Name: en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos
Uploaded: 2022-07-27T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos at JoVE.com

Bu çalışma, MCIN/AEI/10.13039/501100011033'den J. L. P. J.G.-B.'ye PID2019-104776RB-I00 ve CB16/11/00399 (CIBER CV) hibeleri ile desteklenmiştir. Comunidad de Madrid'den Programa de Atracción de Talento tarafından finanse edildi (2020-5ª / BMD-19729). T.G.-C. Ayudas para la Formación de Profesorado Universitario (FPU18/01054) tarafından finanse edilmiştir. MCIN/AEI /10.13039/501100011033 ve FEDER "A way to make Europe" (#ICTS-2018-04-CNIC-16) tarafından ortaklaşa finanse edilen CNIC Mikroskopi ve Dinamik Görüntüleme Birimi, CNIC, ICTS-ReDib'e teşekkür ederiz. Ayrıca A. Galiçya ve L. Méndez'e fare yetiştiriciliği için teşekkür ederiz. Bu yayının maliyeti kısmen Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu'ndan gelen fonlarla desteklendi. CNIC, ISCIII, MCIN ve Pro CNIC Vakfı tarafından desteklenmektedir ve MCIN / AEI / 10.13039 / 501100011033 tarafından finanse edilen bir Severo Ochoa Mükemmeliyet Merkezi'dir (hibe CEX2020-001041-S).

Hayvan çalışmaları Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC) Hayvan Deneyleri Etik Komitesi ve Madrid Topluluğu tarafından onaylanmıştır (ref. PROEX 155.7/20). Tüm hayvan prosedürleri, Real Decreto 1201/2005 kapsamında İspanyol yasalarında yürürlüğe giren, deneysel ve diğer bilimsel amaçlar için kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 2010/63EU sayılı AB Direktifi ve 2007/526/EC sayılı Tavsiye Kararı'na uygundur.
1. ESÜ ve / veya OFT'ler...

<ol>
	<li>Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Building+the+mammalian+heart+from+two+sources+of+myocardial+cells.">Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells.</a> Nature Reviews Genetics. 6 (11), 826-835 (2005).</li><li>Kelly, R. G., Buckingham, M. E., Moorman, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+fields+and+cardiac+morphogenesis.">Heart fields and cardiac morphogenesis.</a> Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 4 (10), 015750 (2014).</li><li>Ivanovitch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=outflow+tract+heart+progenitors+arise+from+spatially+and+molecularly+distinct+regions+of+the+primitive+streak.">outflow tract heart progenitors arise from spatially and molecularly distinct regions of the primitive streak.</a> PLoS Biology. 19 (5), 3001200 (2021).</li><li>Rochais, F., Mesbah, K., Kelly, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+controlling+second+heart+field+development.">Signaling pathways controlling second heart field development.</a> Circulation Research. 104 (8), 933-942 (2009).</li><li>Moorman, A. F., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+chamber+formation:+Development,+genes,+and+evolution.">Cardiac chamber formation: Development, genes, and evolution.</a> Physiological Reviews. 83 (4), 1223-1267 (2003).</li><li>Timmerman, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+promotes+epithelial-mesenchymal+transition+during+cardiac+development+and+oncogenic+transformation.">Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation.</a> Genes &amp; Development. 18 (1), 99-115 (2004).</li><li>Luna-Zurita, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+a+Notch-dependent+mesenchymal+gene+program+and+Bmp2-driven+cell+invasiveness+regulates+murine+cardiac+valve+formation.">Integration of a Notch-dependent mesenchymal gene program and Bmp2-driven cell invasiveness regulates murine cardiac valve formation.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (10), 3493-3507 (2010).</li><li>Papoutsi, T., Luna-Zurita, L., Prados, B., Zaffran, S., de la Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmp2+and+Notch+cooperate+to+pattern+the+embryonic+endocardium.">Bmp2 and Notch cooperate to pattern the embryonic endocardium.</a> Development. 145 (13), (2018).</li><li>MacGrogan, D., Luna-Zurita, L., de la Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+in+cardiac+valve+development+and+disease.">Notch signaling in cardiac valve development and disease.</a> Birth Defects Research Part A: Clinical and Molecular Teratology. 91 (6), 449-459 (2011).</li><li>de la Pompa, J. L., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinating+tissue+interactions:+Notch+signaling+in+cardiac+development+and+disease.">Coordinating tissue interactions: Notch signaling in cardiac development and disease.</a> Developmental Cell. 22 (2), 244-254 (2012).</li><li>Runyan, R. B., Markwald, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+mesenchyme+into+three-dimensional+collagen+gels:+a+regional+and+temporal+analysis+of+interaction+in+embryonic+heart+tissue.">Invasion of mesenchyme into three-dimensional collagen gels: a regional and temporal analysis of interaction in embryonic heart tissue.</a> Developmental Cell. 95 (1), 108-114 (1983).</li><li>Wu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nfatc1+coordinates+valve+endocardial+cell+lineage+development+required+for+heart+valve+formation.">Nfatc1 coordinates valve endocardial cell lineage development required for heart valve formation.</a> Circulation Research. 109 (2), 183-192 (2011).</li><li>Amack, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+dynamics+of+EMT:+Lessons+from+live+in+vivo+imaging+of+embryonic+development.">Cellular dynamics of EMT: Lessons from live in vivo imaging of embryonic development.</a> Cell Communication and Signaling. 19 (1), 79 (2021).</li><li>Cano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+controls+epithelial-mesenchymal+transitions+by+repressing+E-cadherin+expression.">The transcription factor snail controls epithelial-mesenchymal transitions by repressing E-cadherin expression.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 76-83 (2000).</li><li>Batlle, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transcription+factor+snail+is+a+repressor+of+E-cadherin+gene+expression+in+epithelial+tumour+cells.">The transcription factor snail is a repressor of E-cadherin gene expression in epithelial tumour cells.</a> Nature Cell Biology. 2 (2), 84-89 (2000).</li><li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin-dependent+remodeling+of+adherens+junctions+protects+junctions+from+Snail-dependent+disassembly.">Myosin-dependent remodeling of adherens junctions protects junctions from Snail-dependent disassembly.</a> Journal of Cell Biology. 212 (2), 219-229 (2016).</li><li>Weng, M., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+protein+Par3/Bazooka+follows+myosin-dependent+junction+repositioning.">Polarity protein Par3/Bazooka follows myosin-dependent junction repositioning.</a> Developmental Biology. 422 (2), 125-134 (2017).</li><li>Jimenez-Amilburu, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+cardiomyocyte+apicobasal+polarity+reveals+epithelial+to+mesenchymal-like+transition+during+cardiac+trabeculation.">In vivo visualization of cardiomyocyte apicobasal polarity reveals epithelial to mesenchymal-like transition during cardiac trabeculation.</a> Cell Reports. 17 (10), 2687-2699 (2016).</li><li>Davey, C. F., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+in+moving+cells:+Think+globally,+act+locally.">Planar cell polarity in moving cells: Think globally, act locally.</a> Development. 144 (2), 187-200 (2017).</li><li>Grego-Bessa, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumor+suppressor+PTEN+and+the+PDK1+kinase+regulate+formation+of+the+columnar+neural+epithelium.">The tumor suppressor PTEN and the PDK1 kinase regulate formation of the columnar neural epithelium.</a> Elife. 5, 12034 (2016).</li><li>Jones, C., Chen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+in+vertebrates.">Planar cell polarity signaling in vertebrates.</a> Bioessays. 29 (2), 120-132 (2007).</li><li>Mahaffey, J. P., Grego-Bessa, J., Liem, K. F., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cofilin+and+Vangl2+cooperate+in+the+initiation+of+planar+cell+polarity+in+the+mouse+embryo.">Cofilin and Vangl2 cooperate in the initiation of planar cell polarity in the mouse embryo.</a> Development. 140 (6), 1262-1271 (2013).</li><li>Devenport, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+morphodynamics:+Translating+planar+polarity+cues+into+polarized+cell+behaviors.">Tissue morphodynamics: Translating planar polarity cues into polarized cell behaviors.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 55, 99-110 (2016).</li><li>Del Monte, G., Grego-Bessa, J., Gonzalez-Rajal, A., Bolos, V., De La Pompa, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Notch1+activity+in+development:+Evidence+for+a+feedback+regulatory+loop.">Monitoring Notch1 activity in development: Evidence for a feedback regulatory loop.</a> Developmental Dynamics. 236 (9), 2594-2614 (2007).</li><li>Xiao, C., Nitsche, F., Bazzi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+node+and+notochordal+plate+in+gastrulating+mouse+embryos+using+scanning+electron+microscopy+and+whole+mount+immunofluorescence.">Visualizing the node and notochordal plate in gastrulating mouse embryos using scanning electron microscopy and whole mount immunofluorescence.</a> Journal of Visualized Experiments. (141), e58321 (2018).</li><li>Mahler, G., Gould, R., Butcher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+avian+embryonic+valvular+progenitor+cells.">Isolation and culture of avian embryonic valvular progenitor cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (44), e2159 (2010).</li><li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+double-fluorescent+Cre+reporter+mouse.">A global double-fluorescent Cre reporter mouse.</a> Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ephrin-B2+controls+VEGF-induced+angiogenesis+and+lymphangiogenesis.">Ephrin-B2 controls VEGF-induced angiogenesis and lymphangiogenesis.</a> Nature. 465 (7297), 483-486 (2010).</li><li>Yilmaz, M., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMT,+the+cytoskeleton,+and+cancer+cell+invasion.">EMT, the cytoskeleton, and cancer cell invasion.</a> Cancer and Metastasis Reviews. 28 (1-2), 15-33 (2009).</li><li>Nishimura, T., Honda, H., Takeichi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+links+axes+of+spatial+dynamics+in+neural-tube+closure.">Planar cell polarity links axes of spatial dynamics in neural-tube closure.</a> Cell. 149 (5), 1084-1097 (2012).</li><li>Blankenship, J. T., Backovic, S. T., Sanny, J. S., Weitz, O., Zallen, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+rosette+formation+links+planar+cell+polarity+to+tissue+morphogenesis.">Multicellular rosette formation links planar cell polarity to tissue morphogenesis.</a> Developmental Cell. 11 (4), 459-470 (2006).</li><li>Prados, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+Bmp2+gain+causes+ectopic+EMT+and+promotes+cardiomyocyte+proliferation+and+immaturity.">Myocardial Bmp2 gain causes ectopic EMT and promotes cardiomyocyte proliferation and immaturity.</a> Cell Death and Disease. 9 (3), 399 (2018).</li><li>Camenisch, T. D., Biesterfeldt, J., Brehm-Gibson, T., Bradley, J., McDonald, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+cardiac+cushion+development+by+hyaluronan.">Regulation of cardiac cushion development by hyaluronan.</a> Experimental &amp; Clinical Cardiology. 6 (1), 4-10 (2001).</li><li>Courchaine, K., Rykiel, G., Rugonyi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+blood+flow+on+cardiac+development.">Influence of blood flow on cardiac development.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 137, 95-110 (2018).</li><li>Goddard, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamic+forces+sculpt+developing+heart+valves+through+a+KLF2-WNT9B+paracrine+signaling+axis.">Hemodynamic forces sculpt developing heart valves through a KLF2-WNT9B paracrine signaling axis.</a> Developmental Cell. 43 (3), 274-289 (2017).</li></ol>

Endokard, embriyonik kalp tüpünün tüm iç yüzeyini kaplayan epitel tek katmanlıdır. Kapak gelişimi sırasında, prospektif kapak bölgelerindeki endokardiyal hücreler EMT'ye maruz kalır, böylece endokardiyal hücreler endokarddan kardiyak jöleye doğru delaminasyon yapmak için sitoiskeletlerini dönüştürür ve yeniden düzenler. Biz ve diğerleri, endokardın 6,8,24,32 hücre sırası olarak gösterildiği E8.5 ve E9.5 embriyonik kalplerinin enine bölümlerini analiz e...

Kalp, bir memeli embriyosunun ilk fonksiyonel organıdır. Farelerde embriyonik gün (E) 7.5 civarında, bilateral prekardiyak mezoderm hücreleri ventral taraftaki kardiyak hilali oluşturur1. Kardiyak hilal, miyokard ve endokard2'nin progenitörlerini içeren iki prekardiyak hücre popülasyonu içerir. E8.0 civarında, kardiyak öncüller orta hatta kaynaşır ve iki epitel dokusundan, dış miyokarddan ve kardiyak jöle adı verilen hücre dışı bir matrisle ayrılmış özel bir endotel olan iç endokarddan oluşan ilkel kalp tüpünü oluşturur. Daha sonra, E8.5'te, kalp tüpü sağa doğru döngüye girer. Döngülü kalp, çıkış yolu (OFT), ventriküller ve atrio-ventriküler kanal (AVC)3 gibi spesifik moleküler imzalara sahip farklı anatomik bölgelere sahiptir. Başlangıçta kalp tüpü,hücre 4'ün eklenmesiyle giriş tarafında genişlemiş olsa da, E9.5'te, yoğun kardiyak proliferasyon, odaların balonlaşmasına ve trabeküler ağın kurulmasına neden olur5. Kapak oluşumu AVC'de (gelecekteki mitral ve triküspid kapaklar) ve OFT'de (gelecekteki aort ve pulmoner kapaklar) gerçekleşir.
Endokard, kapak gelişiminde çok önemli rol oynar. Endokardiyal hücreler, kapak gelişiminin başlangıcında ortaya çıkan bir yapı olan endokardiyal yastıkları oluşturmak için AVC ve OFT'de epitelyal-mezenkimal geçişe (EMT) uğrar. Farklı sinyal yolları bu süreci aktive eder; farelerde E9.5'te, miyokardiyal kaynaklı BMP2'ye yanıt olarak endokardda aktive edilen NOTCH, TGFβ2 ve salyangozun (SNAI1) aktivasyonu yoluyla AVC ve OFT bölgelerindeki endokardiyal hücrelerin invaziv EMT'sini teşvik eder, bu da aderans kavşaklarının (AJ'ler) bir transmembran bileşeni olan vasküler endotelyal kadherinin (VE-kadherin) ekspresyonunu doğrudan bastırır6,7,8 . OFT'de, EMT'yi başlatmak için endokardın aktivasyonu, ifadesi NOTCH 9,10,11,12 tarafından aktive edilen FGF8 ve BMP4 tarafından aracılık edilir.
EMT'nin ilerlemesi, hücreler şekil değiştirirken, komşularıyla kavşakları kırıp yeniden oluştururken, delaminasyona girerken ve göç etmeye başlarken hücresel dinamikleri içerir13. Bu değişiklikler arasında AJ remodelizasyonu ve kademeli olarak sökülmesi14,15, düzlemsel hücre polaritesi (PCP) sinyalizasyonu, apiko-bazal polarite kaybı (ABP), apikal daralma ve sitoiskelet organizasyonu16,17 bulunmaktadır. ABP, proteinlerin bir hücrenin ön-arka ekseni boyunca dağılımını ifade eder. Gelişmekte olan kalpte, ventrikül gelişimi için kardiyomiyositlerde ABP regülasyonu gereklidir18. PCP, proteinlerin bir doku düzlemi boyunca hücreler içindeki polarize dağılımını ifade eder ve hücresel dağılımı düzenler; Kararlı bir geometriye sahip epitelya, altıgen şekilli hücrelerden oluşur ve burada sadece üç hücre19,20,21,22 köşelerinde birleşir. Epitel morfogenezi sırasında meydana gelen hücre bölünmesi, komşu değişimi veya delaminasyon gibi farklı hücresel süreçler, bir köşede birleşen hücrelerin sayısında ve belirli bir hücreninsahip olduğu komşu hücrelerin sayısında bir artış üretir. PCP ile ilgili bu hücresel davranışlar farklı sinyal yolakları, aktin dinamikleri veya hücre içi kaçakçılıktarafından düzenlenebilir 23.
Farelerde kapak gelişimini inceleyen veriler, endokardın bir hücre alanı yerine bir hücre çizgisi olarak gösterildiği E8.5 ve E9.5 embriyonik kalplerinin enine, koronal veya sagital bölümlerinden elde edilmiştir - endokard, kalp tüpünün tüm iç yüzeyini kaplar24. Embriyonik kesitler, fare embriyolarının endokardında PCP analizine izin vermez. Yeni deneysel yöntemimiz, temsili sonuçlarda gösterildiği gibi endokardiyal hücre dağılımının, AJ anizotropisinin ve tek hücreli şekil analizinin analizine izin verir. Bu tür veriler, PCP analizi için, bu raporda gösterilmeyen PCP ile ilgili diğer moleküllerin tanımı ile birlikte gereklidir. Tam montajlı immünofloresan, spesifik numune hazırlama ve genetiği değiştirilmiş farelerin kullanımı, farelerde kapak gelişiminin başlangıcında endokardda düzlemsel polarite analizini mümkün kılar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>4-OH-Tamoxifen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>H-6278</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16 % Paraformaldheyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>157-10</td>
			<td>Dilute to 4% in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-GFP</td>
			<td>Aves Labs</td>
			<td>FGP-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-VECadherin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Chicken, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A-11039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 647</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-605-174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A4099,0005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides Superfrost PLUS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>631-0108</td>
			<td>25 mm x 75 mm x 1.0 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>A4974,0500</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

en face endocardial cushion preparation for planar morphogenesis analysis in mouse embryos

Memeli kalbinin gelişiminin altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaların incelenmesi, insan konjenital kalp hastalığını ele almak için esastır. İlkel kalp kapakçıklarının gelişimi, lokal endüktif miyokard ve endokardiyal sinyallere yanıt olarak endikonitriyal hücrelerin atriyoventriküler kanal (AVC) ve kalbin çıkış yolu (OFT) bölgelerinden epitel-mezenkimal geçişini (EMT) içerir. Hücreler delaminasyona girdiğinde ve endokard ile miyokard arasında bulunan hücre dışı matriksi (kardiyak jöle) istila ettiğinde, ilkel endokardiyal yastıklar (EC) oluşur. Bu işlem, endokardın delamine edilmiş hücreler tarafından bırakılan boşlukları doldurması ve bir eksen boyunca yakınsamak (daralmak) veya uzatmak (uzatmak) için kendini yeniden organize etmesi gerektiği anlamına gelir. Mevcut araştırmalar, bu süreçte yer alan faktörlerin hücre altı lokalizasyonunu düzenlemede düzlemsel hücre polaritesi (PCP) yolunu etkilemiştir. Klasik olarak, kalp kapağı gelişiminin ilk aşamaları, embriyonik kalplerin kesitlerinde veya kollajen jelleri üzerinde kültürlenmiş ex vivo AVC veya OFT eksplantlarında incelenmiştir. Bu yaklaşımlar apiko-bazal polaritenin analizine izin verir, ancak epitel düzlemindeki hücre davranışının veya göç eden hücrelerin morfolojik değişikliklerinin analizine izin vermez. Burada, valvulojenik bölgelerdeki endokardın hücrelerin düzlemsel bir alanı olarak görselleştirilmesini sağlayan deneysel bir yaklaşım sunuyoruz. Bu deneysel yaklaşım, valf gelişimi sırasında OFT ve AVC'nin endokardiyumunda PCP, düzlemsel topoloji ve hücreler arası iletişimi inceleme fırsatı sunar. Kardiyak kapak morfogenezinde rol oynayan yeni hücresel mekanizmaların deşifre edilmesi, endokardiyal yastık defekti ile ilişkili konjenital kalp hastalığının anlaşılmasına katkıda bulunabilir.

Bu protokol kullanılarak üretilen veriler, AVC'nin endokardının en yüz görüntülemesinin gerçekleştirilmesinin mümkün olduğunu göstermektedir. İlk amaç, kapakçıkların oluşumu sırasında endokardın hücre şeklini hücresel çözünürlükte analiz etmekti (Şekil 1). E9.5'teki bireysel endokardiyal hücreleri vurgulamak için, iki transgenik fare suşu kullandık. (1) ROSAmT/mG, hücre zarında floresansı tespit edilen iki renkli floresan Cr...

Watch this Scientific Journal Video about En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos at JoVE.com

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Klasik olarak, fare embriyonik kapak primordiyumunun endokardiyumu transversal, koronal veya sagital kesitler kullanılarak analiz edilmiştir. Valvulojenik bölgelerde endokardın en yüzlü, iki boyutlu görüntülenmesi için yeni yaklaşımımız, kapak gelişimi sırasında endokardın düzlemsel polarite ve hücre yeniden düzenleme analizine izin verir.

En Yüz Fare Embriyolarında Düzlemsel Morfogenez Analizi için Endokardiyal Minderin Hazırlanması

The study of the cellular and molecular mechanisms underlying the development of the mammalian heart is essential to address human congenital heart ...

Bu protokol, ilkel endokardın düzlemsel bir oryantasyonda analiz edilmesini sağlar. Endokardiyal hücrelerin dağılımını, diğer emirlerin anizotropisini analiz edebilir ve kapak gelişimi sırasında tek bir endokardiyal hücrenin şeklini tanımlayabiliriz. Klasik doku kesitleri ile karşılaştırıldığında, iç kapak rejeneratif bölgesinin en yüz görüntülemesi, bozulmamış embriyolarda kapak gelişimi sırasında endokardiyal hücrelerin düzlemsel hücre polaritesinin ve dinamiklerinin analizine olanak sağlar.Bu yöntem, kardiyo gelişimi sırasında düzlemsel hücre polaritesi bilgisini derinleştirmek için kullanılabilir. Ötanize hamile farelerden eksize edilen uterusu, buz gibi soğuk PBT içeren bir Petri kabına yerleştirerek başlayın. İnce forseps kullanarak diseksiyon mikroskobu altında bireysel desidüyü uterustan çıkarın.İnce cımbız kullanarak, embriyonun bulunduğu yer olan decidua'nın beyaz kısmında bir kesi yapın. Yavaşça çıkarın, çekmekten kaçının ve embriyoları, ucu kesilmiş bir P-1000 kullanarak taze PBT'li yeni bir Petri kabına aktarın ve embriyonun kırılmadan geçmesi için yeterince büyük bir çap bırakın. Genotipleme için, yumurta sarısı kesesinin yaklaşık 0,5 milimetre kare küçük bir parçasını veya arka uçtan kuyruğun bir parçasını alın, başa doğru beş ila 10 somit sayın ve uygun tamponun 100 mililitresinde sindirin.Duman başlığının altında, embriyoları dört santigrat derecede iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde buz gibi soğuk% 4 PFA'ya aktarın. Embriyoları bir nutator üzerinde iki saatten bir geceye dört santigrat derecede sabitleyin. Duman başlığının altında, embriyolara dokunmadan mikrosantrifüj tüplerinden% 4 PFA fiksatifini çıkarın.PFA'yı uygun bir kaba atın. Embriyoları soğuk PBT'de oda sıcaklığında 10 dakika boyunca beş kez yıkayın. İnce forseps kullanarak kalbi çıkarın ve taze PBT'li yeni bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.PBT'yi PBS Triton ile değiştirin ve numuneleri yörüngesel bir çalkalayıcıda oda sıcaklığında her biri beş dakika olmak üzere üç kez yıkayın. PBS Triton'u, %10 ısıda inaktive edilmiş sığır serumu içeren PBS Triton içeren bir blokaj çözeltisi ile değiştirin. Yörüngesel bir çalkalayıcıda iki saatten gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.Bloke edici çözeltiyi, istenen konsantrasyonda birincil antikor içeren blokaj çözeltisi ile değiştirin. Dört santigrat derecede yörüngesel bir çalkalayıcıda gece boyunca inkübe edin. Dört santigrat derecede gece inkübasyonundan sonra, numuneleri yörüngesel bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca inkübe edin.Bu adım, sinyal-gürültü oranını artırmak için çok önemlidir. Birincil antikor çözeltisini çıkarın ve gelecekteki üç deneye kadar dört santigrat derecede tutun. En iyi koruma için% 0.02'lik bir son konsantrasyona sodyum azid ekleyin.Ardından, embriyoları PBS Triton ile her biri üç dakika boyunca üç kez yıkayın. Embriyoları PBS Triton ile 30 dakika boyunca üç kez yıkayın ve dört santigrat derecede yörüngesel bir çalkalayıcıda tutun. Son yıkamadan sonra, birincil antikor konakçı türlerine karşı floresan konjuge sekonjuge sekonder antikor içeren bir mililitre bloke edici çözelti ekleyin.Daha sonra çözeltiye DAPI ekleyin ve embriyoları gece boyunca dört santigrat derecede yörüngesel bir çalkalayıcıda inkübe edin. Dört santigrat derecede gece inkübasyonundan sonra, embriyoları yörüngesel bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca inkübe edin. Bu adım, sinyal-gürültü oranını artırmak için gereklidir.PBS Triton yıkama adımlarını metin yazısında belirtildiği gibi tekrarlayın. Kalpleri PBS içeren 35 milimetrelik bir Petri kabına koyun. Bir tungsten tel ve ince forseps kullanarak, atriyoventriküler kanalı veya çıkış yolunu izole edin ve uzunlamasına kesin.DAPI'siz floresan için kapak fişleri, slaytlar, forsepsler, uygun uçlara sahip bir P-200 pipeti, bir kağıt havlu ve sulu gliserol bazlı montaj ortamları hazırlayın. Numunelerin ezmeden orijinal şekillerini korumalarını sağlayacak bir 3B oda alanı oluşturmak için 0,3 ila 0,6 santimetre arasında ayrılmış bir slayta iki bant şeridi yapıştırın. Daha sonra, yaklaşık 20 mikrolitre tampon kullanarak, kesilmiş bir P-200 pipet ucu kullanarak numuneleri bant şeritleri arasındaki slayda dikkatlice bırakın.Doğruluğu artırmak için diseksiyon mikroskobu kullanın. İnce forseps kullanarak, örnekleri endokardiyumu yukarı bakacak ve miyokard aşağı bakacak şekilde slaytın üzerine yerleştirin. Fazla PBS'yi kağıt havluyla çıkarın ve numuneye dokunmaktan kaçının.Ardından, numunelerin slayda yapışmasını sağlamak için numuneleri oda sıcaklığında bir ila iki dakika kurulayın. Mendile 40 mikrolitre sulu bazlı montaj ortamı ekleyin. Kapak kaymasını iki bant parçasının üzerine yerleştirin ve bir iğne veya forseps ile yavaşça dokuya indirin.Hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. Kapak kaymasını, kapak kaymasının her köşesine bir damla oje kullanarak kapatın. Oje kuruduktan sonra, emici bir kağıt havlu kullanarak kapak kaymasının kenarlarındaki fazla montaj ortamını temizleyin.Kapak kaymasını hareket ettirmekten kaçının. Kapağı tamamen kapatmak için kapak kayma kenarları boyunca oje ekleyerek montaj ortamının buharlaşmasını önleyin. Dik veya ters çevrilmiş bir konfokal mikroskop kullanarak, genel görünüm için 10X büyütmede ve ayrıntılı görüntüler için 3X yakınlaştırma ile 63X'te görüntüler çekin.Endokardın hücre şekli, kapakçıkların hücresel çözünürlükte oluşumu sırasında analiz edildi. Tek hücreler veya birkaç hücrenin klonları endokardda GFP'yi eksprese etti. GFP ekspresyonu ve VE-kadherin hücre altı lokalizasyonu ile kombinasyon, AJ dinamiği ile filopodia oluşumu ve EMT öncesi hücreler arasındaki ilişkiyi incelemek için etkili bir yaklaşımdı, çünkü bu hücreler AJ'ler çözülürken membran çıkıntıları geliştirdi.Endokarddaki VE-kadherin boyamasının yoğunluğundaki farklılıklar, pre-valvüler aşamalarda atriyoventriküler kanalın embriyonik endokardında anizotropik kontraktilitenin varlığını göstermiştir. Tüm kalp E8.5 ve E9.5'te VE-kadherin antikoru ile boyandı. E8.5'te, atriyoventriküler kanalın endokardının stabil bir epitel organizasyonuna sahip olma eğilimindeydi ve dörtten fazla hücre tarafından oluşturulan köşeler tespit edilmedi.E9.5'te, altı hücreye kadar olan köşelerin, daha önce aktif hücre yeniden düzenlemelerinden geçen epitelyalde tarif edilen hücresel organizasyona benzer şekilde rozet benzeri yapılar oluşturduğu gözlendi, bu da atriyoventriküler kanal endokardının kapak gelişimi sırasında dinamik hücresel yeniden düzenlemeye uğradığını düşündürdü. Bu teknikte uzman olmak için bir öğrenme eğrisi gereklidir. Ayrıca, Sovereign forseps ve tungsten tel kullanılması şiddetle tavsiye edilir.Günümüzde prevalvüler endokardın görüntülenmesi kesitlerle sınırlıydı. Yaklaşımımız, embriyonik kapak endokardiyumu davranışını düzlemsel bir bakış açısıyla inceleme imkanı sunmaktadır.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

En Face Endocardial Cushion Preparation for Planar Morphogenesis Analysis in Mouse Embryos

Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Yüksek frekanslı Ultrason Kullanımı Fare Embriyolar Kontrast Görüntüleme

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Metabolik Analiz Mitokondriyal Zenginleştirilmiş Kesirler Hazırlanması<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

Nöral Analizi Yetişkin Fare V-SVZ&#39;una Hücre istikrarlı ve verimli Genetik Modifikasyon Kök Hücre Özerk ve Non-özerk Etkileri

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Erken Postimplantation Fare Embriyolar içine Hücreleri veya DNA Kesinlikle lokalize Transferi Yöntemleri

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

Protein İfade Kantitatif Analiz Fare Preimplantasyon Embriyolar Lineage Şartname Eğitim için

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Nicel bütün Dağı ayirt analiz fare embriyo kardiyak progenitör nüfusun

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Following Endocardial Tissue Movements via Cell Photoconversion in the Zebrafish Embryo

Zebra balığı embriyo hücre Photoconversion ile aşağıdaki Endocardial doku hareketleri

During embryogenesis, cells undergo dynamic changes in cell behavior, and deciphering the cellular logic behind these changes is a fundamental goal in the ...

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Vivo Kas-tendon morfogenez Drosophila pupa içinde görüntüleme

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Düğüm ve Notochordal plaka Gastrulating fare embriyo Tarama elektron mikroskobu ve bütün Dağı ayirt kullanarak görselleştirme

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

Wholemount In Situ Hybridization for Astyanax Embryos

İn Situ hibridizasyon Astyanax embriyo için Wholemount

In recent years, a draft genome for the blind Mexican cavefish (Astyanax mexicanus) has been released, revealing the sequence identities for thousands of ...