de Atracción de Talento fra Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. ble finansiert av Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Vi takker CNIC Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, ICTS-ReDib, delfinansiert av MCIN/AEI /10.13039/501100011033 og FEDER "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Vi takker også A. Galicia og L. Méndez for musehold. Kostnaden for denne publikasjonen ble delvis støttet av midler fra Det europeiske regionale utviklingsfondet. CNIC støttes av ISCIII, MCIN og Pro CNIC Foundation og er et Severo Ochoa Center of Excellence (stipend CEX2020-001041-S) finansiert av MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033.

Dyrestudier ble godkjent av Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) Animal Experimentation Ethics Committee og av Madrid-regionen (ref. PROEX 155.7/20). Alle dyreprosedyrer i samsvar med EU-direktiv 2010/63EU og anbefaling 2007/526/EF om beskyttelse av dyr som brukes til eksperimentelle og andre vitenskapelige formål, vedtatt i spansk lov under Real Decreto 1201/2005.
1. Obtention av AVC og / eller OFTs (tilpasset fra Xiao et al. 25<st...

<ol>
	<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells.">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).</li><li>Ivanovitch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=outflow+tract+heart+progenitors+arise+from+spatially+and+molecularly+distinct+regions+of+the+primitive+streak.">outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak.</a> PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).</li><li>Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+controlling+second+heart+field+development.">Signaling pathways controlling second heart field development.</a> Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).</li><li>Moorman, A. F., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+chamber+formation:+Development,+genes,+and+evolution.">Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution.</a> Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).</li><li>Timmerman, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+promotes+epithelial-mesenchymal+transition+during+cardiac+development+and+oncogenic+transformation.">Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation.</a> Genes &amp; Development. 18 (1), 99-115 (2004).</li><li>Luna-Zurita, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+a+Notch-dependent+mesenchymal+gene+program+and+Bmp2-driven+cell+invasiveness+regulates+murine+cardiac+valve+formation.">Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).</li><li>Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp2+and+Notch+cooperate+to+pattern+the+embryonic+endocardium.">Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium.</a> Development. 145 (13), (2018).</li><li>MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+cardiac+valve+development+and+disease.">Notch signaling in cardiac valve development and disease.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).</li><li>de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+tissue+interactions:+Notch+signaling+in+cardiac+development+and+disease.">Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease.</a> Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nfatc1+coordinates+valve+endocardial+cell+lineage+development+required+for+heart+valve+formation.">Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation.</a> Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).</li><li>Amack, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+of+EMT:+Lessons+from+live+in+vivo+imaging+of+embryonic+development.">Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development.</a> Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).</li><li>Cano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+controls+epithelial-mesenchymal+transitions+by+repressing+E-cadherin+expression.">The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).</li><li>Batlle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+is+a+repressor+of+E-cadherin+gene+expression+in+epithelial+tumour+cells.">The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).</li><li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-dependent+remodeling+of+adherens+junctions+protects+junctions+from+Snail-dependent+disassembly.">Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly.</a> Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).</li><li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+protein+Par3/Bazooka+follows+myosin-dependent+junction+repositioning.">Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning.</a> Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).</li><li>Jimenez-Amilburu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+cardiomyocyte+apicobasal+polarity+reveals+epithelial+to+mesenchymal-like+transition+during+cardiac+trabeculation.">In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation.</a> Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).</li><li>Davey, C. F., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+in+moving+cells:+Think+globally,+act+locally.">Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally.</a> Development. 144 (2), 187-200 (2017).</li><li>Grego-Bessa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+PTEN+and+the+PDK1+kinase+regulate+formation+of+the+columnar+neural+epithelium.">The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium.</a> Elife. 5, 12034 (2016).</li><li>Jones, C., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+in+vertebrates.">Planar cell polarity signaling in vertebrates.</a> Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).</li><li>Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+and+Vangl2+cooperate+in+the+initiation+of+planar+cell+polarity+in+the+mouse+embryo.">Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo.</a> Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).</li><li>Devenport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+morphodynamics:+Translating+planar+polarity+cues+into+polarized+cell+behaviors.">Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).</li><li>Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Notch1+activity+in+development:+Evidence+for+a+feedback+regulatory+loop.">Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop.</a> Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).</li><li>Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+node+and+notochordal+plate+in+gastrulating+mouse+embryos+using+scanning+electron+microscopy+and+whole+mount+immunofluorescence.">Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).</li><li>Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+avian+embryonic+valvular+progenitor+cells.">Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-B2+controls+VEGF-induced+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).</li><li>Yilmaz, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMT,+the+cytoskeleton,+and+cancer+cell+invasion.">EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).</li><li>Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+links+axes+of+spatial+dynamics+in+neural-tube+closure.">Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure.</a> Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).</li><li>Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis.">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).</li><li>Prados, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Bmp2+gain+causes+ectopic+EMT+and+promotes+cardiomyocyte+proliferation+and+immaturity.">Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity.</a> Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).</li><li>Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cardiac+cushion+development+by+hyaluronan.">Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan.</a> Experimental &amp; Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).</li><li>Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+blood+flow+on+cardiac+development.">Influence of blood flow on cardiac development.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).</li><li>Goddard, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+sculpt+developing+heart+valves+through+a+KLF2-WNT9B+paracrine+signaling+axis.">Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis.</a> Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).</li></ol>

Endokardiet er et epitelial monolag som dekker hele den indre overflaten av det embryonale hjerterøret. Under ventilutvikling gjennomgår endokardiale celler ved de potensielle valvulære områdene EMT, og dermed transformerer endokardceller og omorganiserer cytoskelettet til delaminering fra endokardiet mot hjertegeléen. Vi og andre har innhentet relevante data om ventilutvikling i museembryoer ved å analysere tverrgående seksjoner av E8.5 og E9.5 embryonale hjerter, hvor endokardiet er vist som en rad med celler<su...

Hjertet er det første funksjonelle organet til et pattedyrembryo. Rundt embryonale dag (E) 7,5 hos mus danner bilaterale prekardiale mesodermceller hjertets halvmåne i ventralsiden1. Hjertets halvmåne inneholder to populasjoner av prekardiale celler som inkluderer forfedre til myokardiet og endokardiet2. Rundt E8.0 smelter hjerteforløperne i midtlinjen og danner det primitive hjerterøret som består av to epitelvev, det ytre myokardiet og det indre endokardiet, som er et spesialisert endotel adskilt av en ekstracellulær matrise kalt hjertegelé. Senere, ved E8.5, gjennomgår hjerterøret høyre sløyfe. Det sløyfede hjertet har forskjellige anatomiske regioner med spesifikke molekylære signaturer som utstrømningskanalen (OFT), ventriklene og atrio-ventrikulærkanalen (AVC)3. Selv om hjerterøret i utgangspunktet utvides ved innstrømningssiden gjennom tilsetning av celler4, ved E9.5, resulterer intensiv hjerteproliferasjon i ballongdannelse av kamrene og etablering av trabekulært nettverk5. Ventildannelse foregår i AVC (fremtidige mitral- og trikuspidalklaffer) og i OFT (fremtidige aorta- og lungeventiler).
Endokardiet spiller avgjørende roller i ventilutvikling. Endokardiale celler gjennomgår epitel-mesenkymal overgang (EMT) i AVC og OFT for å danne endokardiale puter, en struktur som fremkommer ved begynnelsen av ventilutviklingen. Ulike signalveier aktiverer denne prosessen; ved E9.5 hos mus fremmer NOTCH aktivert i endokardiet som respons på myokardavledet BMP2 invasiv EMT av endokardiale celler i AVC- og OFT-regionene gjennom aktivering av TGFβ2 og SNAIL (SNAI1), som direkte undertrykker uttrykket av vaskulær endotelkaderin (VE-cadherin), en transmembrankomponent av adherens junctions (AJs)6,7,8 . I OFT er aktivering av endokardiet for å initiere EMT mediert av FGF8 og BMP4, hvis uttrykk aktiveres av NOTCH 9,10,11,12.
Progresjon av EMT innebærer cellulær dynamikk som celler endrer form, bryter og remake kryss med sine naboer, delamin, og begynner å migrere13. Disse endringene inkluderer AJ-ombygging og gradvis demontering av 14,15, lineær cellepolaritet (PCP) signalering, tap av apico-basal polaritet (ABP), apikal innsnevring og cytoskeletal organisasjon 16,17. ABP refererer til fordelingen av proteiner langs den fremre-bakre aksen til en celle. I utviklingshjertet er ABP-regulering i kardiomyocytter nødvendig for ventrikulær utvikling18. PCP refererer til en polarisert fordeling av proteiner i celler over vevets plan og regulerer cellulær distribusjon; Epithelia med stabil geometri består av sekskantformede celler, hvor bare tre celler konvergerer ved hjørnene 19,20,21,22. Ulike cellulære prosesser, for eksempel celledeling, naboutveksling eller delaminering som forekommer under epitelmorfogenese, produserer en økning i antall celler som konvergerer på et toppunkt og antall naboceller som en gitt celle har22. Disse cellulære atferdene relatert til PCP kan reguleres av forskjellige signalveier, aktindynamikk eller intracellulær handel23.
Dataene som genereres som studerer ventilutvikling hos mus, er hentet fra transversale, koronale eller sagittale seksjoner av E8.5 og E9.5 embryonale hjerter, hvor endokardiet er vist som en cellelinje i stedet for som et felt av celler - endokardiet dekker hele den indre overflaten av hjerterøret24. Embryonale seksjoner tillater ikke analyse av PCP i endokardiet til museembryoer. Vår nye eksperimentelle metode tillater analyse av endokardial cellefordeling, AJ-anisotropi og enkeltcelleformanalyse, som vist i de representative resultatene. Denne typen data er nødvendig for PCP-analyse, sammen med beskrivelsen av andre molekyler relatert til PCP, som ikke er vist i denne rapporten. Helmontert immunfluorescens, spesifikk prøvepreparering og bruk av genmodifiserte mus muliggjør plan polaritetsanalyse i endokardiet ved starten av ventilutvikling hos mus.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-OH-Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-6278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldheyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-10</td>
			<td>Dilute to 4% in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>FGP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VECadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-605-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4099,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides Superfrost PLUS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td>25 mm x 75 mm x 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>A4974,0500</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos

Studien av de cellulære og molekylære mekanismene som ligger til grunn for utviklingen av pattedyrhjertet, er viktig for å håndtere menneskelig medfødt hjertesykdom. Utviklingen av de primitive hjerteklaffene innebærer epitel-til-mesenkymal overgang (EMT) av endokardiale celler fra atrioventrikulærkanalen (AVC) og utstrømningskanalen (OFT) i hjertet som respons på lokale induktive myokard- og endokardiale signaler. Når cellene delaminerer og invaderer den ekstracellulære matrisen (hjertegelé) som ligger mellom endokardiet og myokardiet, dannes de primitive endokardputene (EC). Denne prosessen innebærer at endokardiet må fylle hullene som er igjen av de delaminerte cellene og må omorganisere seg for å konvergere (smale) eller forlenge (forlenge) langs en akse. Nåværende forskning har implisert den plane cellepolaritetsveien (PCP) for å regulere den subcellulære lokaliseringen av faktorene som er involvert i denne prosessen. Klassisk har de innledende fasene av hjerteventilutvikling blitt studert i tverrsnitt av embryonale hjerter eller i ex vivo AVC eller OFT-eksplanter dyrket på kollagengeler. Disse tilnærmingene tillater analyse av apico-basal polaritet, men tillater ikke analyse av celleadferd i epitelets plan eller av de morfologiske endringene i migrerende celler. Her viser vi en eksperimentell tilnærming som tillater visualisering av endokardiet ved valvulogene regioner som et planfelt av celler. Denne eksperimentelle tilnærmingen gir mulighet til å studere PCP, plan topologi og intercellulær kommunikasjon innenfor endokardiet til OFT og AVC under ventilutvikling. Dechiffrering av nye cellulære mekanismer involvert i hjerteklaffmorfogenese kan bidra til å forstå medfødt hjertesykdom assosiert med endokardputedefekter.

Dataene som genereres ved hjelp av denne protokollen viser at det er mulig å utføre en ansiktsavbildning av endokardiet til AVC. Det første målet var å analysere endokardets celleform under dannelsen av ventilene med en cellulær oppløsning (figur 1). For å synliggjøre individuelle endokardceller ved E9.5 brukte vi to transgene musestammer. (1) ROSA mT / mG er et tofarget fluorescerende Cre reporter allel (tdTomato / mT og EGFP / mG) hvi...

Watch this Scientific Journal Video about En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos at JoVE.com

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Klassisk har endokardiet til musens embryonale ventil primordium blitt analysert ved hjelp av transversale, koronale eller sagittale seksjoner. Vår nye tilnærming til en ansikt, todimensjonal avbildning av endokardiet ved valvulogene regioner tillater plan polaritet og celleomorganiseringsanalyse av endokardiet under ventilutvikling.

En Face Endokardial puteforberedelse for plan morfogeneseanalyse i museembryoer

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

Denne protokollen tillater analyse av primitivt endokard i en plan orientering. Vi kan analysere fordelingen av endokardiale celler, anisotropien av andre påbud, og beskrive formen på en enkelt endokardial celle under ventilutvikling. Sammenlignet med de klassiske vevsseksjonene, tillater en-ansiktsavbildningen av den indre ventilregenerative regionen analyse av plan cellepolaritet og dynamikk av endokardiale celler under ventilutvikling i intakte embryoer.Denne metoden kan brukes til å utdype kunnskapen om plan cellepolaritet under kardioutvikling. Begynn med å plassere livmoren skåret ut fra avlivede gravide mus i en petriskål som inneholder iskald PBT. Fjern den enkelte deciduye fra livmoren under et dissekeringsmikroskop ved hjelp av fine tang.Bruk fin pinsett, gjør et snitt i den hvite delen av deciduaen, som er der embryoet er. Fjern det forsiktig, unngå å trekke, og overfør embryoene til en ny petriskål med fersk PBT ved hjelp av en P-1000 med spissen avskåret, og la en diameter stor nok til at et embryo kan passere gjennom uten å bryte. For genotyping, ta et lite stykke av eggeplomme sac ca 0,5 kvadrat millimeter eller et stykke av halen fra den bakre enden, telle fem til 10 somitter mot hodet og fordøye det i 100 milliliter av riktig buffer.Under avtrekkshetten, overfør embryoene til iskald 4% PFA i et to milliliter mikrosentrifugerør ved fire grader Celsius. Fest embryoene fra to timer til over natten ved fire grader Celsius på en nutator. Under avtrekkshetten, fjern 4% PFA-fiksativet fra mikrosentrifugerørene uten å berøre embryoene.Kast PFA i en egnet beholder. Vask embryoene fem ganger i kald PBT i 10 minutter ved romtemperatur. Bruk fine tang, fjern hjertet og overfør det til et nytt 1,5 milliliter mikrosentrifugerør med fersk PBT.Bytt ut PBT med PBS Triton og vask prøvene tre ganger, fem minutter hver, ved romtemperatur på en orbital shaker. Erstatt PBS Triton med en blokkerende løsning som inneholder PBS Triton med 10 % varmeinaktivert bovint serum. Inkuber fra to timer til over natten ved fire grader Celsius på en orbital shaker.Erstatt blokkeringsoppløsningen med blokkeringsoppløsning som inneholder primært antistoff ved ønsket konsentrasjon. Inkuber over natten på en orbital shaker ved fire grader Celsius. Etter nattlig inkubasjon ved fire grader Celsius, inkuberer prøvene i 1,5 timer ved romtemperatur på en orbital shaker.Dette trinnet er avgjørende for å øke signal-til-støy-forholdet. Fjern og hold den primære antistoffoppløsningen ved fire grader Celsius, opptil tre fremtidige eksperimenter. Tilsett natriumazid til en endelig konsentrasjon på 0,02% for best mulig bevaring.Vask deretter embryoene tre ganger med PBS Triton i tre minutter hver. Vask embryoene med PBS Triton tre ganger i 30 minutter og hold dem på en orbital shaker ved fire grader Celsius. Etter siste vask, tilsett en milliliter blokkeringsløsning som inneholder fluorescenskonjugert sekundært antistoff mot den primære antistoffvertsarten.Tilsett deretter DAPI i løsningen og inkuber embryoene over natten på en orbital shaker ved fire grader Celsius. Etter nattens inkubasjon ved fire grader Celsius, inkuberer embryoene i 1,5 timer ved romtemperatur på en orbital shaker. Dette trinnet er viktig for å øke signal-til-støy-forholdet.Gjenta PBS Triton-vasketrinnene som nevnt i tekstmanuskriptet. Sett hjertene på en 35 millimeter petriskål som inneholder PBS. Bruk en wolframtråd og fine tang, isoler den atrioventrikulære kanalen eller utløpskanalen og kutt dem i lengderetningen.Forbered deksellapper, lysbilder, tang, en P-200-pipette med passende spisser, et papirhåndkle og eventuelle vandige glyserolbaserte monteringsmedier for fluorescens uten DAPI. Fest to striper med tape på et lysbilde atskilt med 0,3 til 0,6 centimeter for å skape et 3D-romrom som gjør at prøvene kan bevare sin opprinnelige form uten å klemme dem. Deretter, ved hjelp av omtrent 20 mikroliter buffer, slipp prøvene forsiktig på lysbildet mellom båndstrimlene ved hjelp av en kuttet P-200 pipettespiss.Bruk et dissekeringsmikroskop for å øke nøyaktigheten. Bruk fine tang til å plassere prøvene med endokardiet vendt opp og myokardiet ned på lysbildet. Fjern overflødig PBS med et papirhåndkle og unngå å berøre prøven.Tørk deretter prøvene i ett til to minutter ved romtemperatur for å få prøvene til å feste seg til lysbildet. Tilsett 40 mikroliter vandige monteringsmedier til vevet. Plasser dekselet gli over de to delene av tape og senk det sakte på vevet med en nål eller tang.Unngå å skape luftbobler. Forsegl dekselet med en dråpe neglelakk på hvert toppunkt på dekselet. Når neglelakken er tørr, rengjør du overflødig monteringsmedium fra sidene av dekselet ved å bruke et absorberende papirhåndkle.Unngå å flytte dekselet. Tilsett neglelakk langs dekselets glidekanter for å forsegle den helt, og forhindre fordampning av monteringsmedier. Bruk et stående eller invertert konfokalt mikroskop, ta bilder med 10X forstørrelse for generell visning og ved 63X med 3X zoom for detaljerte bilder.Endokardiets celleform ble analysert under dannelsen av ventilene ved en cellulær oppløsning. Enkeltceller eller kloner av noen få celler uttrykte GFP i endokardiet. GFP-uttrykket og kombinasjonen med VE-cadherin subcellulær lokalisering var en effektiv tilnærming for å studere forholdet mellom AJ-dynamikk og filopodidannelse og pre-EMT-celler, siden disse cellene utviklet membranfremspring når AJs oppløses.Forskjeller i intensiteten av VE-cadherinfarging i endokardiet indikerte tilstedeværelsen av anisotropisk kontraktilitet i det embryonale endokardiet i den atrioventrikulære kanalen i pre-valvulære stadier. Hele hjertet var farget med VE-cadherin antistoff på E8.5 og E9.5. Ved E8.5 hadde endokardiet i den atrioventrikulære kanalen en tendens til å ha en stabil epitelorganisasjon, og toppunkter dannet av mer enn fire celler ble ikke påvist.Ved E9.5 ble det observert toppunkter på opptil seks celler som dannet rosettlignende strukturer, lik den cellulære organisasjonen som tidligere er beskrevet i epitel som gjennomgår aktive celleomorganiseringer, noe som tyder på at det atrioventrikulære endokardiet gjennomgikk dynamisk cellulær omorganisering under ventilutvikling. En læringskurve er nødvendig for å bli ekspert på denne teknikken. Videre anbefales det sterkt å bruke Sovereign tang og wolframtråd.I dag var visualisering av prevalvulært endokard begrenset til tverrsnitt. Vår tilnærming gir mulighet til å studere embryonal valvulær endokardadferd fra et planmessig synspunkt.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Kontrast Imaging i Mouse Embryoer hjelp Høyfrekvente ultralyd

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Utarbeidelse av mitokondriell beriket Fraksjoner for Metabolsk analyse i<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Stabil og effektiv genmodifisering av Celler i Adult Mouse V-SVZ for Analyse av Neural Stem Cell autonome og ikke-autonome Effects

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Metoder for Nettopp Lokalisert Overføring av celler eller DNA i Early fostertap Mouse Embryoer

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analyse av Protein Expression å studere Lineage Spesifikasjon i Mouse Før implantasjon Embryoer

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativ hele-mount Immunofluorescence analyse av Cardiac stamfar populasjoner i Mouse embryoer

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Følgende Endocardial vev bevegelser via celle Photoconversion i sebrafisk Embryo

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

I Vivo Avbildning av muskel-sene Morphogenesis i Drosophila Pupae

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount i Situ hybridisering for Astyanax embryo

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...