Name: separation of immune cell subpopulations in peripheral blood samples from children with infectious mononucleosis
Uploaded: 2022-09-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (82002130), Beijing Natural Science Foundation (7222059) og CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).

Blodprøver blev taget fra patienter med IM (n = 3), raske EBV-bærere (n = 3) og EBV-uinficerede børn (n = 3). Frivillige blev rekrutteret fra Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, og alle undersøgelser blev etisk godkendt. Etisk godkendelse blev opnået af den etiske komité for Beijing Children's Hospital, Capital Medical University (godkendelsesnummer: [2021]-E-056-Y). Informeret samtykke fra patienter blev frafaldet, da undersøgelsen kun brugte de resterende prøver til klinisk test. Alle data ...

<ol>
	<li>Kwok, H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+conventional+to+next+generation+sequencing+of+Epstein-Barr+virus+genomes.">From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes.</a> Viruses. 8 (3), 60 (2016).</li><li>Bu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+components+of+the+viral+fusion+apparatus+elicits+antibodies+that+neutralize+Epstein-Barr+virus+in+B+cells+and+epithelial+cells.">Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells.</a> Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).</li><li>Balfour, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral,+virology,+and+immunologic+factors+associated+with+acquisition+and+severity+of+primary+Epstein-Barr+virus+infection+in+university+students.">Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students.</a> Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).</li><li>Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+mononucleosis.">Infectious mononucleosis.</a> New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).</li><li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+research+on+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection+in+Japan.">Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan.</a> Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).</li><li>Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+infection+and+nasopharyngeal+carcinoma.">Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).</li><li>Zhong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+transcriptome+profiling+reveals+major+cell+types+in+the+cellular+immune+response+against+acute+and+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection.">Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).</li><li>Fedyanina, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+and+clinical+significance+of+atypical+mononuclear+cells+in+infectious+mononucleosis+caused+by+the+Epstein-Barr+virus+in+children.">The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children.</a> Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).</li><li>Al Tabaa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+polyclonal+activation+and+Epstein-Barr+viral+abortive+lytic+cycle+are+two+key+features+in+acute+infectious+mononucleosis.">B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis.</a> Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).</li><li>M, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+cell+transcriptome+during+primary+EBV+infection+and+EBV+associated+Hodgkin+Lymphoma+in+children-A+preliminary+observation.">Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation.</a> Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).</li><li>Greenough, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+signature+that+correlates+with+CD8++T+cell+expansion+in+acute+EBV+infection.">A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection.</a> Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).</li><li>Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+method+of+cell+separation+from+bile+of+patients+with+cholangiocarcinoma+for+flow+cytometry.">Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry.</a> Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+(cTfh)+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry.">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).</li><li>Djaoud, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+alternate+strategies+for+innate+immunity+to+Epstein-Barr+virus:+One+using+NK+cells+and+the+other+NK+cells+and+gammadelta+T+cells.">Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).</li><li>Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+in+post-transplant+lymphoproliferative+disorders.">Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders.</a> Cancers. 13 (8), 1836 (2021).</li><li>Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+analysis+of+CD8++T+cell+responses+to+EBV+reveals+differences+between+primary+and+persistent+infection.">Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).</li><li>Zamai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Synergy+of+NKp46+and+co-activating+signals+in+various+NK+cell+subpopulations:+paving+the+way+for+more+successful+NK-cell-based+immunotherapy.">Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), 753 (2020).</li><li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD4++and+CD8++polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection.">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).</li><li>Choi, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+by+the+Epstein-Barr+virus+LMP1+protein+induces+potent+cytotoxic+CD4(+)+and+CD8(+)+T+cell+responses.">Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).</li></ol>

Denne protokol repræsenterer en effektiv måde at sortere perifere blodimmuncelleunderpopulationer på. I denne undersøgelse blev venøse blodprøver fra patienter med IM, raske EBV-bærere og EBV-uinficerede børn valgt som forskningsmål. Dette arbejde ved hjælp af perifert blod fra patienter i IM fokuserer primært på at analysere og bestemme proportionerne af forskellige celleundergrupper gennem flerfarvet flowcytometri. Transkriptomsekventering anvendes hovedsageligt til påvisning og analyse af en bestemt subpo...

Epstein-Barr-virus (EBV), et γ-herpesvirus, også kendt som human herpesvirus type 4, er allestedsnærværende i den menneskelige befolkning og etablerer livslang latent infektion hos mere end 90% af den voksne befolkning1. De fleste EBV-primære infektioner forekommer i barndommen og ungdommen, hvor en brøkdel af patienterne manifesterer sig med infektiøs mononukleose (IM)2, der viser karakteristisk immunopatologi, herunder et aktiveret immunrespons med CD8 + T-celler i blod og en forbigående proliferation af EBV-inficerede B-celler i oropharynx3. Forløbet af IM kan vare i 2-6 uger, og størstedelen af patienterne kommer sig godt4. Imidlertid udvikler nogle individer vedvarende eller tilbagevendende IM-lignende symptomer med høj sygelighed og dødelighed, som er klassificeret som kronisk aktiv EBV-infektion (CAEBV)5. Derudover er EBV en vigtig onkogen virus, som er tæt forbundet med en række maligniteter, herunder epithelioid og lymfoid maligniteter såsom asnasopharyngeal carcinom, Burkitts lymfom, Hodgkins lymfom (HL) og T / NK-cellelymfom6. Selvom EBV er blevet undersøgt i over 50 år, er dets patogenese og den mekanisme, hvormed det inducerer spredning af lymfocytter, ikke blevet fuldt belyst.
Flere undersøgelser har undersøgt de molekylære signaturer for immunpatologien af EBV-infektion ved transkriptomsekventering. Zhong et al. analyserede heltranskriptomprofilering af mononukleære celler i perifert blod (PBMC'er) fra kinesiske børn med IM eller CAEBV for at finde ud af, at CD8 + T-celleudvidelse overvejende blev fundet i IM-gruppe7, hvilket tyder på, at CD8 + T-celler kan spille en vigtig rolle i IM. Tilsvarende fandt en anden undersøgelse lavere andele af EBV-specifikke cytotoksiske T- og CD19+ B-celler og højere procentdele af CD8+ T-celler hos patienter med IM forårsaget af primær EBV-infektion end hos patienter med IM forårsaget både af EBV-reaktivering og andre midler8. B-celler er først involveret i IM, fordi EBV-receptorer præsenteres på deres overflade. Al Tabaa et al. fandt, at B-celler var polyklonalt aktiverede og differentierede intoplasmablaster (CD19+, CD27+ og CD20− og CD138− celler) og plasmaceller (CD19+, CD27+ og CD20− og CD138+) under IM9. Desuden fandt Zhong et al., at monocytmarkører CD14 og CD64 blev opreguleret i CAEBV, hvilket tyder på, at monocytter kan spille en vigtig rolle i CAEBV's cellulære immunrespons gennem antistofafhængig cellulær cytotoksicitet (ADCC) og hyperaktiv fagocytose7. Alka et al. karakteriserede transkriptomet af MACS sorterede CD56dim CD16+ NK-celler fra fire patienter med IM eller HL og fandt ud af, at NK-celler fra både IM og HL havde nedreguleret medfødt immunitet og kemokinsignaleringsgener, som kunne være ansvarlige for hyporesponsen af NK-celler10. Derudover analyserede Greenough et al. genekspression af sorterede CD8 + T-celler fra 10 PBMC'er af personer med IM. De rapporterede, at en stor del af CD8 + T-celler i IM var virusspecifikke, aktiverede, delte og primerede til at udøve effektoraktiviteter11. Både T-cellemedierede, EBV-specifikke reaktioner og NK-cellemedierede, uspecifikke reaktioner spiller væsentlige roller under primær EBV-infektion. Disse undersøgelser undersøgte imidlertid kun transkriptomresultaterne af den forskelligartede blanding af immunceller eller kun en bestemt subpopulation af lymfocytter, hvilket ikke er tilstrækkeligt til en omfattende sammenligning af de molekylære egenskaber og funktioner hos forskellige immuncelleunderpopulationer hos børn med IM i samme sygdomstilstand.
Dette papir beskriver en metode, der kombinerer immunomagnetiske perler og fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) for at isolere og analysere definerede immuncelleunderpopulationer af PBMC'er (monocytter, CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler og NK-celler). Ved hjælp af denne metode kan magnetiske og fluorescerende mærkede celler renses ved hjælp af en magnetisk separator og FACS eller analyseres ved flowcytometri. RNA kan ekstraheres fra de oprensede celler til transkriptomsekventering. Denne metode vil muliggøre karakterisering og genekspression af forskellige immunceller i samme sygdomstilstande hos personer med IM, hvilket vil udvide vores forståelse af immunpatologien af EBV-infektion.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD16</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302012</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD56 (NCAM)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>362504</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-human CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344616</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria fluorescence-activated&#160;flow&#160;cell&#160;sorter-cytometer (BD FACSAria II)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>644832</td>
			<td>Cell sort</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell ctng slides</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1450016</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (&#8805;99%, BioPremium)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST1303</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>&#160;367862&#160;</td>
			<td>EDTA anticoagulant tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD19</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302206</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;3K15</td>
			<td>Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human lymphocyte separation medium</td>
			<td>Dakewe</td>
			<td>DKW-KLSH-0100</td>
			<td>Ficoll-Paque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS&#160;Separation&#160;columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Separation&#160;columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>Magnetic bead separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344706</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344808</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>BI</td>
			<td>02-024-1ACS</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL tube for FACS flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596024</td>
			<td>Lyse cells for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td>Trypan Blue Staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of immune cell subpopulations in peripheral blood samples from children with infectious mononucleosis

Infektiøs mononukleose (IM) er et akut syndrom, der hovedsagelig er forbundet med primær Epstein-Barr-virus (EBV) infektion. De vigtigste kliniske symptomer omfatter uregelmæssig feber, lymfadenopati og signifikant øgede lymfocytter i perifert blod. Den patogene mekanisme for IM er stadig uklar; Der er ingen effektiv behandlingsmetode til det, hvor hovedsageligt symptomatiske terapier er tilgængelige. Hovedspørgsmålet i EBV-immunbiologi er, hvorfor kun en lille delmængde af inficerede individer viser alvorlige kliniske symptomer og endda udvikler EBV-associerede maligniteter, mens de fleste individer er asymptomatiske for livet med virussen.
B-celler er først involveret i IM, fordi EBV-receptorer præsenteres på deres overflade. Naturlige dræberceller (NK) er cytotoksiske medfødte lymfocytter, der er vigtige for at dræbe EBV-inficerede celler. Andelen af CD4 + T-celler falder, mens CD8 + T-celler udvides dramatisk under akut EBV-infektion, og persistensen af CD8 + T-celler er vigtig for livslang kontrol af IM. Disse immunceller spiller vigtige roller i IM, og deres funktioner skal identificeres separat. Til dette formål adskilles monocytter først fra perifere blodmononukleære celler (PBMC'er) af IM-individer ved hjælp af CD14-mikroperler, en søjle og en magnetisk separator.
De resterende PBMC'er er farvet med peridinin-chlorophyll-protein (PerCP)/Cyanine 5,5 anti-CD3, allophycocyanin (APC)/Cyanine 7 anti-CD4, phycoerythrin (PE) anti-CD8, fluoresceinisothiocyanat (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 og APC anti-CD16 antistoffer til sortering af CD4+ T-celler, CD8+ T-celler, B-celler og NK-celler ved hjælp af et flowcytometer. Desuden blev transkriptomsekventering af fem subpopulationer udført for at udforske deres funktioner og patogene mekanismer i IM.

Henvisning til gating-strategien Gating-strategien, der blev brugt til at sortere de fire lymfocytunderpopulationer, er vist i figur 1. Kort fortalt vælges lymfocytter (P1) på et prikplot, der viser granulositeten (SSC-A) versus størrelse (FSC-A). Derefter vælges enkeltceller (P2) på et prikplot, der viser størrelsen (FSC-A) versus fremadgående spredning (FSC-H), mens dubletceller er udelukket. CD3+ T-celler (P3) og CD19+ B-celler (<strong cla...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis at JoVE.com

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Vi beskriver en metode, der kombinerer immunmagnetiske perler og fluorescensaktiveret cellesortering for at isolere og analysere definerede immuncelleunderpopulationer af mononukleære celler i perifert blod (monocytter, CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler og naturlige dræberceller). Ved hjælp af denne metode kan magnetiske og fluorescerende mærkede celler renses og analyseres.

Adskillelse af immuncelleunderpopulationer i perifere blodprøver fra børn med infektiøs mononukleose

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...

Denne metode vil muliggøre karakterisering af forskellige immunceller i de samme sygdomstilstande hos personer med IM, hvilket vil udvide vores forståelse af mekanismen for EBV-infektion. Demonstrerer proceduren vil være Linlin Zhang, en læge fra vores laboratorium. Til at begynde med skal du tage PBMC'erne isoleret tidligere i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør og dreje det ved 300 G i 10 minutter ved stuetemperatur.Kassér supernatanten, og suspender cellerne igen med 80 mikroliter af den forberedte buffer. Derefter tilsættes 20 mikroliter CD 14 mikroperler til cellesuspensionen, blandes godt ved pipettering, og inkuberes røret i 15 minutter på is. Derefter vaskes PBMC'erne med en milliliter buffer og centrifuge ved 300 G i 10 minutter ved stuetemperatur.Kassér hele supernatanten, og suspender cellerne igen med 500 mikroliter bufferen. For magnetisk adskillelse skal du placere en søjle på den magnetiske perleseparator og prime søjlen ved at vaske den med tre milliliter af bufferen. Tilføj derefter cellesuspensionen til kolonnen.Lad det passere igennem, og saml de umærkede celler i et 15 milliliter centrifugerør. Søjlen vaskes tre gange med tre milliliter af bufferen, og hele spildevandet opsamles i et 15 ml centrifugerør. Placer nu søjlen i et nyt 15 ml centrifugerør, og tilsæt fem milliliter buffer til søjlen.Skub stemplet godt ind i søjlen for at skylle de magnetisk mærkede celler ind i røret. Centrifuger de magnetisk mærkede celler ved 300 G i fem minutter. Efter fjernelse af supernatanten suspenderes cellerne igen i 500 mikroliter PBS og overføres cellesuspensionen til et 1,5 ml mikrocentrifugerør til efterfølgende transkriptomsekventering.Pellet de indsamlede umærkede celler ved centrifugering ved 300 G i fem minutter, og genophæng cellerne i 100 mikroliter PBS i et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør. Tilsæt derefter to mikroliter af hvert mærket antistof til cellesuspensionen, og inkuber på is i 30 minutter, beskyttet mod lys. Dernæst aliquot 100 mikroliter PBMC-cellesuspension i 1,5 milliliter mikrocentrifugerør for at oprette en negativ kontrolprøve CD 3, CD 4, CD 8 og CD 19, enkeltfarvningsprøver og en CD 56- eller CD 16-farvningsprøve.Tilsæt derefter to mikroliter af det tilsvarende fluorescerende mærkede antistof til hvert rør, og inkuber på is i 30 minutter, beskyttet mod lys. Efter inkubation vaskes alle celler med PBS som tidligere vist, og der suspenderes igen i 500 mikroliter PBS. Åbn cellesorteringssystemet, og kør tænd for strømmen-programmet.Installer derefter dysen på 85 mikrometer, og åbn sorteringsstrømmen. Indstil sorteringsspændingen til 4.500 volt og frekvensen til 47. Indstil afstanden til 8 i break-off-vinduet, og tænd for sweet spot automatisk sorteringstilstand for automatisk at bestemme dråbeamplitudeværdien.Til sidst skal du justere dråbeforsinkelsen til 30,31 i sidestrømsvinduet. Brug et fremad versus sidespredningspunktplot til at tegne polygonporten P1 for at identificere den intakte lymfocytpopulation. Brug derefter et fremadrettet spredningsområde versus højdepunktplot, tegn polygonporten P2 for at identificere de enkelte celler og udeluk dubletter.Brug derefter et CD 19 FITC-område versus CD 3 pr. CPCY 5.5-områdepunktplot, tegn den rektangulære port P3 for at vælge CD 3-positive T-celler og CD 19-positive B-celler. Brug derefter et CD 4 APCCY 7-område versus CD 8 PE-områdepunktplot, tegn en rektangulær port for at vælge CD 4 og CD 8-positive T-celler. Endelig skal du bruge et sidespredningsområde versus CD 56 eller CD 16 APC-områdepunktplot til at tegne en rektangulær port for at vælge CD 56 eller CD 16-positive naturlige dræberceller.For det negative kontrolrør skal du klikke på indlæs i anskaffelsesdashboardet og vælge cytometerindstillingerne i softwaren. I inspektørvinduet skal du klikke på fanen Parametre og justere spændingerne for fremadgående spredning, sidespredning og forskellige fluorescerende farvestoffer. Når du har indlæst de enkelte farvede rør i cytometeret, skal du klikke på indlæs i anskaffelsesdashboardet og derefter klikke på fanen kompensation for at justere kompensationen som beskrevet i teksten.Hvirvel cellesuspensionen forsigtigt, inden røret lægges i cytometeret. Tilsæt 200 mikroliter FBS til fire opsamlingsflowrør, og hvirvel rørene. Placer dem i cytometeropsamlingskammeret.Saml de forskellige typer celler separat i de fire flowrør. Drej de adskilte celler ned ved 300 G i fem minutter, og tilsæt 200 mikroliter RNA-isolationsreagens til cellepaletten til transkriptomsekventering. I denne undersøgelse blev immuncellers subpopulationer fra perifert blod fra forskellige prøver sorteret effektivt ved at kombinere teknikkerne til immunmagnetiske perler og fluorescensaktiveret cellesortering.Det er vigtigt i denne protokol, at cellesorteringstrin er optimeret for at forbedre cellens levedygtighed. De sorterede immunceller viste en øget andel af CD 3, CD 8 positive T-celler hos patienter med infektiøs mononukleose sammenlignet med både de raske Epstein-Barr-virusbærere og uinficerede prøver. I modsætning hertil blev der observeret faldende andele af CD 3, CD 4-positive T-celler og CD 19-positive B-celler hos patienter med infektiøs mononukleose sammenlignet med raske EBV-bærere og EBV-uinficerede børn.Derudover blev der observeret faldende andele af CD 56 eller CD 16 positive naturlige dræberceller hos patienter med infektiøs mononukleose sammenlignet med EBV uinficerede børn. Opretholdelse af cellelevedygtighed er afgørende for efterfølgende eksperiment. At holde celler på is eller i køleskabet under sorteringsprocessen er gavnligt for cellens levedygtighed.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Optælling af Major perifert blod leukocytpopulationer for multicenter kliniske undersøgelser med en Whole Blood fænotypebestemmelse Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolering af precursor B-celle-undergrupper fra navlestrengsblod

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Påvisning af fluorescerende Nanopartikel Interaktioner med Primary Immune cellesubpopulationer ved flowcytometri

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rapid Identifikation af Gram-negative bakterier fra Blood kulturvæsken Brug MALDI-TOF-massespektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Afsløring glykogen i perifere mononukleære blodceller med Periodic Acid Schiff Farvning

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Generation af human alloantigen-specifikke T-celler fra perifert blod

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

En Semi-automatiske tilgang til Forberedelse Antibody Cocktails for immunfænotypisk Analyse af Human Perifer Blod

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolering og flowcytometrianalyse gliom-infiltrerende perifere mononukleære blodceller

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...