Name: en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos
Uploaded: 2022-07-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos at JoVE.com

Denna studie stöddes av bidragen PID2019-104776RB-I00 och CB16/11/00399 (CIBER CV) från MCIN/AEI/10.13039/501100011033 till J. L. P. J.G.-B. finansierades av Programa de Atracción de Talento från Comunidad de Madrid (2020-5ª/BMD-19729). T.G.-C. finansierades av Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054). Vi tackar CNIC Unit of Microscopy and Dynamic Imaging, CNIC, ICTS-ReDib, medfinansierad av MCIN/AEI /10.13039/501100011033 och FEDER "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16). Vi tackar också A. Galicien och L. Méndez för mushållning. Kostnaden för denna publikation stöddes delvis av medel från Europeiska regionala utvecklingsfonden. CNIC stöds av ISCIII, MCIN och Pro CNIC Foundation och är ett Severo Ochoa Center of Excellence (bidrag CEX2020-001041-S) finansierat av MCIN/AEI /10.13039/501100011033.

Djurstudier godkändes av Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) etikkommitté för djurförsök och av Madrids kommun (se PROEX 155.7/20). Alla djurförsök överensstämmer med EU-direktiv 2010/63EU och rekommendation 2007/526/EG om skydd av djur som används för försök och andra vetenskapliga ändamål, antagna i spansk lag enligt Real Decreto 1201/2005.
1. Obtention av AVC och / eller OFTs (anpassad från Xiao et al. 25)...

<ol>
	<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells.">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).</li><li>Ivanovitch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=outflow+tract+heart+progenitors+arise+from+spatially+and+molecularly+distinct+regions+of+the+primitive+streak.">outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak.</a> PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).</li><li>Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+controlling+second+heart+field+development.">Signaling pathways controlling second heart field development.</a> Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).</li><li>Moorman, A. F., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+chamber+formation:+Development,+genes,+and+evolution.">Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution.</a> Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).</li><li>Timmerman, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+promotes+epithelial-mesenchymal+transition+during+cardiac+development+and+oncogenic+transformation.">Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation.</a> Genes &amp; Development. 18 (1), 99-115 (2004).</li><li>Luna-Zurita, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+a+Notch-dependent+mesenchymal+gene+program+and+Bmp2-driven+cell+invasiveness+regulates+murine+cardiac+valve+formation.">Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).</li><li>Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp2+and+Notch+cooperate+to+pattern+the+embryonic+endocardium.">Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium.</a> Development. 145 (13), (2018).</li><li>MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+cardiac+valve+development+and+disease.">Notch signaling in cardiac valve development and disease.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).</li><li>de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+tissue+interactions:+Notch+signaling+in+cardiac+development+and+disease.">Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease.</a> Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nfatc1+coordinates+valve+endocardial+cell+lineage+development+required+for+heart+valve+formation.">Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation.</a> Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).</li><li>Amack, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+of+EMT:+Lessons+from+live+in+vivo+imaging+of+embryonic+development.">Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development.</a> Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).</li><li>Cano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+controls+epithelial-mesenchymal+transitions+by+repressing+E-cadherin+expression.">The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).</li><li>Batlle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+is+a+repressor+of+E-cadherin+gene+expression+in+epithelial+tumour+cells.">The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).</li><li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-dependent+remodeling+of+adherens+junctions+protects+junctions+from+Snail-dependent+disassembly.">Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly.</a> Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).</li><li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+protein+Par3/Bazooka+follows+myosin-dependent+junction+repositioning.">Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning.</a> Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).</li><li>Jimenez-Amilburu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+cardiomyocyte+apicobasal+polarity+reveals+epithelial+to+mesenchymal-like+transition+during+cardiac+trabeculation.">In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation.</a> Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).</li><li>Davey, C. F., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+in+moving+cells:+Think+globally,+act+locally.">Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally.</a> Development. 144 (2), 187-200 (2017).</li><li>Grego-Bessa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+PTEN+and+the+PDK1+kinase+regulate+formation+of+the+columnar+neural+epithelium.">The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium.</a> Elife. 5, 12034 (2016).</li><li>Jones, C., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+in+vertebrates.">Planar cell polarity signaling in vertebrates.</a> Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).</li><li>Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+and+Vangl2+cooperate+in+the+initiation+of+planar+cell+polarity+in+the+mouse+embryo.">Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo.</a> Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).</li><li>Devenport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+morphodynamics:+Translating+planar+polarity+cues+into+polarized+cell+behaviors.">Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).</li><li>Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Notch1+activity+in+development:+Evidence+for+a+feedback+regulatory+loop.">Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop.</a> Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).</li><li>Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+node+and+notochordal+plate+in+gastrulating+mouse+embryos+using+scanning+electron+microscopy+and+whole+mount+immunofluorescence.">Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).</li><li>Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+avian+embryonic+valvular+progenitor+cells.">Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-B2+controls+VEGF-induced+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).</li><li>Yilmaz, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMT,+the+cytoskeleton,+and+cancer+cell+invasion.">EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).</li><li>Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+links+axes+of+spatial+dynamics+in+neural-tube+closure.">Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure.</a> Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).</li><li>Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis.">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).</li><li>Prados, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Bmp2+gain+causes+ectopic+EMT+and+promotes+cardiomyocyte+proliferation+and+immaturity.">Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity.</a> Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).</li><li>Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cardiac+cushion+development+by+hyaluronan.">Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan.</a> Experimental &amp; Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).</li><li>Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+blood+flow+on+cardiac+development.">Influence of blood flow on cardiac development.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).</li><li>Goddard, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+sculpt+developing+heart+valves+through+a+KLF2-WNT9B+paracrine+signaling+axis.">Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis.</a> Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).</li></ol>

Endokardiet är ett epitelmonolager som täcker hela den inre ytan av det embryonala hjärtröret. Under ventilutveckling genomgår endokardiella celler vid de potentiella klaffregionerna EMT, så endokardiella celler transformerar och omorganiserar deras cytoskelett för att delaminera från endokardiet mot hjärtgelén. Vi och andra har fått relevanta data om ventilutveckling i musembryon genom att analysera tvärgående sektioner av E8.5 och E9.5 embryonala hjärtan, där endokardiet visas som en rad celler<sup class...

Hjärtat är det första funktionella organet i ett däggdjursembryo. Runt embryonal dag (E) 7,5 hos möss bildar bilaterala precardiac mesodermceller hjärtmånen i ventralsidan1. Hjärtmånen innehåller två populationer av prekardiella celler som inkluderar föregångare till myokardiet och endokardiet2. Runt E8.0 smälter hjärtprekursorerna samman i mittlinjen och bildar det primitiva hjärtröret som består av två epitelvävnader, det yttre myokardiet och det inre endokardiet, som är ett specialiserat endotel åtskilt av en extracellulär matris som heter hjärtgelé. Senare, vid E8.5, genomgår hjärtröret högerslinga. Det loopade hjärtat har olika anatomiska regioner med specifika molekylära signaturer såsom utflödeskanalen (OFT), ventriklarna och atrio-ventrikulärkanalen (AVC)3. Även om hjärtröret initialt expanderar vid sin inflödessida genom tillsats av celler4, vid E9.5, resulterar intensiv hjärtproliferation i ballongbildning av kamrarna och etablering av det trabekulära nätverket5. Ventilbildning sker i AVC (framtida mitral- och tricuspidventiler) och i OFT (framtida aorta- och lungventiler).
Endokardiet spelar avgörande roller i ventilutvecklingen. Endokardiella celler genomgår epitel-mesenkymal övergång (EMT) i AVC och OFT för att bilda endokardiella kuddar, en struktur som uppträder vid början av ventilutvecklingen. Olika signalvägar aktiverar denna process; vid E9.5 hos möss främjar NOTCH aktiverat i endokardiet som svar på myokardiell härledd BMP2 invasiv EMT av endokardiella celler i AVC- och OFT-regionerna genom aktivering av TGFβ2 och SNAIL (SNAI1), som direkt undertrycker uttrycket av vaskulär endotelkadherin (VE-cadherin), en transmembrankomponent i adherenskorsningar (AJs)6,7,8 . I OFT förmedlas aktivering av endokardiet för att initiera EMT av FGF8 och BMP4, vars uttryck aktiveras av NOTCH 9,10,11,12.
Progression av EMT involverar cellulär dynamik när celler ändrar form, bryter och gör om korsningar med sina grannar, delaminerar och börjar migrera13. Dessa förändringar inkluderar AJ-ombyggnad och gradvis demontering av 14,15, planar cellpolaritet (PCP) -signalering, förlust av apico-basal polaritet (ABP), apikal förträngning och cytoskelettorganisation 16,17. ABP avser fördelningen av proteiner längs den främre-bakre axeln hos en cell. I det utvecklande hjärtat krävs ABP-reglering i kardiomyocyter för ventrikulär utveckling18. PCP avser en polariserad fördelning av proteiner i celler över planet för en vävnad och reglerar cellulär distribution; Epitel med en stabil geometri består av hexagonformade celler, där endast tre celler konvergerar vid hörnen 19,20,21,22. Olika cellulära processer, såsom celldelning, grannutbyte eller delaminering som inträffar under epitelmorfogenes, ger en ökning av antalet celler som konvergerar på ett hörn och antalet angränsande celler som en given cell har22. Dessa cellulära beteenden relaterade till PCP kan regleras av olika signalvägar, aktindynamik eller intracellulär handel23.
De data som genereras för att studera ventilutveckling hos möss har erhållits från transversala, koronala eller sagittala sektioner av E8.5 och E9.5 embryonala hjärtan, där endokardiet visas som en linje av celler istället för som ett fält av celler - endokardiet täcker hela innerytan av hjärtröret24. Embryonala sektioner tillåter inte analys av PCP i endokardiet hos musembryon. Vår nya experimentella metod möjliggör analys av endokardiell cellfördelning, AJ-anisotropi och encellsformanalys, vilket visas i de representativa resultaten. Denna typ av data krävs för PCP-analys, tillsammans med beskrivningen av andra molekyler relaterade till PCP, som inte visas i denna rapport. Helmonterad immunofluorescens, specifik provberedning och användning av genetiskt modifierade möss möjliggör planär polaritetsanalys i endokardiet vid början av ventilutveckling hos möss.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-OH-Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-6278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldheyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-10</td>
			<td>Dilute to 4% in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>FGP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VECadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-605-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4099,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides Superfrost PLUS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td>25 mm x 75 mm x 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>A4974,0500</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos

Studien av de cellulära och molekylära mekanismerna som ligger till grund för utvecklingen av däggdjurshjärtat är avgörande för att ta itu med mänsklig medfödd hjärtsjukdom. Utvecklingen av de primitiva hjärtklaffarna involverar epitel-till-mesenkymal övergång (EMT) av endokardiella celler från de atrioventrikulära kanalerna (AVC) och utflödeskanalen (OFT) i hjärtat som svar på lokala induktiva myokardiella och endokardiella signaler. När cellerna delaminerar och invaderar den extracellulära matrisen (hjärtgelé) som ligger mellan endokardiet och myokardiet bildas de primitiva endokardiella kuddarna (EC). Denna process innebär att endokardiet måste fylla luckorna som lämnas av de delaminerade cellerna och måste omorganisera sig för att konvergera (smala) eller förlänga (förlänga) längs en axel. Aktuell forskning har involverat den plana cellpolaritetsvägen (PCP) för att reglera den subcellulära lokaliseringen av de faktorer som är involverade i denna process. Klassiskt har de inledande faserna av hjärtklaffsutveckling studerats i tvärsnitt av embryonala hjärtan eller in ex vivo AVC eller OFT explanter odlade på kollagengeler. Dessa tillvägagångssätt möjliggör analys av apico-basal polaritet men tillåter inte analys av cellbeteende inom epitelets plan eller av de morfologiska förändringarna hos migrerande celler. Här visar vi ett experimentellt tillvägagångssätt som möjliggör visualisering av endokardiet vid valvulogena regioner som ett planfält av celler. Detta experimentella tillvägagångssätt ger möjlighet att studera PCP, plan topologi och intercellulär kommunikation inom endokardiet hos OFT och AVC under ventilutveckling. Dechiffrera nya cellulära mekanismer som är involverade i hjärtklaffmorfogenes kan bidra till att förstå medfödd hjärtsjukdom i samband med endokardiella kudddefekter.

Data som genereras med hjälp av detta protokoll visar att det är möjligt att utföra en ansiktsavbildning av endokardiet hos AVC. Det första målet var att analysera endokardiets cellform under bildandet av ventilerna vid en cellulär upplösning (Figur 1). För att markera enskilda endokardiella celler vid E9.5 använde vi två transgena musstammar. (1) ROSA mT/mG är en tvåfärgad fluorescerande Cre-reporterallel (tdTomato/mT och EGFP/mG)...

Watch this Scientific Journal Video about En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos at JoVE.com

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Klassiskt har endokardiet hos musens embryonala ventilprimordium analyserats med hjälp av transversala, koronala eller sagittala sektioner. Vårt nya tillvägagångssätt för en ansikte, tvådimensionell avbildning av endokardiet vid valvulogena regioner möjliggör plan polaritet och cellomläggningsanalys av endokardiet under ventilutveckling.

Sv Ansikte Endokardiell kuddeberedning för planär morfogenesanalys i musembryon

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

Detta protokoll möjliggör analys av primitivt endokardium i en plan orientering. Vi kan analysera fördelningen av endokardiella celler, anisotropin av andra förelägganden och beskriva formen på en enda endokardiell cell under ventilutveckling. Jämfört med de klassiska vävnadssektionerna möjliggör en-ansiktsavbildning av den inre ventilregenerativa regionen analys av planär cellpolaritet och dynamik hos endokardiella celler under ventilutveckling i intakta embryon.Denna metod kan användas för att fördjupa kunskapen om planär cellpolaritet under kardioutveckling. Börja med att placera livmodern utskuren från avlivade dräktiga möss i en petriskål som innehåller iskall PBT. Ta bort den enskilda deciduye från livmodern under ett dissekerande mikroskop med fina pincett.Använd fin pincett och gör ett snitt i den vita delen av decidua, det är där embryot är. Ta bort det försiktigt, undvik att dra och överför embryona till en ny petriskål med färsk PBT med en P-1000 med spetsen avskuren, vilket ger en diameter som är tillräckligt stor för att ett embryo ska kunna passera utan att gå sönder. För genotypning, ta en liten bit av äggula sac ca 0,5 kvadrat millimeter eller en bit av svansen från den bakre änden, räkna fem till 10 somiter mot huvudet och smälta det i 100 ml av lämplig buffert.Under dragskåpet överför du embryona till iskallt 4% PFA i ett två-milliliter mikrocentrifugrör vid fyra grader Celsius. Fixa embryona från två timmar till över natten vid fyra grader Celsius på en nutator. Ta bort 4% PFA-fixeringsmedlet under dragskåpet från mikrocentrifugrören utan att vidröra embryona.Kassera PFA i en lämplig behållare. Tvätta embryona fem gånger i kallt PBT i 10 minuter vid rumstemperatur. Ta bort hjärtat med fina pincett och överför det till ett nytt 1,5-milliliter mikrocentrifugrör med färskt PBT.Byt ut PBT mot PBS Triton och tvätta proverna tre gånger, fem minuter vardera, vid rumstemperatur på en orbitalskakare. Byt ut PBS Triton med en blockerande lösning som innehåller PBS Triton med 10% värmeinaktiverat bovint serum. Inkubera från två timmar till över natten vid fyra grader Celsius på en orbital shaker.Byt ut blockeringslösningen med blockerande lösning innehållande primär antikropp vid önskad koncentration. Inkubera över natten på en orbital shaker vid fyra grader Celsius. Efter inkubation över natten vid fyra grader Celsius, inkubera proverna i 1,5 timmar vid rumstemperatur på en orbital shaker.Detta steg är avgörande för att öka signal-brusförhållandet. Ta bort och håll den primära antikroppslösningen vid fyra grader Celsius, upp till tre framtida experiment. Tillsätt natriumazid till en slutlig koncentration av 0,02% för bästa bevarande.Tvätta sedan embryona tre gånger med PBS Triton i tre minuter vardera. Tvätta embryona med PBS Triton tre gånger i 30 minuter och håll dem på en orbital shaker vid fyra grader Celsius. Efter den sista tvätten, tillsätt en milliliter blockerande lösning innehållande fluorescenskonjugerad sekundär antikropp mot den primära antikroppsvärdarten.Tillsätt sedan DAPI till lösningen och inkubera embryona över natten på en orbital shaker vid fyra grader Celsius. Efter inkubationen över natten vid fyra grader Celsius, inkubera embryonerna i 1,5 timmar vid rumstemperatur på en orbital shaker. Detta steg är viktigt för att öka signal-brusförhållandet.Upprepa PBS Triton-tvättstegen som nämns i textmanuskriptet. Lägg hjärtan på en 35-millimeters petriskål som innehåller PBS. Använd en volframtråd och fina pincett, isolera den atrioventrikulära kanalen eller utflödeskanalen och skär dem i längdriktningen.Förbered täckskivor, glidbanor, pincett, en P-200-pipett med lämpliga spetsar, en pappershandduk och alla vattenhaltiga glycerolbaserade monteringsmedier för fluorescens utan DAPI. Stick två remsor tejp på en bild åtskilda av 0,3 till 0,6 centimeter för att skapa ett 3D-rumsutrymme som gör att proverna kan bevara sin ursprungliga form utan att krossa dem. Släpp sedan proverna försiktigt på bilden mellan bandremsorna med en skuren P-200-pipettspets med cirka 20 mikroliter buffert mellan tejpremsorna.Använd ett dissekerande mikroskop för att öka noggrannheten. Använd fina pincett och placera proverna med endokardiet uppåt och myokardiet nedåt på bilden. Ta bort överflödig PBS med en pappershandduk och undvik att röra provet.Torka sedan proverna i en till två minuter vid rumstemperatur så att proverna fastnar på bilden. Tillsätt 40 mikroliter vattenbaserat monteringsmedium till vävnaden. Placera locket över de två tejpbitarna och sänk det långsamt ner på vävnaden med en nål eller pincett.Undvik att skapa luftbubblor. Försegla täckbladet med en droppe nagellack på varje hörn av täckbladet. När nagellacket är torrt, rengör det överflödiga monteringsmediet från sidorna av lockglidningen med hjälp av en absorberande pappershandduk.Undvik att flytta locket. Tillsätt nagellack längs lockets glidkanter för att försegla det helt, vilket förhindrar avdunstning av monteringsmedier. Använd ett upprätt eller ett inverterat konfokalmikroskop och ta bilder med 10X förstoring för allmän visning och vid 63X med 3X zoom för detaljerade bilder.Endokardiets cellform analyserades under bildandet av ventilerna vid en cellulär upplösning. Enstaka celler eller kloner av några celler uttryckte GFP i endokardiet. GFP-uttrycket och kombinationen med VE-cadherin subcellulär lokalisering var ett effektivt tillvägagångssätt för att studera förhållandet mellan AJ-dynamik och filopodibildning och pre-EMT-celler, eftersom dessa celler utvecklade membranutsprång när AJs löses upp.Skillnader i intensiteten av VE-kadherinfärgning i endokardiet indikerade närvaron av anisotrop kontraktilitet i det embryonala endokardiet i den atrioventrikulära kanalen vid pre-valvulära stadier. Hela hjärtat färgades av VE-cadherinantikropp vid E8.5 och E9.5. Vid E8.5 tenderade endokardiet i den atrioventrikulära kanalen att ha en stabil epitelorganisation, och hörn som bildades av mer än fyra celler detekterades inte.Vid E9.5 observerades hörn av upp till sex celler som bildade rosettliknande strukturer, liknande den cellulära organisationen som tidigare beskrivits i epitel som genomgår aktiva cellomarrangemang, vilket tyder på att det atrioventrikulära kanalendokardiet genomgick dynamisk cellulär omläggning under ventilutveckling. En inlärningskurva är nödvändig för att bli expert på denna teknik. Dessutom rekommenderas det starkt att använda Sovereign pincett och volframtråd.Idag var visualisering av pre-valvular endokardium begränsat till tvärsnitt. Vårt tillvägagångssätt erbjuder möjligheten att studera embryonalt valvulärt endokardiumbeteende ur en plan synvinkel.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Contrast Imaging i musembryon Använda Högfrekvent Ultraljud

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Framställning av mitokondrie-anrikade fraktioner för Metabolic Analys i<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Stabil och effektiv genetisk modifiering av celler i vuxen mus V-SVZ för analys av neurala stamceller autonoma och icke-självständiga effekter

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Metoder för Exakt Lokaliserad Överföring av celler eller DNA i tidig postimplantationsförlust musembryon

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Kvantitativ analys av proteinuttryck att studera Lineage Specifikation i mus Preimplantatorisk embryon

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativa hela-mount immunofluorescens analys av hjärt stamceller populationer i musembryon

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Följande endokardiella vävnad rörelser via Cell Photoconversion i zebrafiskar embryot

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Avbildning av muskel-senan morfogenes i Drosophila puppor

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisera den noden och Notochordal plattan i Gastrulating musembryon som använder Scanning Electron Microscopy och hela Mount immunofluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ hybridisering för Astyanax embryon

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...