Name: en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos
Uploaded: 2022-07-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантами PID2019-104776RB-I00 и CB16/11/00399 (CIBER CV) от MCIN/AEI/10.13039/501100011033 J.L.P.J.G.-B. финансировался Программой развития талантов из Мадридской коммуны (2020-5ª/BMD-19729). Т.Г.-К. финансировался организацией «Аюдас за формирование университетских профессоров» (FPU18/01054). Мы благодарим Отдел микроскопии и динамической визуализации CNIC, CNIC, ICTS-ReDib, совместно финансируемый MCIN/AEI /10.13039/501100011033 и FEDER «Способ сделать Европу» (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Мы также благодарим А. Галисию и Л. Мендеса за разведение мышей. Стоимость этой публикации была частично поддержана за счет средств Европейского фонда регионального развития. CNIC поддерживается ISCIII, MCIN и Pro CNIC Foundation и является Центром передового опыта Северо Очоа (грант CEX2020-001041-S), финансируемым MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033.

Исследования на животных были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) и Сообществом Мадрида (ref. PROEX 155.7/20). Все процедуры для животных соответствовали Директиве ЕС 2010/63EU и Рекомендации 2007/526/EC о защите животных, используемых в эксперименталь?...

<ol>
	<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells.">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).</li><li>Ivanovitch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=outflow+tract+heart+progenitors+arise+from+spatially+and+molecularly+distinct+regions+of+the+primitive+streak.">outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak.</a> PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).</li><li>Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+controlling+second+heart+field+development.">Signaling pathways controlling second heart field development.</a> Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).</li><li>Moorman, A. F., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+chamber+formation:+Development,+genes,+and+evolution.">Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution.</a> Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).</li><li>Timmerman, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+promotes+epithelial-mesenchymal+transition+during+cardiac+development+and+oncogenic+transformation.">Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation.</a> Genes &amp; Development. 18 (1), 99-115 (2004).</li><li>Luna-Zurita, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+a+Notch-dependent+mesenchymal+gene+program+and+Bmp2-driven+cell+invasiveness+regulates+murine+cardiac+valve+formation.">Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).</li><li>Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp2+and+Notch+cooperate+to+pattern+the+embryonic+endocardium.">Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium.</a> Development. 145 (13), (2018).</li><li>MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+cardiac+valve+development+and+disease.">Notch signaling in cardiac valve development and disease.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).</li><li>de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+tissue+interactions:+Notch+signaling+in+cardiac+development+and+disease.">Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease.</a> Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nfatc1+coordinates+valve+endocardial+cell+lineage+development+required+for+heart+valve+formation.">Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation.</a> Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).</li><li>Amack, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+of+EMT:+Lessons+from+live+in+vivo+imaging+of+embryonic+development.">Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development.</a> Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).</li><li>Cano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+controls+epithelial-mesenchymal+transitions+by+repressing+E-cadherin+expression.">The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).</li><li>Batlle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+is+a+repressor+of+E-cadherin+gene+expression+in+epithelial+tumour+cells.">The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).</li><li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-dependent+remodeling+of+adherens+junctions+protects+junctions+from+Snail-dependent+disassembly.">Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly.</a> Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).</li><li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+protein+Par3/Bazooka+follows+myosin-dependent+junction+repositioning.">Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning.</a> Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).</li><li>Jimenez-Amilburu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+cardiomyocyte+apicobasal+polarity+reveals+epithelial+to+mesenchymal-like+transition+during+cardiac+trabeculation.">In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation.</a> Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).</li><li>Davey, C. F., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+in+moving+cells:+Think+globally,+act+locally.">Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally.</a> Development. 144 (2), 187-200 (2017).</li><li>Grego-Bessa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+PTEN+and+the+PDK1+kinase+regulate+formation+of+the+columnar+neural+epithelium.">The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium.</a> Elife. 5, 12034 (2016).</li><li>Jones, C., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+in+vertebrates.">Planar cell polarity signaling in vertebrates.</a> Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).</li><li>Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+and+Vangl2+cooperate+in+the+initiation+of+planar+cell+polarity+in+the+mouse+embryo.">Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo.</a> Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).</li><li>Devenport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+morphodynamics:+Translating+planar+polarity+cues+into+polarized+cell+behaviors.">Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).</li><li>Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Notch1+activity+in+development:+Evidence+for+a+feedback+regulatory+loop.">Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop.</a> Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).</li><li>Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+node+and+notochordal+plate+in+gastrulating+mouse+embryos+using+scanning+electron+microscopy+and+whole+mount+immunofluorescence.">Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).</li><li>Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+avian+embryonic+valvular+progenitor+cells.">Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-B2+controls+VEGF-induced+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).</li><li>Yilmaz, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMT,+the+cytoskeleton,+and+cancer+cell+invasion.">EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).</li><li>Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+links+axes+of+spatial+dynamics+in+neural-tube+closure.">Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure.</a> Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).</li><li>Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis.">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).</li><li>Prados, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Bmp2+gain+causes+ectopic+EMT+and+promotes+cardiomyocyte+proliferation+and+immaturity.">Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity.</a> Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).</li><li>Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cardiac+cushion+development+by+hyaluronan.">Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan.</a> Experimental &amp; Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).</li><li>Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+blood+flow+on+cardiac+development.">Influence of blood flow on cardiac development.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).</li><li>Goddard, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+sculpt+developing+heart+valves+through+a+KLF2-WNT9B+paracrine+signaling+axis.">Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis.</a> Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).</li></ol>

Эндокард представляет собой эпителиальный монослой, который покрывает всю внутреннюю поверхность эмбриональной сердечной трубки. Во время развития клапана клетки эндокарда в перспективных клапанных областях подвергаются ЭМТ, таким образом, клетки эндокарда трансформируются и пере?...

Сердце является первым функциональным органом эмбриона млекопитающего. Около эмбрионального дня (E) 7,5 у мышей двусторонние клетки прекардиальной мезодермы образуют сердечный полумесяц в вентральной стороне1. Сердечный полумесяц содержит две популяции прекардиальных клеток, которые включают предшественников миокарда и эндокарда2. Около E8.0 сердечные предшественники сливаются в средней линии, образуя примитивную сердечную трубку, состоящую из двух эпителиальных тканей, наружного миокарда и внутреннего эндокарда, который представляет собой специализированный эндотелий, разделенный внеклеточным матриксом, называемым сердечным желе. Позже, при E8.5, сердечная трубка подвергается правой петле. Петлевое сердце имеет различные анатомические области со специфическими молекулярными сигнатурами, такими как отток (OFT), желудочки и атрио-желудочковый канал (AVC)3. Хотя первоначально сердечная трубка расширяется на стороне притока за счет добавления клеток4, при E9.5 интенсивная пролиферация сердца приводит к раздуванию камер и созданию трабекулярной сети5. Образование клапанов происходит в АВК (будущие митральные и трикуспидальные клапаны) и в ОФТ (будущие аортальные и легочные клапаны).
Эндокард играет решающую роль в развитии клапанов. Клетки эндокарда подвергаются эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМТ) в АВК и ОФТ с образованием эндокардиальных подушек, структуры, которая появляется в начале развития клапана. Различные сигнальные пути активируют этот процесс; при E9.5 у мышей NOTCH активируется в эндокарде в ответ на BMP2, полученный из миокарда, способствует инвазивной ЭМТ эндокардиальных клеток в областях AVC и OFT посредством активации TGFβ2 и SNAIL (SNAI1), что непосредственно подавляет экспрессию сосудистого эндотелиального кадгерина (VE-кадгерина), трансмембранного компонента адгезивных переходов (AJs)6,7,8 . В OFT активация эндокарда для инициирования EMT опосредована FGF8 и BMP4, экспрессия которых активируется NOTCH 9,10,11,12.
Прогрессирование ЭМТ включает в себя клеточную динамику, поскольку клетки меняют форму, ломают и переделывают соединения со своими соседями, расслаиваются и начинают мигрировать13. Эти изменения включают ремоделирование AJ и постепенную разборку 14,15, передачу сигналов полярности плоских клеток (PCP), потерю апико-базальной полярности (ABP), апикальное сужение и цитоскелетную организацию 16,17. ABP относится к распределению белков вдоль передне-задней оси клетки. В развивающемся сердце регуляция АБП в кардиомиоцитах необходима для развития желудочков18. PCP относится к поляризованному распределению белков внутри клеток по всей плоскости ткани и регулирует клеточное распределение; эпителии со стабильной геометрией состоят из шестиугольных клеток, где только три клетки сходятся в вершинах 19,20,21,22. Различные клеточные процессы, такие как деление клеток, обмен соседей или расслоение, происходящие во время эпителиального морфогенеза, приводят к увеличению числа клеток, которые сходятся на вершине, и количества соседних клеток, которые данная клетка имеет22. Это клеточное поведение, связанное с PCP, может регулироваться различными сигнальными путями, динамикой актина или внутриклеточным трафиком23.
Полученные данные, изучающие развитие клапанов у мышей, были получены из поперечных, корональных или сагиттальных срезов эмбриональных сердец Е8,5 и Е9,5, где эндокард показан в виде линии клеток, а не как поле клеток — эндокард покрывает всю внутреннюю поверхность сердечной трубки24. Эмбриональные срезы не позволяют проводить анализ ПЦП в эндокарде эмбрионов мышей. Наш новый экспериментальный метод позволяет анализировать распределение клеток эндокарда, анизотропию AJ и анализ формы одной клетки, как показано в репрезентативных результатах. Этот тип данных необходим для анализа PCP вместе с описанием других молекул, связанных с PCP, не показанных в этом отчете. Цельная иммунофлуоресценция, специфическая пробоподготовка и использование генетически модифицированных мышей позволяют проводить планарный анализ полярности в эндокарде в начале развития клапана у мышей.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-OH-Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-6278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldheyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-10</td>
			<td>Dilute to 4% in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>FGP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VECadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-605-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4099,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides Superfrost PLUS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td>25 mm x 75 mm x 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>A4974,0500</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos

Изучение клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе развития сердца млекопитающих, имеет важное значение для лечения врожденных пороков сердца человека. Развитие примитивных сердечных клапанов включает эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМТ) клеток эндокарда из атриовентрикулярного канала (АВК) и оттоковых путей (ОФТ) сердца в ответ на местные индуктивные сигналы миокарда и эндокарда. Как только клетки расслаиваются и вторгаются во внеклеточный матрикс (сердечный желе), расположенный между эндокардом и миокардом, образуются примитивные эндокардиальные подушки (ЭК). Этот процесс подразумевает, что эндокард должен заполнить пробелы, оставленные расслоенными клетками, и должен реорганизоваться, чтобы сойтись (сузить) или расширить (удлинить) вдоль оси. Текущие исследования показали, что путь полярности плоских клеток (PCP) регулирует субклеточную локализацию факторов, участвующих в этом процессе. Классически, начальные фазы развития сердечного клапана были изучены в поперечных сечениях эмбриональных сердец или эксплантатов in vivo AVC или OFT, культивируемых на коллагеновых гелях. Эти подходы позволяют анализировать апико-базальную полярность, но не позволяют анализировать поведение клеток в плоскости эпителия или морфологические изменения мигрирующих клеток. Здесь мы показываем экспериментальный подход, позволяющий визуализировать эндокард в вальвулогенных областях как плоское поле клеток. Такой экспериментальный подход дает возможность изучать ПЦП, планарную топологию и межклеточную связь в эндокарде OFT и AVC при разработке клапана. Расшифровка новых клеточных механизмов, участвующих в морфогенезе сердечного клапана, может способствовать пониманию врожденных пороков сердца, связанных с дефектами эндокардиальной подушки.

Данные, сгенерированные с использованием этого протокола, показывают, что можно выполнить визуализацию лица эндокарда АВК. Первая цель состояла в том, чтобы проанализировать клеточную форму эндокарда во время формирования клапанов при клеточном разрешении (рисунок 1</s...

Watch this Scientific Journal Video about En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos at JoVE.com

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Классически эндокард примордия эмбрионального клапана мыши был проанализирован с использованием поперечного, коронального или сагиттального сечений. Наш новый подход к двумерной визуализации эндокарда в вальвулогенных областях позволяет проводить анализ плоской полярности и клеточной перестройки эндокарда во время развития клапана.

En Лицо Подготовка эндокардиальной подушки к анализу планарного морфогенеза у эмбрионов мышей

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

Этот протокол позволяет проводить анализ примитивного эндокарда в плоскостной ориентации. Мы можем проанализировать распределение клеток эндокарда, анизотропию других предписаний и описать форму одной эндокардиальной клетки во время развития клапана. По сравнению с классическими тканевыми срезами, визуализация лица регенеративной области внутреннего клапана позволяет анализировать полярность плоских клеток и динамику клеток эндокарда при развитии клапана у интактных эмбрионов.Этот метод может быть использован для углубления знаний о полярности плоских клеток во время кардиоразвития. Начните с помещения матки, иссеченной у усыпленных беременных мышей, в чашку Петри, содержащую ледяной ПБТ. Удалите индивидуальную децидуйку из матки под рассекающим микроскопом с помощью тонких щипцов.Используя тонкий пинцет, сделайте разрез в белой части децидуа, где находится эмбрион. Аккуратно удалите его, избегайте вытягивания и перенесите эмбрионы в новую чашку Петри со свежим ПБТ, используя P-1000 с отрезанным наконечником, оставив диаметр, достаточно большой, чтобы эмбрион мог пройти, не ломаясь. Для генотипирования возьмите небольшой кусочек желточного мешочка примерно 0,5 квадратных миллиметра или кусочек хвоста от заднего конца, считая от пяти до 10 сомитов по направлению к голове и переварите его в 100 миллилитрах соответствующего буфера.Под вытяжным капюшоном перенесите эмбрионы в ледяной холод 4% PFA в двухмиллилитровой микроцентрифужной трубке при четырех градусах Цельсия. Зафиксируйте эмбрионы от двух часов до ночи при четырех градусах Цельсия на нутриторе. Под вытяжной капюшоном извлеките фиксатор 4% PFA из микроцентрифужных трубок, не касаясь эмбрионов.Выбросьте PFA в соответствующий контейнер. Промыть эмбрионы пять раз в холодном ПБТ в течение 10 минут при комнатной температуре. Используя тонкие щипцы, удалите сердце и перенесите его в новую 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку со свежим ПБТ.Замените PBT на PBS Triton и промывайте образцы трижды, по пять минут каждый, при комнатной температуре на орбитальном шейкере. Заменить PBS Triton блокирующим раствором, содержащим PBS Triton с 10% термоинактивированной бычьей сывороткой. Насиживайте от двух часов до ночи при четырех градусах Цельсия на орбитальном шейкере.Замените блокирующий раствор блокирующим раствором, содержащим первичные антитела в нужной концентрации. Насиживайте ночью на орбитальном шейкере при четырех градусах Цельсия. После ночной инкубации при четырех градусах Цельсия инкубируют образцы в течение 1,5 часов при комнатной температуре на орбитальном шейкере.Этот шаг имеет решающее значение для увеличения отношения сигнал/шум. Удалите и сохраните раствор первичного антитела при четырех градусах Цельсия, до трех будущих экспериментов. Добавьте азид натрия до конечной концентрации 0,02% для лучшего сохранения.Затем трижды промойте эмбрионы PBS Triton в течение трех минут каждый. Промыть эмбрионы PBS Triton трижды в течение 30 минут и держать их на орбитальном шейкере при четырех градусах Цельсия. После последней промывки добавляют один миллилитр блокирующего раствора, содержащего флуоресцентно-конъюгированное вторичное антитело против первичного антитела-хозяина.Затем добавьте DAPI в раствор и высиживайте эмбрионы в течение ночи на орбитальном шейкере при четырех градусах Цельсия. После ночной инкубации при четырех градусах Цельсия инкубируют эмбрионы в течение 1,5 часов при комнатной температуре на орбитальном шейкере. Этот шаг необходим для увеличения отношения сигнал/шум.Повторите шаги промывки PBS Triton, как указано в тексте рукописи. Положите сердечки на 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую PBS. Используя вольфрамовую проволоку и тонкие щипцы, изолируйте атриовентрикулярный канал или отток и разрезайте их продольно.Подготовьте крышки, слайды, щипцы, пипетку P-200 с соответствующими наконечниками, бумажное полотенце и любые водные монтажные среды на основе глицерина для флуоресценции без DAPI. Наклейте две полоски ленты на слайд, разделенный от 0,3 до 0,6 сантиметра, чтобы создать пространство 3D-комнаты, которое позволит образцам сохранить свою первоначальную форму, не раздавливая их. Затем, используя приблизительно 20 микролитров буфера, осторожно опустите образцы на слайд между ленточными полосами, используя разрезанный наконечник пипетки P-200.Используйте рассекающий микроскоп для повышения точности. Используя тонкие щипцы, поместите образцы эндокардом вверх, а миокард вниз на слайд. Удалите излишки PBS бумажным полотенцем и избегайте прикосновения к образцу.Затем высушите образцы в течение одной-двух минут при комнатной температуре, чтобы образцы прилипли к слайду. Добавьте в ткань 40 микролитров монтажной среды на водной основе. Поместите крышку поверх двух кусков ленты и медленно опустите ее на ткань с помощью иглы или щипцов.Избегайте создания пузырьков воздуха. Запечатайте крышку, используя одну каплю лака для ногтей на каждой вершине крышки. Как только лак для ногтей высохнет, очистите лишние монтажные материалы с боковых сторон крышки с помощью абсорбирующего бумажного полотенца.Избегайте перемещения крышки. Добавьте лак для ногтей вдоль краев крышки, чтобы полностью запечатать ее, предотвращая испарение монтажной среды. Используя вертикальный или перевернутый конфокальный микроскоп, делайте снимки с 10-кратным увеличением для общего обзора и в 63 раза с 3-кратным зумом для получения подробных изображений.Клеточную форму эндокарда анализировали при образовании клапанов при клеточном разрешении. Одиночные клетки или клоны нескольких клеток экспрессировали GFP в эндокарде. Экспрессия и комбинация GFP с субклеточной локализацией VE-кадгерина была эффективным подходом к изучению взаимосвязи между динамикой AJ и образованием филоподий и клетками до EMT, поскольку у этих клеток развились протрузии мембраны при растворении AJ.Различия в интенсивности окрашивания VE-кадгерина в эндокарде свидетельствовали о наличии анизотропной сократимости в эмбриональном эндокарде атриовентрикулярного канала на предклапанных стадиях. Все сердце было окрашено антителом к VE-кадгерину на E8.5 и E9.5. При Е8.5 эндокард атриовентрикулярного канала имел тенденцию иметь стабильную эпителиальную организацию, а вершины, образованные более чем четырьмя клетками, не были обнаружены.При E9.5 наблюдались вершины до шести клеток, образующие розеткоподобные структуры, подобные клеточной организации, ранее описанной в эпителиале, претерпевающей активные клеточные перестройки, предполагая, что эндокард атриовентрикулярного канала претерпевает динамическую клеточную перестройку во время развития клапана. Кривая обучения необходима, чтобы стать экспертом в этой технике. Кроме того, настоятельно рекомендуется использовать суверенные щипцы и вольфрамовую проволоку.Сегодня визуализация предклапанного эндокарда ограничивалась поперечными сечениями. Наш подход дает возможность изучать поведение эмбрионального клапанного эндокарда с плоской точки зрения.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Контраст изображений в эмбрионов мыши с помощью высокочастотной ультразвуковой

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Подготовка митохондриальных Обогащенный фракций для метаболического анализа в<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Стабильной и эффективной генетической модификации клеток у мышей взрослых V-СВЗ для анализа нейронных стволовых клеток автономный и Неавтономные эффекты

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Методы Именно локализованного передачи ячеек или ДНК в начале постимплантационных эмбрионов мыши

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Количественный анализ экспрессии белка по изучению Lineage Спецификация в клетках мышиной предимплантационной эмбрионов

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Анализ количественного состава Гора иммунофлюоресценции сердечной прародитель населения в эмбрионов мыши

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

После эндокарда ткани движения через ячейки Photoconversion в Zebrafish эмбриона

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

В естественных условиях Imaging мышц сухожилие морфогенеза в куколки дрозофилы

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Визуализация узлов и Notochordal пластины в Gastrulating эмбрионов мыши, используя растровая электронная микроскопия и вся гора иммунофлуоресценции

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount в гибридизации Situ Астианакт эмбрионов

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...