Name: en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos
Uploaded: 2022-07-27T14:30:00
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Este estudio fue apoyado por las subvenciones PID2019-104776RB-I00 y CB16/11/00399 (CIBER CV) de MCIN/AEI/10.13039/501100011033 a J. L. P. J.G.-B. fue financiado por el Programa de Atracción de Talento de la Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. fue financiado por Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Agradecemos a la Unidad de Microscopía e Imagen Dinámica del CNIC, CNIC, ICTS-ReDib, cofinanciado por MCIN/AEI/10.13039/501100011033 y FEDER "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). También agradecemos a A. Galicia y L. Méndez por la cría de ratones. El coste de esta publicación fue financiado en parte por fondos del Fondo Europeo de Desarrollo Regional. El CNIC cuenta con el apoyo del ISCIII, el MCIN y la Fundación Pro CNIC y es un Centro de Excelencia Severo Ochoa (subvención CEX2020-001041-S) financiado por MCIN/AEI/10.13039/501100011033.

Los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Ético de Experimentación Animal del Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) y por la Comunidad de Madrid (ref. PROEX 155.7/20). Todos los procedimientos con animales se ajustan a la Directiva 2010/63UE de la UE y la Recomendación 2007/526/CE relativa a la protección de los animales utilizados para experimentación y otros fines científicos, promulgada en la legislación española bajo el Real Decreto 1201/2005.
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	<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells.">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).</li><li>Ivanovitch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=outflow+tract+heart+progenitors+arise+from+spatially+and+molecularly+distinct+regions+of+the+primitive+streak.">outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak.</a> PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).</li><li>Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+controlling+second+heart+field+development.">Signaling pathways controlling second heart field development.</a> Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).</li><li>Moorman, A. F., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+chamber+formation:+Development,+genes,+and+evolution.">Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution.</a> Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).</li><li>Timmerman, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+promotes+epithelial-mesenchymal+transition+during+cardiac+development+and+oncogenic+transformation.">Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation.</a> Genes &amp; Development. 18 (1), 99-115 (2004).</li><li>Luna-Zurita, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+a+Notch-dependent+mesenchymal+gene+program+and+Bmp2-driven+cell+invasiveness+regulates+murine+cardiac+valve+formation.">Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).</li><li>Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp2+and+Notch+cooperate+to+pattern+the+embryonic+endocardium.">Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium.</a> Development. 145 (13), (2018).</li><li>MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+cardiac+valve+development+and+disease.">Notch signaling in cardiac valve development and disease.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).</li><li>de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+tissue+interactions:+Notch+signaling+in+cardiac+development+and+disease.">Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease.</a> Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nfatc1+coordinates+valve+endocardial+cell+lineage+development+required+for+heart+valve+formation.">Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation.</a> Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).</li><li>Amack, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+of+EMT:+Lessons+from+live+in+vivo+imaging+of+embryonic+development.">Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development.</a> Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).</li><li>Cano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+controls+epithelial-mesenchymal+transitions+by+repressing+E-cadherin+expression.">The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).</li><li>Batlle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+is+a+repressor+of+E-cadherin+gene+expression+in+epithelial+tumour+cells.">The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).</li><li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-dependent+remodeling+of+adherens+junctions+protects+junctions+from+Snail-dependent+disassembly.">Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly.</a> Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).</li><li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+protein+Par3/Bazooka+follows+myosin-dependent+junction+repositioning.">Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning.</a> Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).</li><li>Jimenez-Amilburu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+cardiomyocyte+apicobasal+polarity+reveals+epithelial+to+mesenchymal-like+transition+during+cardiac+trabeculation.">In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation.</a> Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).</li><li>Davey, C. F., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+in+moving+cells:+Think+globally,+act+locally.">Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally.</a> Development. 144 (2), 187-200 (2017).</li><li>Grego-Bessa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+PTEN+and+the+PDK1+kinase+regulate+formation+of+the+columnar+neural+epithelium.">The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium.</a> Elife. 5, 12034 (2016).</li><li>Jones, C., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+in+vertebrates.">Planar cell polarity signaling in vertebrates.</a> Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).</li><li>Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+and+Vangl2+cooperate+in+the+initiation+of+planar+cell+polarity+in+the+mouse+embryo.">Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo.</a> Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).</li><li>Devenport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+morphodynamics:+Translating+planar+polarity+cues+into+polarized+cell+behaviors.">Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).</li><li>Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Notch1+activity+in+development:+Evidence+for+a+feedback+regulatory+loop.">Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop.</a> Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).</li><li>Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+node+and+notochordal+plate+in+gastrulating+mouse+embryos+using+scanning+electron+microscopy+and+whole+mount+immunofluorescence.">Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).</li><li>Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+avian+embryonic+valvular+progenitor+cells.">Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-B2+controls+VEGF-induced+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).</li><li>Yilmaz, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMT,+the+cytoskeleton,+and+cancer+cell+invasion.">EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).</li><li>Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+links+axes+of+spatial+dynamics+in+neural-tube+closure.">Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure.</a> Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).</li><li>Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis.">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).</li><li>Prados, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Bmp2+gain+causes+ectopic+EMT+and+promotes+cardiomyocyte+proliferation+and+immaturity.">Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity.</a> Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).</li><li>Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cardiac+cushion+development+by+hyaluronan.">Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan.</a> Experimental &amp; Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).</li><li>Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+blood+flow+on+cardiac+development.">Influence of blood flow on cardiac development.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).</li><li>Goddard, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+sculpt+developing+heart+valves+through+a+KLF2-WNT9B+paracrine+signaling+axis.">Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis.</a> Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).</li></ol>

El endocardio es una monocapa epitelial que cubre toda la superficie interna del tubo cardíaco embrionario. Durante el desarrollo de la válvula, las células endocárdicas en las regiones valvulares prospectivas se someten a EMT, por lo que las células endocárdicas transforman y reorganizan su citoesqueleto para deslaminarse desde el endocardio hacia la jalea cardíaca. Nosotros y otros hemos obtenido datos relevantes sobre el desarrollo valvular en embriones de ratón mediante el análisis de secciones transversales...

El corazón es el primer órgano funcional de un embrión de mamífero. Alrededor del día embrionario (E) 7.5 en ratones, las células precardíacas bilaterales del mesodermo forman la media luna cardíaca en el lado ventral1. La media luna cardíaca contiene dos poblaciones de células precardíacas que incluyen progenitores del miocardio y el endocardio2. Alrededor de E8.0, los precursores cardíacos se fusionan en la línea media, formando el tubo cardíaco primitivo que consta de dos tejidos epiteliales, el miocardio externo y el endocardio interno, que es un endotelio especializado separado por una matriz extracelular llamada jalea cardíaca. Más tarde, en E8.5, el tubo cardíaco sufre un bucle hacia la derecha. El corazón en bucle tiene diferentes regiones anatómicas con firmas moleculares específicas, como el tracto de salida (OFT), los ventrículos y el canal atrio-ventricular (AVC)3. Aunque inicialmente el tubo cardíaco se expande en su lado de entrada a través de la adición de células4, en E9.5, la proliferación cardíaca intensiva resulta en el globo de las cámaras y el establecimiento de la red trabecular5. La formación de la válvula tiene lugar en la CVA (futuras válvulas mitral y tricúspide) y en la OFT (futuras válvulas aórtica y pulmonar).
El endocardio juega un papel crucial en el desarrollo de la válvula. Las células endocárdicas experimentan transición epitelial-mesenquimal (EMT) en el AVC y OFT para formar los cojines endocárdicos, una estructura que aparece al inicio del desarrollo de la válvula. Diferentes vías de señalización activan este proceso; en E9.5 en ratones, NOTCH activado en el endocardio en respuesta a BMP2 derivado del miocardio promueve la EMT invasiva de las células endocárdicas en las regiones AVC y OFT a través de la activación de TGFβ2 y SNAIL (SNAI1), que reprime directamente la expresión de cadherina endotelial vascular (VE-cadherina), un componente transmembrana de las uniones adherentes (AJs)6,7,8 . En la OFT, la activación del endocardio para iniciar la EMT está mediada por FGF8 y BMP4, cuya expresión es activada por NOTCH 9,10,11,12.
La progresión de la EMT implica la dinámica celular a medida que las células cambian de forma, rompen y rehacen las uniones con sus vecinas, se deslaminan y comienzan a migrar13. Estos cambios incluyen la remodelación de AJ y el desmontaje gradual 14,15, la señalización de polaridad celular plana (PCP), la pérdida de polaridad apicobasal (ABP), la constricción apical y la organización citoesquelética 16,17. ABP se refiere a la distribución de proteínas a lo largo del eje anterior-posterior de una célula. En el corazón en desarrollo, la regulación de la PBA en los cardiomiocitos es necesaria para el desarrollo ventricular18. PCP se refiere a una distribución polarizada de proteínas dentro de las células a través del plano de un tejido y regula la distribución celular; Los epitelios con una geometría estable están formados por células en forma de hexágono, donde solo tres células convergen en los vértices 19,20,21,22. Diferentes procesos celulares, como la división celular, el intercambio de vecinos o la delaminación que ocurre durante la morfogénesis epitelial, producen un aumento en el número de células que convergen en un vértice y el número de células vecinas que tiene una célula dada22. Estos comportamientos celulares relacionados con la PCP pueden ser regulados por diferentes vías de señalización, dinámica de actina o tráfico intracelular23.
Los datos generados estudiando el desarrollo de la válvula en ratones se han obtenido de secciones transversales, coronales o sagitales de corazones embrionarios E8.5 y E9.5, donde el endocardio se muestra como una línea de células en lugar de como un campo de células: el endocardio cubre toda la superficie interna del tubo cardíaco24. Las secciones embrionarias no permiten el análisis de PCP en el endocardio de embriones de ratón. Nuestro novedoso método experimental permite el análisis de la distribución celular endocárdica, la anisotropía AJ y el análisis de la forma de una sola célula, como se muestra en los resultados representativos. Este tipo de datos son necesarios para el análisis de PCP, junto con la descripción de otras moléculas relacionadas con PCP, que no se muestran en este informe. La inmunofluorescencia de montaje completo, la preparación específica de muestras y el uso de ratones modificados genéticamente permiten el análisis de polaridad plana en el endocardio al inicio del desarrollo de la válvula en ratones.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-OH-Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-6278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldheyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-10</td>
			<td>Dilute to 4% in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>FGP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VECadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-605-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4099,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides Superfrost PLUS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td>25 mm x 75 mm x 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>A4974,0500</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos

El estudio de los mecanismos celulares y moleculares subyacentes al desarrollo del corazón de los mamíferos es esencial para abordar la cardiopatía congénita humana. El desarrollo de las válvulas cardíacas primitivas implica la transición epitelial a mesenquimal (EMT) de las células endocárdicas del canal auriculoventricular (AVC) y las regiones del tracto de salida (OFT) del corazón en respuesta a las señales inductivas locales de miocardio y endocardio. Una vez que las células se deslaminan e invaden la matriz extracelular (jalea cardíaca) ubicada entre el endocardio y el miocardio, se forman los cojines endocárdicos primitivos (CE). Este proceso implica que el endocardio tiene que llenar los huecos dejados por las células deslaminadas y tiene que reorganizarse para converger (estrechar) o extenderse (alargarse) a lo largo de un eje. La investigación actual ha implicado la vía de polaridad de células planas (PCP) en la regulación de la localización subcelular de los factores involucrados en este proceso. Clásicamente, las fases iniciales del desarrollo de la válvula cardíaca se han estudiado en secciones transversales de corazones embrionarios o en explantes ex vivo AVC u OFT cultivados en geles de colágeno. Estos enfoques permiten el análisis de la polaridad apico-basal, pero no permiten el análisis del comportamiento celular dentro del plano del epitelio o de los cambios morfológicos de las células migratorias. Aquí, mostramos un enfoque experimental que permite la visualización del endocardio en regiones valvulogénicas como un campo plano de células. Este enfoque experimental brinda la oportunidad de estudiar PCP, topología plana y comunicación intercelular dentro del endocardio de OFT y AVC durante el desarrollo de la válvula. Descifrar nuevos mecanismos celulares implicados en la morfogénesis de la válvula cardíaca puede contribuir a comprender la cardiopatía congénita asociada con defectos del cojín endocárdico.

Los datos generados utilizando este protocolo muestran que es posible realizar imágenes en la cara del endocardio del AVC. El primer objetivo fue analizar la forma celular del endocardio durante la formación de las válvulas a una resolución celular (Figura 1). Para resaltar las células endocárdicas individuales en E9.5, utilizamos dos cepas de ratones transgénicos. (1) ROSAmT/mG es un alelo reportero Cre fluorescente de dos colores (tdTomato/mT y ...

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En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Clásicamente, el endocardio del primordio de la válvula embrionaria de ratón se ha analizado utilizando secciones transversales, coronales o sagitales. Nuestro novedoso enfoque para imágenes bidimensionales en la cara del endocardio en regiones valvulogénicas permite el análisis de polaridad plana y reordenamiento celular del endocardio durante el desarrollo de la válvula.

En Face Preparación del cojín endocárdico para el análisis de morfogénesis plana en embriones de ratón

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

Este protocolo permite el análisis del endocardio primitivo en orientación plana. Podemos analizar la distribución de las células endocárdicas, la anisotropía de otras medidas cautelares y describir la forma de una sola célula endocárdica durante el desarrollo de la válvula. En comparación con las secciones de tejido clásicas, la imagen en cara de la región regenerativa de la válvula interna permite el análisis de la polaridad celular plana y la dinámica de las células endocárdicas durante el desarrollo de la válvula en embriones intactos.Este método se puede utilizar para profundizar el conocimiento de la polaridad celular plana durante el desarrollo cardiovascular. Comience colocando el útero extirpado de ratones preñados sacrificados en una placa de Petri que contenga PBT helado. Retire el deciduye individual del útero bajo un microscopio de disección usando fórceps finos.Usando pinzas finas, haga una incisión en la parte blanca de la decidua, que es donde está el embrión. Retírelo suavemente, evite tirar y transfiera los embriones a una nueva placa de Petri con PBT fresco usando un P-1000 con la punta cortada, dejando un diámetro lo suficientemente grande como para que un embrión pase sin romperse. Para el genotipado, tome un pequeño trozo del saco vitelino de aproximadamente 0,5 milímetros cuadrados o un trozo de la cola del extremo posterior, contando de cinco a 10 somitas hacia la cabeza y digerirlo en 100 mililitros del tampón apropiado.Bajo la campana extractora, transfiera los embriones al 4% de PFA helado en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros a cuatro grados centígrados. Fije los embriones de dos horas a toda la noche a cuatro grados centígrados en un nutador. Debajo de la campana extractora, retire el fijador de PFA al 4% de los tubos de microcentrífuga sin tocar los embriones.Deseche el PFA en un recipiente apropiado. Lave los embriones cinco veces en PBT frío durante 10 minutos a temperatura ambiente. Con pinzas finas, retire el corazón y transfiéralo a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con PBT fresco.Reemplace PBT con PBS Triton y lave las muestras tres veces, cinco minutos cada una, a temperatura ambiente en un agitador orbital. Reemplace PBS Triton con una solución bloqueante que contenga PBS Triton con suero bovino inactivado por calor al 10%. Incubar desde dos horas hasta toda la noche a cuatro grados centígrados en un agitador orbital.Reemplace la solución de bloqueo con una solución de bloqueo que contenga anticuerpos primarios a la concentración deseada. Incubar durante la noche en un agitador orbital a cuatro grados centígrados. Después de la incubación nocturna a cuatro grados centígrados, incubar las muestras durante 1,5 horas a temperatura ambiente en un agitador orbital.Este paso es crucial para aumentar la relación señal-ruido. Retire y mantenga la solución de anticuerpos primarios a cuatro grados centígrados, hasta tres experimentos futuros. Agregue azida de sodio a una concentración final de 0.02% para una mejor conservación.Luego, lave los embriones tres veces con PBS Triton durante tres minutos cada uno. Lave los embriones con PBS Triton tres veces durante 30 minutos y manténgalos en un agitador orbital a cuatro grados centígrados. Después del último lavado, agregue un mililitro de solución bloqueante que contenga anticuerpos secundarios conjugados con fluorescencia contra la especie huésped de anticuerpos primarios.Luego agregue DAPI a la solución e incube los embriones durante la noche en un agitador orbital a cuatro grados centígrados. Después de la incubación nocturna a cuatro grados centígrados, incubar los embriones durante 1,5 horas a temperatura ambiente en un agitador orbital. Este paso es esencial para aumentar la relación señal-ruido.Repita los pasos de lavado de PBS Triton como se menciona en el texto manuscrito. Coloque los corazones en una placa de Petri de 35 milímetros que contenga PBS. Usando un alambre de tungsteno y pinzas finas, aísle el canal auriculoventricular o el tracto de salida y córtelos longitudinalmente.Prepare cubreobjetos, portaobjetos, pinzas, una pipeta P-200 con las puntas apropiadas, una toalla de papel y cualquier medio de montaje acuoso a base de glicerol para fluorescencia sin DAPI. Pegue dos tiras de cinta adhesiva en una diapositiva separadas de 0,3 a 0,6 centímetros para crear un espacio de habitación 3D que permita que las muestras conserven su forma original sin aplastarlas. Luego, usando aproximadamente 20 microlitros de tampón, deje caer cuidadosamente las muestras sobre el portaobjetos entre las tiras de cinta usando una punta de pipeta P-200 cortada.Use un microscopio de disección para aumentar la precisión. Usando fórceps finos, coloque las muestras con el endocardio hacia arriba y el miocardio hacia abajo en el portaobjetos. Retire el exceso de PBS con una toalla de papel y evite tocar la muestra.Luego, seque las muestras durante uno o dos minutos a temperatura ambiente para que las muestras se peguen al portaobjetos. Agregue 40 microlitros de medios de montaje acuosos al tejido. Coloque el deslizamiento de la cubierta sobre los dos trozos de cinta y bájelo lentamente sobre el tejido con una aguja o fórceps.Evite crear burbujas de aire. Selle el cubreobjetos con una gota de esmalte de uñas en cada vértice del cubreobjetos. Una vez que el esmalte de uñas esté seco, limpie el exceso de medios de montaje de los lados del deslizamiento de la cubierta usando una toalla de papel absorbente.Evite mover la cubierta. Agregue esmalte de uñas a lo largo de los bordes deslizantes de la cubierta para sellarlo completamente, evitando la evaporación del medio de montaje. Con un microscopio vertical o confocal invertido, tome imágenes con un aumento de 10X para una vista general y a 63X con un zoom de 3X para imágenes detalladas.La forma celular del endocardio se analizó durante la formación de las válvulas a una resolución celular. Las células individuales o clones de unas pocas células expresaron GFP en el endocardio. La expresión de GFP y la combinación con la localización subcelular de VE-cadherina fue un enfoque efectivo para estudiar la relación entre la dinámica de AJ y la formación de filopodios y las células pre-EMT, ya que estas células desarrollaron protuberancias de membrana a medida que las AJ se disuelven.Las diferencias en la intensidad de la tinción VE-cadherina en el endocardio indicaron la presencia de contractilidad anisotrópica en el endocardio embrionario del canal auriculoventricular en etapas prevalvulares. Todo el corazón se tiñó con anticuerpos VE-cadherina en E8.5 y E9.5. En E8.5, el endocardio del canal auriculoventricular tendía a tener una organización epitelial estable, y no se detectaron vértices formados por más de cuatro células.En E9.5, se observaron vértices de hasta seis células formando estructuras en forma de roseta, similares a la organización celular descrita previamente en el epitelio sometido a reordenamientos celulares activos, lo que sugiere que el endocardio del canal auriculoventricular estaba experimentando un reordenamiento celular dinámico durante el desarrollo de la válvula. Una curva de aprendizaje es necesaria para convertirse en un experto en esta técnica. Además, se recomienda encarecidamente utilizar pinzas Sovereign y alambre de tungsteno.Hoy en día, la visualización del endocardio prevalvular se limitó a las secciones transversales. Nuestro enfoque ofrece la posibilidad de estudiar el comportamiento embrionario del endocardio valvular desde un punto de vista plano.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Imágenes de contraste en embriones de ratón Uso de alta frecuencia de ultrasonido

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparación de mitocondriales enriquecidos fracciones de Análisis metabólico en<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Estable y eficiente modificación genética de células en el ratón adulto V-SVZ para el análisis de neural de células madre Autónoma y los efectos no autónomos

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Los métodos para la transferencia Precisamente localizada de células o ADN en Early postimplantación embriones de ratón

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Análisis cuantitativo de la expresión de la proteína para el Estudio de la especificación del linaje de ratón de preimplantación de embriones

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Análisis de la inmunofluorescencia de Whole-mount cuantitativa de las poblaciones progenitoras cardiacas en embriones de ratón

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Siguientes movimientos de tejido endocárdico vía Photoconversion de la célula en el embrión de pez cebra

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

En Vivo Proyección de imagen del músculo-tendón morfogénesis en Drosophila pupa

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualización de la placa notocordal en embriones de ratón Gastrulating con microscopía electrónica e inmunofluorescencia de Monte todo y nodo

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount hibridación In Situ de embriones de Astyanax

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...