Name: en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos
Uploaded: 2022-07-27T14:30:00
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Este estudo foi apoiado pelas bolsas PID2019-104776RB-I00 e CB16/11/00399 (CIBER CV) de MCIN/AEI/10.13039/501100011033 para J. L. P. J.G.-B. foi financiado pelo Programa de Atracción de Talento da Comunidade de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. foi financiado pela Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Agradecemos à Unidade CNIC de Microscopia e Imagem Dinâmica, CNIC, ICTS-ReDib, cofinanciada pelo MCIN/AEI/10.13039/501100011033 e FEDER "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Agradecemos também a A. Galicia e L. Méndez pela criação de ratos. O custo desta publicação foi parcialmente suportado por fundos do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional. O CNIC é apoiado pelo ISCIII, pelo MCIN e pela Fundação Pro CNIC e é um Centro de Excelência Severo Ochoa (bolsa CEX2020-001041-S) financiado pelo MCIN/AEI /10.13039/501100011033.

Os estudos em animais foram aprovados pelo Comité de Ética em Experimentação Animal do Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) e pela Comunidade de Madrid (ref. PROEX 155.7/20). Todos os procedimentos relativos aos animais estavam em conformidade com a Diretiva da UE 2010/63UE e a Recomendação 2007/526/CE relativa à proteção dos animais utilizados para fins experimentais e outros fins científicos, promulgados na legislação espanhola ao abrigo do Real Decreto 1201/2005.
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<ol>
	<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells.">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).</li><li>Ivanovitch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=outflow+tract+heart+progenitors+arise+from+spatially+and+molecularly+distinct+regions+of+the+primitive+streak.">outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak.</a> PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).</li><li>Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+promotes+epithelial-mesenchymal+transition+during+cardiac+development+and+oncogenic+transformation.">Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation.</a> Genes &amp; Development. 18 (1), 99-115 (2004).</li><li>Luna-Zurita, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+a+Notch-dependent+mesenchymal+gene+program+and+Bmp2-driven+cell+invasiveness+regulates+murine+cardiac+valve+formation.">Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).</li><li>Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+of+EMT:+Lessons+from+live+in+vivo+imaging+of+embryonic+development.">Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development.</a> Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).</li><li>Cano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+controls+epithelial-mesenchymal+transitions+by+repressing+E-cadherin+expression.">The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).</li><li>Batlle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+is+a+repressor+of+E-cadherin+gene+expression+in+epithelial+tumour+cells.">The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).</li><li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-dependent+remodeling+of+adherens+junctions+protects+junctions+from+Snail-dependent+disassembly.">Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly.</a> Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).</li><li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+protein+Par3/Bazooka+follows+myosin-dependent+junction+repositioning.">Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning.</a> Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).</li><li>Jimenez-Amilburu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+cardiomyocyte+apicobasal+polarity+reveals+epithelial+to+mesenchymal-like+transition+during+cardiac+trabeculation.">In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation.</a> Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).</li><li>Davey, C. F., Moens, C. 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P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+and+Vangl2+cooperate+in+the+initiation+of+planar+cell+polarity+in+the+mouse+embryo.">Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo.</a> Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).</li><li>Devenport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+morphodynamics:+Translating+planar+polarity+cues+into+polarized+cell+behaviors.">Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).</li><li>Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Notch1+activity+in+development:+Evidence+for+a+feedback+regulatory+loop.">Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop.</a> Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).</li><li>Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+node+and+notochordal+plate+in+gastrulating+mouse+embryos+using+scanning+electron+microscopy+and+whole+mount+immunofluorescence.">Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).</li><li>Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+avian+embryonic+valvular+progenitor+cells.">Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-B2+controls+VEGF-induced+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).</li><li>Yilmaz, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMT,+the+cytoskeleton,+and+cancer+cell+invasion.">EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).</li><li>Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+links+axes+of+spatial+dynamics+in+neural-tube+closure.">Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure.</a> Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).</li><li>Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis.">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).</li><li>Prados, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Bmp2+gain+causes+ectopic+EMT+and+promotes+cardiomyocyte+proliferation+and+immaturity.">Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity.</a> Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).</li><li>Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cardiac+cushion+development+by+hyaluronan.">Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan.</a> Experimental &amp; Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).</li><li>Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+blood+flow+on+cardiac+development.">Influence of blood flow on cardiac development.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).</li><li>Goddard, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+sculpt+developing+heart+valves+through+a+KLF2-WNT9B+paracrine+signaling+axis.">Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis.</a> Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).</li></ol>

O endocárdio é uma monocamada epitelial que cobre toda a superfície interna do tubo cardíaco embrionário. Durante o desenvolvimento valvar, as células endocárdicas nas regiões valvares prospectivas sofrem EMT, assim, as células endocárdicas se transformam e reorganizam seu citoesqueleto para delaminar do endocárdio em direção à geleia cardíaca. Nós e outros obtivemos dados relevantes sobre o desenvolvimento valvar em embriões de camundongos analisando cortes transversais de corações embrionários E8.5 ...

O coração é o primeiro órgão funcional de um embrião de mamíferos. Por volta do dia embrionário (E) 7,5 em camundongos, células mesodérmicas pré-cardíacas bilaterais formam o crescente cardíaco no lado ventral1. O crescente cardíaco contém duas populações de células pré-cardíacas que incluem progenitores do miocárdio e do endocárdio2. Por volta de E8.0, os precursores cardíacos se fundem na linha média, formando o tubo cardíaco primitivo composto por dois tecidos epiteliais, o miocárdio externo e o endocárdio interno, que é um endotélio especializado separado por uma matriz extracelular chamada geleia cardíaca. Mais tarde, em E8.5, o tubo cardíaco sofre looping para a direita. O coração em alça possui diferentes regiões anatômicas com assinaturas moleculares específicas, como a via de saída (OFT), os ventrículos e o canal atrioventricular (AVC)3. Embora inicialmente o tubo cardíaco se expanda em seu lado de entrada através da adição de células4, em E9,5, a proliferação cardíaca intensiva resulta em balonamento das câmaras e estabelecimento da rede trabecular5. A formação valvar ocorre no AVC (futuras valvas mitral e tricúspide) e no OFT (futuras valvas aórtica e pulmonar).
O endocárdio desempenha papéis cruciais no desenvolvimento da válvula. As células endocárdicas sofrem transição epitelial-mesenquimal (EMT) no AVC e no OFT para formar as almofadas endocárdicas, uma estrutura que aparece no início do desenvolvimento valvar. Diferentes vias de sinalização ativam esse processo; em E9.5 em camundongos, o NOTCH ativado no endocárdio em resposta à BMP2 derivada do miocárdio promove EMT invasiva de células endocárdicas nas regiões AVC e OFT por meio da ativação de TGFβ2 e SNAIL (SNAI1), que reprime diretamente a expressão da caderina endotelial vascular (VE-caderina), um componente transmembrana das junções aderentes (AJs)6,7,8 . No OFT, a ativação do endocárdio para iniciar a EMT é mediada pelo FGF8 e BMP4, cuja expressão é ativada pelo NOTCH 9,10,11,12.
A progressão da EMT envolve a dinâmica celular à medida que as células mudam de forma, quebram e refazem junções com seus vizinhos, delaminam e começam a migrar13. Essas alterações incluem remodelamento e desmontagem gradual de AJ 14,15, sinalização de polaridade celular planar (PCP), perda de polaridade ápico-basal (PAB), constrição apical e organização citoesquelética 16,17. ABP refere-se à distribuição de proteínas ao longo do eixo anteroposterior de uma célula. No coração em desenvolvimento, a regulação da PA em cardiomiócitos é necessária para o desenvolvimento ventricular18. PCP refere-se a uma distribuição polarizada de proteínas dentro das células através do plano de um tecido e regula a distribuição celular; epitélios com geometria estável são constituídos por células em forma de hexágono, onde apenas três células convergem nos vértices 19,20,21,22. Diferentes processos celulares, como divisão celular, troca de vizinhos ou delaminação que ocorrem durante a morfogênese epitelial, produzem um aumento no número de células que convergem para um vértice e no número de células vizinhas que uma determinada célula tem22. Esses comportamentos celulares relacionados à PCP podem ser regulados por diferentes vias de sinalização, dinâmica da actina ou tráfico intracelular23.
Os dados gerados que estudam o desenvolvimento valvar em camundongos foram obtidos de cortes transversais, coronais ou sagitais de corações embrionários E8.5 e E9.5, onde o endocárdio é mostrado como uma linha de células em vez de como um campo de células - o endocárdio cobre toda a superfície interna do tubo cardíaco24. Cortes embrionários não permitem a análise de PCP no endocárdio de embriões de camundongos. Nosso novo método experimental permite a análise da distribuição de células endocárdicas, anisotropia AJ e análise da forma de célula única, como mostrado nos resultados representativos. Este tipo de dados é necessário para a análise de PCP, juntamente com a descrição de outras moléculas relacionadas com PCP, não mostradas neste relatório. A imunofluorescência total, o preparo específico de amostras e o uso de camundongos geneticamente modificados permitem a análise de polaridade planar no endocárdio no início do desenvolvimento valvar em camundongos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-OH-Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-6278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldheyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-10</td>
			<td>Dilute to 4% in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>FGP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VECadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-605-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4099,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides Superfrost PLUS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td>25 mm x 75 mm x 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>A4974,0500</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos

O estudo dos mecanismos celulares e moleculares subjacentes ao desenvolvimento do coração de mamíferos é essencial para tratar a doença cardíaca congênita humana. O desenvolvimento das valvas cardíacas primitivas envolve a transição epitelial-mesenquimal (EMT) de células endocárdicas das regiões do canal atrioventricular (CVA) e da via de saída (OFT) do coração em resposta a sinais miocárdicos e endocárdicos indutivos locais. Uma vez que as células se delaminam e invadem a matriz extracelular (geleia cardíaca) localizada entre o endocárdio e o miocárdio, formam-se as almofadas endocárdicas primitivas (CE). Este processo implica que o endocárdio tem que preencher as lacunas deixadas pelas células delaminadas e tem que se reorganizar para convergir (estreitar) ou estender (alongar) ao longo de um eixo. Pesquisas atuais implicaram a via da polaridade das células planares (PCP) na regulação da localização subcelular dos fatores envolvidos nesse processo. Classicamente, as fases iniciais do desenvolvimento da valva cardíaca têm sido estudadas em cortes transversais de corações embrionários ou em explantes ex vivo de AVC ou OFT cultivados em géis de colágeno. Essas abordagens permitem a análise da polaridade apico-basal, mas não permitem a análise do comportamento celular dentro do plano do epitélio ou das alterações morfológicas das células migratórias. Aqui, mostramos uma abordagem experimental que permite a visualização do endocárdio em regiões valvulogênicas como um campo planar de células. Esta abordagem experimental oferece a oportunidade de estudar PCP, topologia planar e comunicação intercelular dentro do endocárdio do OFT e AVC durante o desenvolvimento da válvula. Decifrar novos mecanismos celulares envolvidos na morfogênese valvar cardíaca pode contribuir para a compreensão da cardiopatia congênita associada a defeitos da almofada endocárdica.

Os dados gerados por meio desse protocolo mostram que é possível realizar imagens de face do endocárdio da AVC. O primeiro objetivo foi analisar a forma celular do endocárdio durante a formação das valvas em resolução celular (Figura 1). Para destacar as células endocárdicas individuais em E9.5, foram utilizadas duas cepas transgênicas de camundongos. (1) ROSAmT/mG é um alelo repórter Cre fluorescente de duas cores (tdTomato/mT e EGFP/mG...

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En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Classicamente, o endocárdio do primordium da válvula embrionária de camundongo foi analisado usando cortes transversais, coronais ou sagitais. Nossa nova abordagem para imagens bidimensionais en face do endocárdio em regiões valvulogênicas permite a polaridade planar e a análise de rearranjo celular do endocárdio durante o desenvolvimento valvar.

En Face Preparação de Almofadas Endocárdicas para Análise de Morfogênese Planar em Embriões de Camundongos

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

Este protocolo permite a análise do endocárdio primitivo em orientação plana. Podemos analisar a distribuição das células endocárdicas, a anisotropia de outras injunções e descrever a forma de uma única célula endocárdica durante o desenvolvimento valvar. Em comparação com as seções de tecido clássicas, a imagem en face da região regenerativa da válvula interna permite a análise da polaridade e dinâmica das células planares das células endocárdicas durante o desenvolvimento valvar em embriões intactos.Este método pode ser usado para aprofundar o conhecimento da polaridade das células planares durante o desenvolvimento cardio. Comece colocando o útero extirpado de ratas grávidas eutanasiadas numa placa de Petri contendo PBT gelado. Remova o deciduye individual do útero sob um microscópio de dissecação usando pinça fina.Usando pinças finas, faça uma incisão na parte branca da decídua, que é onde o embrião está. Removê-lo suavemente, evite puxar e transfira os embriões para uma nova placa de Petri com PBT fresco usando um P-1000 com a ponta cortada, deixando um diâmetro grande o suficiente para um embrião passar sem quebrar. Para a genotipagem, pegue um pequeno pedaço do saco vitelino de aproximadamente 0,5 milímetros quadrados ou um pedaço da cauda da extremidade posterior, contando cinco a 10 somitos em direção à cabeça e digere-o em 100 mililitros do tampão apropriado.Sob o exaustor, transfira os embriões para 4% de PFA gelado em um tubo de microcentrífuga de dois mililitros a quatro graus Celsius. Fixe os embriões de duas horas a noite a quatro graus Celsius em um nutator. Sob o exaustor, remova o fixador de 4% de PFA dos tubos de microcentrífuga sem tocar nos embriões.Rejeitar o PFA num recipiente adequado. Lave os embriões cinco vezes em PBT frio durante 10 minutos à temperatura ambiente. Usando pinça fina, remova o coração e transfira-o para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro com PBT fresco.Substitua o PBT pelo PBS Triton e lave as amostras três vezes, cinco minutos cada, à temperatura ambiente em um agitador orbital. Substitua o PBS Triton por uma solução de bloqueio contendo PBS Triton por soro bovino inativado pelo calor a 10%. Incubar de duas horas para a noite a quatro graus Celsius em um agitador orbital.Substitua a solução de bloqueio por uma solução de bloqueio contendo anticorpos primários na concentração desejada. Incubar durante a noite em um agitador orbital a quatro graus Celsius. Após incubação durante a noite a quatro graus Celsius, incubar as amostras por 1,5 horas à temperatura ambiente em um agitador orbital.Esta etapa é crucial para aumentar a relação sinal-ruído. Remova e mantenha a solução primária de anticorpos a quatro graus Celsius, até três experimentos futuros. Adicionar azida de sódio a uma concentração final de 0,02% para uma melhor conservação.Em seguida, lave os embriões três vezes com PBS Triton por três minutos cada. Lave os embriões com PBS Triton três vezes por 30 minutos e mantenha-os em um agitador orbital a quatro graus Celsius. Após a última lavagem, adicionar um mililitro de solução bloqueadora contendo anticorpo secundário conjugado com fluorescência contra a espécie hospedeira de anticorpos primários.Em seguida, adicione DAPI à solução e incube os embriões durante a noite em um agitador orbital a quatro graus Celsius. Após a incubação noturna a quatro graus Celsius, incubar os embriões por 1,5 horas à temperatura ambiente em um agitador orbital. Esta etapa é essencial para aumentar a relação sinal-ruído.Repita as etapas de lavagem do PBS Triton, conforme mencionado no manuscrito do texto. Coloque os corações em uma placa de Petri de 35 milímetros contendo PBS. Usando um fio de tungstênio e pinça fina, isole o canal atrioventricular ou a via de saída e corte-os longitudinalmente.Prepare folhas de cobertura, lâminas, pinças, uma pipeta P-200 com as pontas apropriadas, uma toalha de papel e qualquer meio de montagem aquoso à base de glicerol para fluorescência sem DAPI. Cole duas tiras de fita adesiva em uma lâmina separada por 0,3 a 0,6 centímetros para criar um espaço de sala 3D que permitirá que as amostras conservem sua forma original sem esmagá-las. Em seguida, usando aproximadamente 20 microlitros de buffer, solte cuidadosamente as amostras no slide entre as tiras de fita usando uma ponta de pipeta P-200 cortada.Use um microscópio de dissecação para aumentar a precisão. Usando pinça fina, coloque as amostras com o endocárdio voltado para cima e o miocárdio para baixo na lâmina. Remova o excesso de PBS com uma toalha de papel e evite tocar na amostra.Em seguida, seque as amostras por um a dois minutos à temperatura ambiente para fazer com que as amostras grudem na lâmina. Adicione 40 microlitros de meios de montagem à base de água ao tecido. Coloque a tampa deslize sobre os dois pedaços de fita adesiva e abaixe-a lentamente sobre o tecido com uma agulha ou pinça.Evite criar bolhas de ar. Sele a folha da tampa usando uma gota de esmalte em cada vértice da folha da tampa. Uma vez que o esmalte esteja seco, limpe o meio de montagem em excesso dos lados da tampa deslizando usando uma toalha de papel absorvente.Evite mover o deslizamento da tampa. Adicione esmalte ao longo das bordas deslizantes da tampa para selá-la completamente, evitando a evaporação do meio de montagem. Usando um microscópio confocal vertical ou invertido, tire imagens com ampliação de 10X para visualização geral e em 63X com zoom de 3X para imagens detalhadas.A forma celular do endocárdio foi analisada durante a formação das válvulas em resolução celular. Células únicas ou clones de algumas células expressaram GFP no endocárdio. A expressão de GFP e a combinação com a localização subcelular VE-caderina foi uma abordagem eficaz para estudar a relação entre a dinâmica de AJ e a formação de filópodes e as células pré-EMT, uma vez que essas células desenvolveram saliências de membrana à medida que os AJs se dissolvem.Diferenças na intensidade da coloração com VE-caderina no endocárdio indicaram a presença de contratilidade anisotrópica no endocárdio embrionário do canal atrioventricular nos estágios pré-valvares. Todo o coração foi corado com o anticorpo VE-caderina em E8.5 e E9.5. Em E8,5, o endocárdio do canal atrioventricular tendeu a ter uma organização epitelial estável, e vértices formados por mais de quatro células não foram detectados.Em E9,5, foram observados vértices de até seis células formando estruturas semelhantes a rosetas, semelhantes à organização celular descrita anteriormente no epitelial submetido a rearranjos celulares ativos, sugerindo que o endocárdio do canal atrioventricular estava passando por rearranjo celular dinâmico durante o desenvolvimento valvar. Uma curva de aprendizado é necessária para se tornar um especialista nessa técnica. Além disso, é altamente recomendável usar pinça soberana e fio de tungstênio.Hoje, a visualização do endocárdio pré-valvar limitava-se aos cortes transversais. Nossa abordagem oferece a possibilidade de estudar o comportamento do endocárdio valvar embrionário de um ponto de vista planar.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Imagem Contraste em embriões de camundongos Usando de alta freqüência ultra-som

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Biologia do Desenvolvimento

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparação de mitocondriais frações enriquecidas para Análise metabólica em<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Estável e eficiente modificação genética de células do rato adulto V-SVZ para a Análise da Neural Stem Cell Autónoma e Efeitos não autónomos

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Métodos de Transferência Precisamente localizada de células ou DNA em adiantado postimplantation embriões de camundongos

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Análise quantitativa da expressão da proteína para estudar Especificação Lineage no mouse Preimplantation Embriões

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análise quantitativa da imunofluorescência toda a montagem das populações do Progenitor cardíaca em embriões de rato

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Seguindo os movimentos de tecido endocárdico através de célula Photoconversion no embrião Zebrafish

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Na Vivo Imagem latente da morfogênese músculo-tendão em pupas de Drosophila

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualizando o nó e placa Notochordal em Gastrulating embriões de rato usando microscopia eletrônica e imunofluorescência de montagem inteira

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Hibridização In Situ de Embriões Inteiros de Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...