Name: separation of immune cell subpopulations in peripheral blood samples from children with infectious mononucleosis
Uploaded: 2022-09-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82002130), קרן בייג'ינג למדעי הטבע (7222059) וקרן החדשנות CAMS למדעי הרפואה (2019-I2M-5-026).

דגימות דם התקבלו מחולים עם IM (n = 3), נשאים בריאים של EBV (n = 3) וילדים לא נגועים ב- EBV (n = 3). מתנדבים גויסו מבית החולים לילדים בבייג'ינג, אוניברסיטת קפיטל מדיקל, וכל המחקרים אושרו אתית. אישור אתי הושג על ידי ועדת האתיקה של בית החולים לילדים בבייג'ינג, האוניברסיטה הרפואית קפיטל (מספר אישור: [2021]-E-056-Y). ה?...

<ol>
	<li>Kwok, H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+conventional+to+next+generation+sequencing+of+Epstein-Barr+virus+genomes.">From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes.</a> Viruses. 8 (3), 60 (2016).</li><li>Bu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+components+of+the+viral+fusion+apparatus+elicits+antibodies+that+neutralize+Epstein-Barr+virus+in+B+cells+and+epithelial+cells.">Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells.</a> Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).</li><li>Balfour, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral,+virology,+and+immunologic+factors+associated+with+acquisition+and+severity+of+primary+Epstein-Barr+virus+infection+in+university+students.">Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students.</a> Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).</li><li>Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+mononucleosis.">Infectious mononucleosis.</a> New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).</li><li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+research+on+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection+in+Japan.">Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan.</a> Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).</li><li>Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+infection+and+nasopharyngeal+carcinoma.">Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).</li><li>Zhong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+transcriptome+profiling+reveals+major+cell+types+in+the+cellular+immune+response+against+acute+and+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection.">Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).</li><li>Fedyanina, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+and+clinical+significance+of+atypical+mononuclear+cells+in+infectious+mononucleosis+caused+by+the+Epstein-Barr+virus+in+children.">The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children.</a> Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).</li><li>Al Tabaa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+polyclonal+activation+and+Epstein-Barr+viral+abortive+lytic+cycle+are+two+key+features+in+acute+infectious+mononucleosis.">B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis.</a> Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).</li><li>M, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+cell+transcriptome+during+primary+EBV+infection+and+EBV+associated+Hodgkin+Lymphoma+in+children-A+preliminary+observation.">Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation.</a> Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).</li><li>Greenough, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+signature+that+correlates+with+CD8++T+cell+expansion+in+acute+EBV+infection.">A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection.</a> Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).</li><li>Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+method+of+cell+separation+from+bile+of+patients+with+cholangiocarcinoma+for+flow+cytometry.">Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry.</a> Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+(cTfh)+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry.">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).</li><li>Djaoud, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+alternate+strategies+for+innate+immunity+to+Epstein-Barr+virus:+One+using+NK+cells+and+the+other+NK+cells+and+gammadelta+T+cells.">Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).</li><li>Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+in+post-transplant+lymphoproliferative+disorders.">Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders.</a> Cancers. 13 (8), 1836 (2021).</li><li>Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+analysis+of+CD8++T+cell+responses+to+EBV+reveals+differences+between+primary+and+persistent+infection.">Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).</li><li>Zamai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Synergy+of+NKp46+and+co-activating+signals+in+various+NK+cell+subpopulations:+paving+the+way+for+more+successful+NK-cell-based+immunotherapy.">Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), 753 (2020).</li><li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD4++and+CD8++polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection.">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).</li><li>Choi, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+by+the+Epstein-Barr+virus+LMP1+protein+induces+potent+cytotoxic+CD4(+)+and+CD8(+)+T+cell+responses.">Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).</li></ol>

פרוטוקול זה מייצג דרך יעילה למיין תת-אוכלוסיות של תאי חיסון היקפיים בדם. במחקר זה, דגימות דם ורידי מחולים עם IM, נשאים בריאים של EBV וילדים לא נגועים ב- EBV נבחרו כמטרת המחקר. עבודה זו באמצעות הדם ההיקפי של חולים של IM מתמקדת בעיקר בניתוח וקביעת הפרופורציות של תת-קבוצות תאים שונות באמצעות ציטומטר...

נגיף אפשטיין-בר (EBV), נגיף γ-הרפס הידוע גם בשם נגיף הרפס אנושי מסוג 4, נמצא בכל מקום באוכלוסייה האנושית ויוצר זיהום סמוי לכל החיים ביותר מ-90% מהאוכלוסייה הבוגרת1. רוב ההדבקות הראשוניות ב-EBV מתרחשות במהלך הילדות וההתבגרות, כאשר חלק קטן מהחולים מתבטאים במונונוקלאוזיס זיהומי (IM)2, ומראים אימונופתולוגיה אופיינית, כולל תגובה חיסונית פעילה עם תאי CD8+ T בדם והתפשטות חולפת של תאי B נגועים ב-EBV בלוע3. מהלך ה- IM עשוי להימשך 2-6 שבועות ורוב החולים מחלימים היטב4. עם זאת, אנשים מסוימים מפתחים תסמינים מתמשכים או חוזרים דמויי IM עם תחלואה ותמותה גבוהות, המסווגות כזיהום EBV פעיל כרוני (CAEBV)5. בנוסף, EBV הוא נגיף אונקוגני חשוב, הקשור קשר הדוק למגוון ממאירויות, כולל ממאירות אפיתליואידית ולימפואידית כגון קרצינומה של הלוע, לימפומה של בורקיט, לימפומה של הודג'קין (HL) ולימפומה של תאי T/NK6. למרות ש- EBV נחקר במשך למעלה מ -50 שנה, הפתוגנזה שלו והמנגנון שבאמצעותו הוא גורם להתפשטות הלימפוציטים לא הובהרו במלואם.
מספר מחקרים חקרו את החתימות המולקולריות לאימונופתולוגיה של זיהום EBV על ידי ריצוף תעתיק. Zhong et al. ניתחו פרופילים של תעתיק שלם של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) מילדים סינים עם IM או CAEBV כדי למצוא שהרחבת תאי T CD8+ נמצאה בעיקר בקבוצת IM7, מה שמרמז על כך שתאי CD8+ T עשויים למלא תפקיד מרכזי ב-IM. באופן דומה, מחקר אחר מצא שיעורים נמוכים יותר של תאי T ו-CD19+ B ציטוטוקסיים ספציפיים ל-EBV ואחוזים גבוהים יותר של תאי CD8+ T בחולים עם IM שנגרם על ידי זיהום EBV ראשוני מאשר בחולים עם IM שנגרם הן על ידי הפעלה מחדש של EBV והן על ידי סוכנים אחרים8. תאי B מעורבים לראשונה ב-IM מכיוון שקולטני EBV מוצגים על פני השטח שלהם. Al Tabaa et al. מצאו שתאי B היו אינטופלסמבלסטים פעילים ומתמיינים באופן פוליקלונלי (CD19+, CD27+ ו-CD20−, ו-CD138− תאים) ותאי פלזמה (CD19+, CD27+ ו-CD20− ו-CD138+) במהלך IM9. יתר על כן, Zhong et al. מצאו כי סמני מונוציטים CD14 ו- CD64 היו מווסתים ב- CAEBV, מה שמרמז על כך שמונוציטים עשויים למלא תפקיד חשוב בתגובה החיסונית התאית של CAEBV באמצעות ציטוטוקסיות תאית תלוית נוגדנים (ADCC) ופאגוציטוזה היפראקטיבית7. Alka et al. אפיינו את התעתיק של MACS מיון CD56 dimCD16+ NK תאים מארבעה חולים של IM או HL ומצאו כי תאי NK הן IM והן HL היו בעלי חסינות מולדת מווסתת וגנים לאיתות כימוקין, אשר יכול להיות אחראי על תגובתיות נמוכה של תאי NK10. בנוסף, Greenough et al. ניתחו ביטוי גנים של תאי CD8+ T ממוינים מ-10 PBMCs של אנשים עם IM. הם דיווחו כי חלק גדול מתאי ה-CD8+ T בהודעות מיידיות היו ספציפיים לנגיף, הופעלו, התחלקו והתכוננו להפעיל פעילויות השפעה11. הן תגובות בתיווך תאי T, ספציפיות ל-EBV, והן תגובות לא ספציפיות בתיווך תאי NK, ממלאות תפקידים חיוניים במהלך זיהום EBV ראשוני. עם זאת, מחקרים אלה חקרו רק את תוצאות השעתוק של תערובת מגוונת של תאי חיסון או רק תת-אוכלוסייה מסוימת של לימפוציטים, שאינה מספיקה להשוואה מקיפה של המאפיינים המולקולריים והתפקודים של תת-אוכלוסיות שונות של תאי חיסון אצל ילדים עם IM באותו מצב מחלה.
מאמר זה מתאר שיטה המשלבת חרוזים אימונומגנטיים ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה (FACS) כדי לבודד ולנתח תת-אוכלוסיות מוגדרות של תאי חיסון של PBMCs (מונוציטים, תאי CD4+ T, תאי T CD8+, תאי B ותאי NK). באמצעות שיטה זו, ניתן לטהר תאים מגנטיים ומסומנים פלואורסצנטיים באמצעות מפריד מגנטי ו- FACS או לנתח אותם על ידי ציטומטריה של זרימה. ניתן להפיק RNA מהתאים המטוהרים לצורך ריצוף תעתיק. שיטה זו תאפשר אפיון וביטוי גנים של תאי חיסון שונים באותם מצבי מחלה של אנשים עם IM, מה שירחיב את הבנתנו לגבי האימונופתולוגיה של זיהום EBV.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD16</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302012</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD56 (NCAM)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>362504</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-human CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344616</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria fluorescence-activated&#160;flow&#160;cell&#160;sorter-cytometer (BD FACSAria II)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>644832</td>
			<td>Cell sort</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell ctng slides</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1450016</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (&#8805;99%, BioPremium)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST1303</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>&#160;367862&#160;</td>
			<td>EDTA anticoagulant tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD19</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302206</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;3K15</td>
			<td>Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human lymphocyte separation medium</td>
			<td>Dakewe</td>
			<td>DKW-KLSH-0100</td>
			<td>Ficoll-Paque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS&#160;Separation&#160;columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Separation&#160;columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>Magnetic bead separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344706</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344808</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>BI</td>
			<td>02-024-1ACS</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL tube for FACS flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596024</td>
			<td>Lyse cells for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td>Trypan Blue Staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of immune cell subpopulations in peripheral blood samples from children with infectious mononucleosis

מונונוקלאוזיס זיהומית (IM) היא תסמונת חריפה הקשורה בעיקר לזיהום ראשוני בנגיף אפשטיין-בר (EBV). הסימפטומים הקליניים העיקריים כוללים חום לא סדיר, לימפדנופתיה, ועלייה משמעותית בלימפוציטים בדם היקפי. המנגנון הפתוגני של IM עדיין לא ברור; אין שיטה טיפולית יעילה עבורו, כאשר קיימים בעיקר טיפולים סימפטומטיים. השאלה העיקרית ב- EBV אימונוביולוגיה היא מדוע רק תת-קבוצה קטנה של אנשים נגועים מראה תסמינים קליניים חמורים ואף לפתח ממאירויות הקשורות ל- EBV, בעוד שרוב האנשים הם אסימפטומטיים לכל החיים עם הנגיף.
תאי B מעורבים לראשונה ב-IM מכיוון שקולטני EBV מוצגים על פני השטח שלהם. תאי הרג טבעי (NK) הם לימפוציטים מולדים ציטוטוקסיים החשובים להריגת תאים נגועים ב-EBV. חלקם של תאי CD4+ T פוחת בעוד זה של תאי CD8+ T מתרחב באופן דרמטי במהלך זיהום EBV חריף, וההתמדה של תאי CD8+ T חשובה לשליטה לכל החיים ב- IM. תאי מערכת החיסון האלה ממלאים תפקידים חשובים בהודעות מיידיות, ויש לזהות את תפקודם בנפרד. לשם כך, מונוציטים מופרדים תחילה מתאים חד-גרעיניים של דם היקפי (PBMCs) של אנשים עם הודעות מיידיות באמצעות מיקרובי CD14, עמודה ומפריד מגנטי.
יתר ה-PBMCs מוכתמים בחלבון פרידינין-כלורופיל (PerCP)/ציאנין 5.5 אנטי-CD3, אלופיקוציאנין (APC)/ציאנין 7 אנטי-CD4, פיקואריתרין (PE) אנטי-CD8, פלואורסצין איזותיוציאנט (FITC) אנטי-CD19, APC אנטי-CD56 ונוגדנים APC נגד CD16 למיון תאי CD4+ T, תאי T CD8+, תאי B ותאי NK באמצעות ציטומטר זרימה. יתר על כן, ריצוף תעתיק של חמש תת-אוכלוסיות בוצע כדי לחקור את תפקידיהן ואת המנגנונים הפתוגניים שלהן ב- IM.

התייחסות לאסטרטגיית הגטינג אסטרטגיית המיון המשמשת למיון ארבע תת-אוכלוסיות הלימפוציטים מוצגת באיור 1. בקצרה, לימפוציטים נבחרים (P1) על תרשים נקודה המציג את הגרנולוסיות (SSC-A) לעומת הגודל (FSC-A). לאחר מכן, תאים בודדים נבחרים (P2) בהתוויית נקודה המציגה את הגודל (FSC-A) לעומת ?...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis at JoVE.com

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

אנו מתארים שיטה המשלבת חרוזים אימונומגנטיים ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנציה כדי לבודד ולנתח תת-אוכלוסיות מוגדרות של תאי חיסון של תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (מונוציטים, תאי CD4+ T, תאי T CD8+, תאי B ותאי הרג טבעיים). באמצעות שיטה זו, ניתן לטהר ולנתח תאים מגנטיים ובעלי תווית פלואורסצנטית.

הפרדת תת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון בדגימות דם היקפיות מילדים עם מונונוקלאוזיס זיהומית

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...

שיטה זו תאפשר אפיון של תאי חיסון שונים באותם מצבי מחלה של אנשים עם IM, מה שירחיב את הבנתנו לגבי מנגנון ההדבקה ב-EBV. מי שידגים את ההליך יהיה לינלין ז'אנג, רופא מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, קח את PBMCs שבודדו בעבר בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, וסובב אותו ב 300 G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.להשליך את supernatant, ולהשעות מחדש את התאים עם 80 microliters של חיץ מוכן. לאחר מכן, להוסיף 20 microliters של CD 14 microads לתרחיף התא, מעורבב היטב על ידי pipetting, ואת דגירה את הצינור במשך 15 דקות על קרח. לאחר מכן לשטוף את PBMCs באמצעות מיליליטר אחד של חיץ צנטריפוגה ב 300 גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.השליכו את כל הסופרנטנט, ושעו מחדש את התאים עם 500 מיקרוליטרים של המאגר. להפרדה מגנטית, הניחו עמודה על מפריד החרוזים המגנטי, והגדילו את העמודה על ידי שטיפתה בשלושה מיליליטר של המאגר. לאחר מכן, הוסף את השעיית התא לעמודה.אפשרו לו לעבור, ואספו את התאים ללא תווית לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. לשטוף את העמוד שלוש פעמים עם שלושה מיליליטר של המאגר, ולאסוף את כל השפכים בצינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. כעת, מקם את העמודה בצינור צנטריפוגה חדש של 15 מיליליטר, והוסף חמישה מיליליטר של חיץ לעמודה.דחפו את הבוכנה בחוזקה לתוך העמודה כדי לשטוף את התאים המסומנים מגנטית לתוך הצינור. צנטריפוגה של התאים המסומנים מגנטית ב-300 גרם למשך חמש דקות. לאחר הסרת הסופר-נטנט, יש להשעות מחדש את התאים ב-500 מיקרוליטרים של PBS, ולהעביר את השעיית התא לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר לריצוף תעתיק עוקב.גלולה את התאים שנאספו ללא תווית על ידי צנטריפוגה ב 300 G במשך חמש דקות, ולהשעות מחדש את התאים ב 100 מיקרוליטר של PBS בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר. לאחר מכן, הוסיפו שני מיקרוליטרים של כל נוגדן מסומן לתרחיף התאים, ודגרו על קרח במשך 30 דקות, מוגנים מפני אור. לאחר מכן, aliquot 100 microliters של מתלה תא PBMC בצינורות microcentrifuge 1.5 מיליליטר כדי להגדיר מדגם בקרה שלילית CD 3, CD 4, CD 8, ו- CD 19, דגימות צביעה בודדות, ותקליטור 56, או CD 16 מכתים דגימה.לאחר מכן מוסיפים שני מיקרוליטרים של הנוגדן הפלואורסצנטי המתאים לכל צינור, ודוגרים על קרח במשך 30 דקות, מוגנים מפני אור. לאחר הדגירה, יש לשטוף את כל התאים עם PBS כפי שהוכח קודם לכן, ולהשהות מחדש 500 מיקרוליטרים של PBS. פתח את מערכת מיון התאים והפעל את תוכנית ההפעלה.לאחר מכן, התקן את הזרבובית בגודל 85 מיקרומטר ופתח את זרם המיון. הגדר את מתח המיון ל -4, 500 וולט, ואת התדר ל -47. הגדר את הפער ל- 8 בחלון הפריצה, והפעל את מצב המיון האוטומטי של הנקודה המתוקה כדי לקבוע את ערך משרעת הטיפות באופן אוטומטי.לבסוף, התאם את השהיית הטיפות ל-30.31 בחלון הזרם הצדדי. באמצעות תרשים נקודת פיזור קדימה לעומת צד, ציירו את שער המצולע P1 כדי לזהות את אוכלוסיית הלימפוציטים השלמה. לאחר מכן, באמצעות אזור פיזור קדימה לעומת תרשים נקודת גובה, ציירו את שער המצולע P2 כדי לזהות את התאים הבודדים, ולא לכלול כפילויות.לאחר מכן, באמצעות שטח CD 19 FITC לעומת CD 3 לכל תרשים נקודת שטח CPCY 5.5, צייר את השער המלבני P3 כדי לבחור CD 3 תאי T חיוביים, ו- CD 19 תאי B חיוביים. לאחר מכן, באמצעות שטח CD 4 APCCY 7 לעומת CD 8 PE שטח נקודה מתווה נקודה, צייר שער מלבני כדי לבחור CD 4, ותקליטור 8 חיובי T-תאים. לבסוף, באמצעות אזור פיזור צדדי לעומת CD 56 או CD 16 APC שטח נקודה מתווה נקודה, צייר שער מלבני כדי לבחור CD 56, או CD 16 חיובי תאי הרג טבעי.עבור צינור הבקרה השלילית, לחץ על טען בלוח המחוונים של הרכישה ובחר את הגדרות הציטומטר בתוכנה. בחלון המפקח, לחץ על הכרטיסייה פרמטרים, והתאם את המתחים של פיזור קדימה, פיזור צדדי וצבעים פלואורסצנטיים שונים. לאחר טעינת הצינורות המוכתמים הבודדים לתוך הציטומטר, לחץ על טען בלוח המחוונים של הרכישה ולאחר מכן לחץ על לשונית הפיצוי כדי להתאים את הפיצוי, כמתואר בטקסט.מערבבים את ההשעיה התא בעדינות, לפני טעינת הצינור לתוך הציטומטר. הוסף 200 מיקרוליטרים של FBS לארבעה צינורות זרימת איסוף, ומערבל את הצינורות. מניחים אותם בתא איסוף הציטומטר.אסוף את סוגי התאים השונים בנפרד בארבעת צינורות הזרימה. סובבו את התאים המופרדים ב-300 G למשך חמש דקות, והוסיפו 200 מיקרוליטרים של מגיב לבידוד RNA לפלטת התאים לצורך ריצוף שעתוק. במחקר הנוכחי, תת-אוכלוסיות של תאי חיסון מדם היקפי של דגימות שונות מוינו ביעילות על ידי שילוב טכניקות של חרוזים אימונומגנטיים, ומיון תאים מופעל פלואורסצנטי.חשוב לציין בפרוטוקול זה, שלב מיון התאים עבר אופטימיזציה כדי לשפר את כדאיות התאים. תאי מערכת החיסון הממוינים הראו שיעור מוגבר של תאי T חיוביים מסוג CD 3, CD 8 בחולים עם מונונוקלאוזיס זיהומיות בהשוואה הן לנשאי נגיף אפשטיין-בר הבריאים והן לדגימות לא נגועות. לעומת זאת, ירידה בשיעורים של תאי CD 3, תאי T חיוביים ל-CD 4 ותאי B חיוביים ל-CD 19 נצפתה בחולים עם מונונוקלאוזיס זיהומי בהשוואה לנשאי EBV בריאים, וילדים לא נגועים ב-EBV.בנוסף, ירידה בשיעורים של CD 56, או CD 16 חיובי תאי הרג טבעיים נצפתה בחולים עם מונונוקלאוזיס זיהומיות בהשוואה לילדים לא נגועים EBV. שמירה על כדאיות התאים חיונית לניסויים הבאים. שמירה על תאים על קרח, או במקרר במהלך תהליך המיון מועילה לכדאיות התאים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

ספירה של אוכלוסיות גדולות דם היקפיות יקוציט לניסויי multicenter קליניים באמצעות Assay phenotyping דם מלא

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

בידוד של קבוצות משנה מבשר B-cell מדם טבורים

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

איתור של פלורסנט אינטראקציות Nanoparticle עם אוכלוסיות ראשוניות של תא חיסון על ידי זרימת cytometry

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

זיהוי מהיר של חיידקים גראם שליליים מהדם תרבות מרק שימוש MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

גילוי גליקוגן בתאי הדם היקפי mononuclear עם תקופתי חומצה שיף מכתים

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

דור של תאי T האנושי Alloantigen ספציפיים מהדם היקפי

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

גישה אוטומטית-למחצה הכנת קוקטיילי נוגדן עבור ניתוח Immunophenotypic של אדם דם היקפי

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

בידוד וניתוח תזרים cytometric של תאי הדם ההיקפיים mononuclear הסתננות-Glioma

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...