Name: separation of immune cell subpopulations in peripheral blood samples from children with infectious mononucleosis
Uploaded: 2022-09-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82002130), der Beijing Natural Science Foundation (7222059) und dem CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026) unterstützt.

Blutproben wurden von Patienten mit IM (n = 3), gesunden EBV-Trägern (n = 3) und EBV-nicht infizierten Kindern (n = 3) entnommen. Freiwillige wurden vom Beijing Children's Hospital der Capital Medical University rekrutiert und alle Studien wurden ethisch genehmigt. Die ethische Genehmigung wurde von der Ethikkommission des Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, erhalten (Zulassungsnummer: [2021]-E-056-Y). Auf die Einwilligung der Patienten nach Aufklärung wurde verzichtet, da in der Studie nur die ver...

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	<li>Kwok, H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+conventional+to+next+generation+sequencing+of+Epstein-Barr+virus+genomes.">From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes.</a> Viruses. 8 (3), 60 (2016).</li><li>Bu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+components+of+the+viral+fusion+apparatus+elicits+antibodies+that+neutralize+Epstein-Barr+virus+in+B+cells+and+epithelial+cells.">Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells.</a> Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).</li><li>Balfour, H. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+signature+that+correlates+with+CD8++T+cell+expansion+in+acute+EBV+infection.">A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection.</a> Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).</li><li>Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+method+of+cell+separation+from+bile+of+patients+with+cholangiocarcinoma+for+flow+cytometry.">Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry.</a> Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+(cTfh)+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry.">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. 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B., Zuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+analysis+of+CD8++T+cell+responses+to+EBV+reveals+differences+between+primary+and+persistent+infection.">Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).</li><li>Zamai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Synergy+of+NKp46+and+co-activating+signals+in+various+NK+cell+subpopulations:+paving+the+way+for+more+successful+NK-cell-based+immunotherapy.">Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), 753 (2020).</li><li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD4++and+CD8++polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection.">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).</li><li>Choi, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+by+the+Epstein-Barr+virus+LMP1+protein+induces+potent+cytotoxic+CD4(+)+and+CD8(+)+T+cell+responses.">Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).</li></ol>

Dieses Protokoll stellt eine effiziente Methode dar, um periphere Blutimmunzellsubpopulationen zu sortieren. In dieser Studie wurden venöse Blutproben von Patienten mit IM, gesunden EBV-Trägern und EBV-nicht infizierten Kindern als Forschungsziel ausgewählt. Diese Arbeit mit dem peripheren Blut von IM-Patienten konzentriert sich hauptsächlich auf die Analyse und Bestimmung der Anteile verschiedener Zelluntergruppen durch Mehrfarben-Durchflusszytometrie. Die Transkriptomsequenzierung wird hauptsächlich für den Nachw...

Das Epstein-Barr-Virus (EBV), ein γ-Herpesvirus, das auch als humanes Herpesvirus Typ 4 bekannt ist, ist in der menschlichen Bevölkerung allgegenwärtig und etabliert eine lebenslange latente Infektion bei mehr als 90% der erwachsenen Bevölkerung1. Die meisten EBV-Primärinfektionen treten im Kindes- und Jugendalter auf, wobei sich ein Teil der Patienten mit infektiöser Mononukleose (IM)2 manifestiert und eine charakteristische Immunpathologie aufweist, einschließlich einer aktivierten Immunantwort mit CD8+ T-Zellen im Blut und einer vorübergehenden Proliferation von EBV-infizierten B-Zellen im Oropharynx3. Der Verlauf der IM kann 2-6 Wochen dauern und die Mehrheit der Patienten erholt sich gut4. Einige Personen entwickeln jedoch persistierende oder wiederkehrende IM-ähnliche Symptome mit hoher Morbidität und Mortalität, die als chronisch aktive EBV-Infektion (CAEBV) eingestuft wird5. Darüber hinaus ist EBV ein wichtiges onkogenes Virus, das eng mit einer Vielzahl von Malignomen verwandt ist, darunter epithelioide und lymphatische Malignome wie Nasopharynxkarzinom, Burkitt-Lymphom, Hodgkin-Lymphom (HL) und T/NK-Zell-Lymphom6. Obwohl EBV seit über 50 Jahren untersucht wird, sind seine Pathogenese und der Mechanismus, durch den es die Proliferation von Lymphozyten induziert, nicht vollständig aufgeklärt.
Mehrere Studien haben die molekularen Signaturen für die Immunpathologie der EBV-Infektion durch Transkriptomsequenzierung untersucht. Zhong et al. analysierten das Whole-Transkriptom-Profiling von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von chinesischen Kindern mit IM oder CAEBV, um festzustellen, dass CD8+ T-Zellexpansion überwiegend in der IM-Gruppe7 gefunden wurde, was darauf hindeutet, dass CD8+ T-Zellen eine wichtige Rolle bei IM spielen könnten. In ähnlicher Weise fand eine andere Studie niedrigere Anteile an EBV-spezifischen zytotoxischen T- und CD19+ B-Zellen und höhere Prozentsätze von CD8+ T-Zellen bei Patienten mit IM, die durch eine primäre EBV-Infektion verursacht wurden, als bei Patienten mit IM, die sowohl durch EBV-Reaktivierung als auch durch andere Wirkstoffe verursacht wurden8. B-Zellen sind zuerst an IM beteiligt, da EBV-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche präsentiert werden. Al Tabaa et al. fanden heraus, dass B-Zellen während IM9 polyklonisch aktiviert und in Plasmablasten (CD19+, CD27+ und CD20− sowie CD138−-Zellen) und Plasmazellen (CD19+, CD27+ und CD20− und CD138+) differenziert wurden. Darüber hinaus fanden Zhong et al. heraus, dass die Monozytenmarker CD14 und CD64 bei CAEBV hochreguliert waren, was darauf hindeutet, dass Monozyten eine wichtige Rolle bei der zellulären Immunantwort von CAEBV durch Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität (ADCC) und hyperaktive Phagozytose spielen könnten7. Alka et al. charakterisierten das Transkriptom von MACS sortierten CD56dim CD16+ NK-Zellen von vier Patienten von IM oder HL und fanden heraus, dass NK-Zellen sowohl aus IM als auch aus HL eine herunterregulierte angeborene Immunität und Chemokin-Signalgene aufwiesen, die für die Hyporeagibilität von NK-Zellen verantwortlich sein könnten10. Darüber hinaus analysierten Greenough et al. die Genexpression von sortierten CD8+ T-Zellen von 10 PBMCs von Personen mit IM. Sie berichteten, dass ein großer Teil der CD8+ T-Zellen in IM virusspezifisch war, aktiviert, sich teilte und darauf vorbereitet war, Effektoraktivitäten auszuüben11. Sowohl T-Zell-vermittelte, EBV-spezifische Reaktionen als auch NK-Zell-vermittelte, unspezifische Reaktionen spielen eine wesentliche Rolle während der primären EBV-Infektion. Diese Studien untersuchten jedoch nur die Transkriptomergebnisse der vielfältigen Mischung von Immunzellen oder nur eine bestimmte Subpopulation von Lymphozyten, was für den umfassenden Vergleich der molekularen Eigenschaften und Funktionen verschiedener Immunzellsubpopulationen bei Kindern mit IM im gleichen Krankheitszustand nicht ausreicht.
Dieser Artikel beschreibt eine Methode, die immunmagnetische Beads und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) kombiniert, um definierte Immunzellsubpopulationen von PBMCs (Monozyten, CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen) zu isolieren und zu analysieren. Mit dieser Methode können magnetisch und fluoreszenzmarkierte Zellen mit einem Magnetabscheider und FACS gereinigt oder mittels Durchflusszytometrie analysiert werden. RNA kann aus den gereinigten Zellen für die Transkriptomsequenzierung extrahiert werden. Diese Methode wird die Charakterisierung und Genexpression verschiedener Immunzellen in den gleichen Krankheitszuständen von Personen mit IM ermöglichen, was unser Verständnis der Immunpathologie der EBV-Infektion erweitern wird.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD16</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302012</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD56 (NCAM)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>362504</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-human CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344616</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria fluorescence-activated&#160;flow&#160;cell&#160;sorter-cytometer (BD FACSAria II)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>644832</td>
			<td>Cell sort</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell ctng slides</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1450016</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (&#8805;99%, BioPremium)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST1303</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>&#160;367862&#160;</td>
			<td>EDTA anticoagulant tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD19</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302206</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;3K15</td>
			<td>Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human lymphocyte separation medium</td>
			<td>Dakewe</td>
			<td>DKW-KLSH-0100</td>
			<td>Ficoll-Paque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS&#160;Separation&#160;columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Separation&#160;columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>Magnetic bead separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344706</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344808</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>BI</td>
			<td>02-024-1ACS</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL tube for FACS flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596024</td>
			<td>Lyse cells for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td>Trypan Blue Staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of immune cell subpopulations in peripheral blood samples from children with infectious mononucleosis

Die infektiöse Mononukleose (IM) ist ein akutes Syndrom, das meist mit einer primären Infektion mit dem Epstein-Barr-Virus (EBV) einhergeht. Die wichtigsten klinischen Symptome sind unregelmäßiges Fieber, Lymphadenopathie und signifikant erhöhte Lymphozyten im peripheren Blut. Der pathogene Mechanismus von IM ist noch unklar; Es gibt keine wirksame Behandlungsmethode dafür, da hauptsächlich symptomatische Therapien zur Verfügung stehen. Die Hauptfrage in der EBV-Immunbiologie ist, warum nur eine kleine Untergruppe infizierter Personen schwere klinische Symptome zeigt und sogar EBV-assoziierte Malignome entwickelt, während die meisten Personen für das Leben mit dem Virus asymptomatisch sind.
B-Zellen sind zuerst an IM beteiligt, da EBV-Rezeptoren auf ihrer Oberfläche präsentiert werden. Natürliche Killerzellen (NK) sind zytotoxische angeborene Lymphozyten, die für die Abtötung von EBV-infizierten Zellen wichtig sind. Der Anteil der CD4+ T-Zellen nimmt ab, während der Anteil der CD8+ T-Zellen während einer akuten EBV-Infektion dramatisch zunimmt, und die Persistenz von CD8+ T-Zellen ist wichtig für die lebenslange Kontrolle von IM. Diese Immunzellen spielen eine wichtige Rolle bei IM, und ihre Funktionen müssen separat identifiziert werden. Zu diesem Zweck werden Monozyten zuerst von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von IM-Individuen mit CD14-Mikroperlen, einer Säule und einem Magnetabscheider getrennt.
Die restlichen PBMCs werden mit Peridinin-Chlorophyll-Protein (PerCP)/Cyanin 5.5 Anti-CD3, Allophycocyanin (APC)/Cyanin 7 Anti-CD4, Phycoerythrin (PE) Anti-CD8, Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) Anti-CD19, APC Anti-CD56 und APC Anti-CD16 Antikörpern gefärbt, um CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, B-Zellen und NK-Zellen mit einem Durchflusszytometer zu sortieren. Darüber hinaus wurde eine Transkriptomsequenzierung von fünf Subpopulationen durchgeführt, um deren Funktionen und pathogene Mechanismen in IM zu untersuchen.

Referenz der Gating-Strategie Die Gating-Strategie, die zur Sortierung der vier Lymphozyten-Subpopulationen verwendet wird, ist in Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, werden Lymphozyten (P1) in einem Punktdiagramm ausgewählt, das die Granulosität (SSC-A) im Vergleich zur Größe (FSC-A) zeigt. Dann werden einzelne Zellen (P2) in einem Punktdiagramm ausgewählt, das die Größe (FSC-A) im Vergleich zur Vorwärtsstreuung (FSC-H) zeigt, während Dublettenzellen ausgeschl...

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Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Wir beschreiben eine Methode, die immunmagnetische Beads und fluoreszenzaktivierte Zellsortierung kombiniert, um definierte Immunzellsubpopulationen peripherer mononukleärer Blutzellen (Monozyten, CD4+ T-Zellen, CD8+ T-Zellen, B-Zellen und natürliche Killerzellen) zu isolieren und zu analysieren. Mit dieser Methode können magnetisch und fluoreszierend markierte Zellen gereinigt und analysiert werden.

Trennung von Immunzellsubpopulationen in peripheren Blutproben von Kindern mit infektiöser Mononukleose

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...

Diese Methode wird die Charakterisierung verschiedener Immunzellen in den gleichen Krankheitszuständen von Personen mit IM ermöglichen, was unser Verständnis des Mechanismus der EBV-Infektion erweitern wird. Linlin Zhang, eine Ärztin aus unserem Labor, demonstriert das Verfahren. Nehmen Sie zunächst die PBMCs, die zuvor in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen isoliert wurden, und drehen Sie sie bei 300 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur.Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen mit 80 Mikrolitern des vorbereiteten Puffers. Als nächstes fügen Sie der Zellsuspension 20 Mikroliter CD 14-Mikrokügelchen hinzu, die durch Pipettieren gut gemischt werden, und inkubieren Sie das Röhrchen für 15 Minuten auf Eis. Dann waschen Sie die PBMCs mit einem Milliliter Puffer und zentrifugieren Sie bei 300 G für 10 Minuten bei Raumtemperatur.Verwerfen Sie den gesamten Überstand und suspendieren Sie die Zellen mit 500 Mikrolitern des Puffers. Für die magnetische Trennung legen Sie eine Säule auf den magnetischen Perlenabscheider und grundieren Sie die Säule, indem Sie sie mit drei Milliliter des Puffers waschen. Fügen Sie als Nächstes die Zellsuspension zur Spalte hinzu.Lassen Sie es passieren und sammeln Sie die unmarkierten Zellen in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Waschen Sie die Säule dreimal mit drei Milliliter Puffer und sammeln Sie das gesamte Abwasser in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Legen Sie nun die Säule in ein neues 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie der Säule fünf Milliliter Puffer hinzu.Drücken Sie den Kolben fest in die Säule, um die magnetisch markierten Zellen in das Röhrchen zu spülen. Zentrifugieren Sie die magnetisch markierten Zellen bei 300 G fünf Minuten lang. Nach dem Entfernen des Überstands suspendieren Sie die Zellen in 500 Mikrolitern PBS und übertragen Sie die Zellsuspension in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zur anschließenden Transkriptomsequenzierung.Pelletieren Sie die gesammelten unmarkierten Zellen durch Zentrifugieren bei 300 G für fünf Minuten und suspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern PBS in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Dann fügen Sie zwei Mikroliter jedes markierten Antikörpers zur Zellsuspension hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang auf Eis, geschützt vor Licht. Als nächstes aliquot 100 Mikroliter der PBMC-Zellsuspension in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen, um eine Negativkontrollprobe CD 3, CD 4, CD 8 und CD 19, einzelne Färbeproben und eine CD 56- oder CD 16-Färbeprobe einzurichten.Dann fügen Sie zwei Mikroliter des entsprechenden fluoreszierend markierten Antikörpers zu jedem Röhrchen hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang auf Eis, geschützt vor Licht. Nach der Inkubation alle Zellen wie zuvor demonstriert mit PBS waschen und in 500 Mikrolitern PBS resuspendieren. Öffnen Sie das Zellsortiersystem, und führen Sie das Einschaltprogramm aus.Installieren Sie dann die 85-Mikrometer-Düse und öffnen Sie den Sortierstrom. Stellen Sie die Sortierspannung auf 4.500 Volt und die Frequenz auf 47 ein. Stellen Sie den Spalt im Abbruchfenster auf 8 ein und aktivieren Sie den automatischen Sortiermodus für Sweet Spots, um den Tröpfchenamplitudenwert automatisch zu bestimmen.Stellen Sie abschließend die Tröpfchenverzögerung im Seitenstromfenster auf 30,31 ein. Zeichnen Sie das Polygongatter P1 mithilfe eines Vorwärts- und Seitenstreupunktdiagramms, um die intakte Lymphozytenpopulation zu identifizieren. Zeichnen Sie anschließend mithilfe eines Punktdiagramms zwischen Vorwärtsstreufläche und Höhe das Polygongatter P2, um die einzelnen Zellen zu identifizieren und Dubletten auszuschließen.Zeichnen Sie dann unter Verwendung eines CD 19 FITC-Bereichs im Vergleich zu CD 3 pro CPCY 5.5-Flächenpunktdiagramm das rechteckige Gate P3, um CD 3-positive T-Zellen und CD 19-positive B-Zellen auszuwählen. Zeichnen Sie anschließend mithilfe eines CD 4 APCCY 7-Flächenpunktdiagramms im Vergleich zu CD 8 PE-Bereich ein rechteckiges Tor, um CD 4 und CD 8 positive T-Zellen auszuwählen. Zeichnen Sie schließlich unter Verwendung eines Seitenstreubereichs im Vergleich zu CD 56- oder CD 16-APC-Flächenpunktdiagramm ein rechteckiges Tor, um CD 56- oder CD 16-positive natürliche Killerzellen auszuwählen.Klicken Sie für das Negativkontrollröhrchen im Erfassungs-Dashboard auf Laden und wählen Sie die Zytometereinstellungen in der Software aus. Klicken Sie im Informationsfenster auf die Registerkarte "Parameter" und passen Sie die Spannungen der Vorwärtsstreuung, Seitenstreuung und verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe an. Nachdem Sie die einzelnen gefärbten Röhrchen in das Zytometer geladen haben, klicken Sie im Erfassungs-Dashboard auf Laden und dann auf die Registerkarte Kompensation, um die Kompensation anzupassen, wie im Text beschrieben.Wirbeln Sie die Zellsuspension sanft an, bevor Sie das Röhrchen in das Zytometer laden. Fügen Sie 200 Mikroliter FBS zu vier Sammelrohren hinzu und wirbeln Sie die Rohre durch. Legen Sie sie in die Zytometer-Sammelkammer.Sammeln Sie die verschiedenen Zelltypen getrennt in den vier Durchflussrohren. Drehen Sie die getrennten Zellen bei 300 G für fünf Minuten herunter und fügen Sie der Zellpalette 200 Mikroliter RNA-Isolationsreagenz für die Transkriptomsequenzierung hinzu. In der vorliegenden Studie wurden Immunzellensubpopulationen aus peripherem Blut verschiedener Proben effizient aussortiert, indem die Techniken der immunmagnetischen Perlen und der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung kombiniert wurden.Wichtig in diesem Protokoll ist, dass der Zellsortierschritt optimiert wurde, um die Zelllebensfähigkeit zu verbessern. Die sortierten Immunzellen zeigten einen erhöhten Anteil an CD 3, CD 8 positiven T-Zellen bei Patienten mit infektiöser Mononukleose im Vergleich zu den gesunden Epstein-Barr-Virusträgern und nicht infizierten Proben. Im Gegensatz dazu wurden bei Patienten mit infektiöser Mononukleose im Vergleich zu gesunden EBV-Trägern und nicht infizierten EBV-infizierten Kindern verringerte Anteile von CD 3-, CD-4-positiven T-Zellen und CD-19-positiven B-Zellen beobachtet.Darüber hinaus wurden bei Patienten mit infektiöser Mononukleose im Vergleich zu nicht infizierten EBV-Kindern verringerte Anteile an CD 56- oder CD 16-positiven natürlichen Killerzellen beobachtet. Die Aufrechterhaltung der Zelllebensfähigkeit ist für nachfolgende Experimente von entscheidender Bedeutung. Das Aufbewahren von Zellen auf Eis oder im Kühlschrank während des Sortierprozesses ist vorteilhaft für die Zelllebensfähigkeit.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Aufzählung der wichtigsten peripheren Blut Leukozyten Populationen für Multicenter Clinical Trials mit einem Vollblut Phenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolierung von Precursor B-Zell-Subsets aus Nabelschnurblut

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Detektion von fluoreszierenden Nanopartikel Wechselwirkungen mit primären Immun-Zell-Subpopulationen durch Durchflusszytometrie

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Schnelle Identifizierung von Gram-negativen Bakterien aus Blutkulturbrühe unter Verwendung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Erkennen von Glykogen in peripheren mononukleären Blutzellen mit Perjodsäure-Schiff-Färbung

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Generation of Human Alloantigen-spezifischen T-Zellen aus peripherem Blut

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Ein Semi-automatisierten Ansatz zur Vorbereitung Antikörper-Cocktails für immunphänotypische Analyse von menschlichem peripherem Blut

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolierung und Analyse über Durchflusszytometrie von Gliom-Infiltration peripheren mononukleären Blutzellen

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...