Name: separation of immune cell subpopulations in peripheral blood samples from children with infectious mononucleosis
Uploaded: 2022-09-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (82002130), Beijing Natural Science Foundation (7222059) og CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).

Det ble tatt blodprøver av pasienter med i.m. (n = 3), friske EBV-bærere (n = 3) og EBV-uinfiserte barn (n = 3). Frivillige ble rekruttert fra Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, og alle studier ble etisk godkjent. Etisk godkjenning ble innhentet av den etiske komiteen for Beijing Children's Hospital, Capital Medical University (godkjenningsnummer: [2021]-E-056-Y). Informert samtykke fra pasienter ble frafalt da studien bare brukte de resterende prøvene til klinisk testing. Alle data ble fullstend...

<ol>
	<li>Kwok, H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+conventional+to+next+generation+sequencing+of+Epstein-Barr+virus+genomes.">From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes.</a> Viruses. 8 (3), 60 (2016).</li><li>Bu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+components+of+the+viral+fusion+apparatus+elicits+antibodies+that+neutralize+Epstein-Barr+virus+in+B+cells+and+epithelial+cells.">Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells.</a> Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).</li><li>Balfour, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral,+virology,+and+immunologic+factors+associated+with+acquisition+and+severity+of+primary+Epstein-Barr+virus+infection+in+university+students.">Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students.</a> Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).</li><li>Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+mononucleosis.">Infectious mononucleosis.</a> New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).</li><li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+research+on+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection+in+Japan.">Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan.</a> Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).</li><li>Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+infection+and+nasopharyngeal+carcinoma.">Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).</li><li>Zhong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+transcriptome+profiling+reveals+major+cell+types+in+the+cellular+immune+response+against+acute+and+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection.">Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).</li><li>Fedyanina, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+and+clinical+significance+of+atypical+mononuclear+cells+in+infectious+mononucleosis+caused+by+the+Epstein-Barr+virus+in+children.">The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children.</a> Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).</li><li>Al Tabaa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+polyclonal+activation+and+Epstein-Barr+viral+abortive+lytic+cycle+are+two+key+features+in+acute+infectious+mononucleosis.">B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis.</a> Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).</li><li>M, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+cell+transcriptome+during+primary+EBV+infection+and+EBV+associated+Hodgkin+Lymphoma+in+children-A+preliminary+observation.">Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation.</a> Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).</li><li>Greenough, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+signature+that+correlates+with+CD8++T+cell+expansion+in+acute+EBV+infection.">A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection.</a> Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).</li><li>Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+method+of+cell+separation+from+bile+of+patients+with+cholangiocarcinoma+for+flow+cytometry.">Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry.</a> Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+(cTfh)+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry.">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).</li><li>Djaoud, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+alternate+strategies+for+innate+immunity+to+Epstein-Barr+virus:+One+using+NK+cells+and+the+other+NK+cells+and+gammadelta+T+cells.">Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).</li><li>Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+in+post-transplant+lymphoproliferative+disorders.">Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders.</a> Cancers. 13 (8), 1836 (2021).</li><li>Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+analysis+of+CD8++T+cell+responses+to+EBV+reveals+differences+between+primary+and+persistent+infection.">Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).</li><li>Zamai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Synergy+of+NKp46+and+co-activating+signals+in+various+NK+cell+subpopulations:+paving+the+way+for+more+successful+NK-cell-based+immunotherapy.">Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), 753 (2020).</li><li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD4++and+CD8++polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection.">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).</li><li>Choi, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+by+the+Epstein-Barr+virus+LMP1+protein+induces+potent+cytotoxic+CD4(+)+and+CD8(+)+T+cell+responses.">Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).</li></ol>

Denne protokollen representerer en effektiv måte å sortere underpopulasjoner av perifere immunceller på. I denne studien ble venøse blodprøver fra pasienter med IM, friske EBV-bærere og EBV-uinfiserte barn valgt som forskningsmål. Dette arbeidet ved bruk av perifert blod hos pasienter med IM fokuserer hovedsakelig på å analysere og bestemme proporsjonene av forskjellige celleundergrupper gjennom flerfarget flowcytometri. Transkriptomsekvensering brukes hovedsakelig til påvisning og analyse av en viss underpopul...

Epstein-Barr-virus (EBV), et γ-herpesvirus også kjent som humant herpesvirus type 4, er allestedsnærværende i den menneskelige befolkningen og etablerer livslang latent infeksjon hos mer enn 90% av den voksne befolkningen1. De fleste EBV primær infeksjon oppstår i barndommen og ungdomsårene, med en brøkdel av pasientene som manifesterer seg med infeksiøs mononukleose (IM) 2, som viser karakteristisk immunpatologi, inkludert en aktivert immunrespons med CD8 + T-celler i blod og en forbigående spredning av EBV-infiserte B-celler i oropharynx3. IM-forløpet kan vare i 2–6 uker, og de fleste pasientene blir friske4. Noen individer utvikler imidlertid vedvarende eller tilbakevendende IM-lignende symptomer med høy morbiditet og dødelighet, som er klassifisert som kronisk aktiv EBV-infeksjon (CAEBV)5. I tillegg er EBV et viktig onkogent virus, som er nært beslektet med en rekke maligniteter, inkludert epiteloid og lymfoide maligniteter som nasopharyngeal karsinom, Burkitts lymfom, Hodgkins lymfom (HL) og T/NK-cellelymfom6. Selv om EBV har blitt studert i over 50 år, har patogenesen og mekanismen som induserer spredning av lymfocytter ikke blitt fullstendig belyst.
Flere studier har undersøkt molekylære signaturer for immunpatologi av EBV-infeksjon ved transkriptomsekvensering. Zhong og medarbeidere analyserte hel-transkriptomprofilering av mononukleære celler i perifert blod (PBMC) fra kinesiske barn med IM eller CAEBV for å finne at CD8+ T-celleutvidelse hovedsakelig ble funnet i IM-gruppe7, noe som tyder på at CD8+ T-celler kan spille en viktig rolle i IM. Tilsvarende fant en annen studie lavere andel EBV-spesifikke cytotoksiske T- og CD19+ B-celler og høyere prosentandel CD8+ T-celler hos pasienter med IM forårsaket av primær EBV-infeksjon enn hos pasienter med IM forårsaket både av EBV-reaktivering og andre midler8. B-celler er først involvert i IM fordi EBV-reseptorer presenteres på overflaten. Al Tabaa og medarbeidere fant at B-celler var polyklonalt aktiverte og differensierte intoplasmablaster (CD19+, CD27+ og CD20−, og CD138−-celler) og plasmaceller (CD19+, CD27+ og CD20−, og CD138+) under IM 9. Videre fant Zhong og medarbeidere at monocyttmarkørene CD14 og CD64 ble oppregulert i CAEBV, noe som tyder på at monocytter kan spille en viktig rolle i den cellulære immunresponsen til CAEBV gjennom antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC) og hyperaktiv fagocytose7. Alka og medarbeidere karakteriserte transkriptomet til MACS sorterte CD56dim CD16+ NK-celler fra fire pasienter med IM eller HL og fant at NK-celler fra både IM og HL hadde nedregulert medfødt immunitet og kjemokinsignaleringsgener, som kunne være ansvarlig for hyporesponsiviteten til NK-celler10. I tillegg analyserte Greenough og medarbeidere genuttrykk av sorterte CD8+ T-celler fra 10 PBMCs av individer med IM. De rapporterte at en stor andel av CD8 + T-celler i IM var virusspesifikke, aktiverte, delte og primet for å utøve effektoraktiviteter11. Både T-cellemedierte, EBV-spesifikke responser og NK-cellemedierte, uspesifikke responser spiller viktige roller under primær EBV-infeksjon. Imidlertid undersøkte disse studiene bare transkriptomresultatene av den mangfoldige blandingen av immunceller eller bare en viss underpopulasjon av lymfocytter, noe som ikke er tilstrekkelig for den omfattende sammenligningen av molekylære egenskaper og funksjoner av forskjellige immuncelleunderpopulasjoner hos barn med IM ved samme sykdomstilstand.
Dette papiret beskriver en metode som kombinerer immunomagnetiske perler og fluorescensaktivert cellesortering (FACS) for å isolere og analysere definerte immuncelleunderpopulasjoner av PBMCs (monocytter, CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler og NK-celler). Ved hjelp av denne metoden kan magnetiske og fluorescerende merkede celler renses ved hjelp av en magnetisk separator og FACS eller analyseres ved strømningscytometri. RNA kan ekstraheres fra de rensede cellene for transkriptomsekvensering. Denne metoden vil muliggjøre karakterisering og genuttrykk av forskjellige immunceller i samme sykdomstilstander hos personer med IM, noe som vil utvide vår forståelse av immunpatologien til EBV-infeksjon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD16</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302012</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD56 (NCAM)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>362504</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-human CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344616</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria fluorescence-activated&#160;flow&#160;cell&#160;sorter-cytometer (BD FACSAria II)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>644832</td>
			<td>Cell sort</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell ctng slides</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1450016</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (&#8805;99%, BioPremium)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST1303</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>&#160;367862&#160;</td>
			<td>EDTA anticoagulant tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD19</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302206</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;3K15</td>
			<td>Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human lymphocyte separation medium</td>
			<td>Dakewe</td>
			<td>DKW-KLSH-0100</td>
			<td>Ficoll-Paque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS&#160;Separation&#160;columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Separation&#160;columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>Magnetic bead separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344706</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344808</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>BI</td>
			<td>02-024-1ACS</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL tube for FACS flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596024</td>
			<td>Lyse cells for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td>Trypan Blue Staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of immune cell subpopulations in peripheral blood samples from children with infectious mononucleosis

Infeksiøs mononukleose (IM) er et akutt syndrom som hovedsakelig er forbundet med primær Epstein-Barr-virus (EBV) infeksjon. De viktigste kliniske symptomene inkluderer uregelmessig feber, lymfadenopati og signifikant økte lymfocytter i perifert blod. Den patogene mekanismen for IM er fortsatt uklar; Det er ingen effektiv behandlingsmetode for det, med hovedsakelig symptomatisk behandling tilgjengelig. Hovedspørsmålet i EBV-immunbiologi er hvorfor bare en liten delmengde av infiserte individer viser alvorlige kliniske symptomer og til og med utvikler EBV-assosierte maligniteter, mens de fleste individer er asymptomatiske for livet med viruset.
B-celler er først involvert i IM fordi EBV-reseptorer presenteres på overflaten. Natural killer (NK) celler er cytotoksiske medfødte lymfocytter som er viktige for å drepe EBV-infiserte celler. Andelen CD4 + T-celler reduseres mens CD8 + T-celler utvides dramatisk under akutt EBV-infeksjon, og utholdenheten til CD8 + T-celler er viktig for livslang kontroll av IM. Disse immuncellene spiller viktige roller i IM, og deres funksjoner må identifiseres separat. Til dette formål separeres monocytter først fra mononukleære celler i perifert blod (PBMC) av IM-individer ved bruk av CD14-mikroperler, en kolonne og en magnetisk separator.
De resterende PBMCs er farget med peridinin-klorofyll-protein (PerCP) / Cyanine 5.5 anti-CD3, allophycocyanin (APC) / Cyanine 7 anti-CD4, phycoerythrin (PE) anti-CD8, fluoresceinisotiocyanat (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 og APC anti-CD16 antistoffer for å sortere CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler og NK-celler ved hjelp av et flowcytometer. Videre ble transkriptomsekvensering av fem subpopulasjoner utført for å utforske deres funksjoner og patogene mekanismer i IM.

Referanse til gating-strategien Gating-strategien som brukes til å sortere de fire lymfocytt-subpopulasjonene er vist i figur 1. Kort fortalt velges lymfocytter (P1) på et punktplott som viser granulositet (SSC-A) versus størrelse (FSC-A). Deretter velges enkeltceller (P2) på et punktdiagram som viser størrelsen (FSC-A) kontra fremoverpunkt (FSC-H), mens dobbeltceller utelates. CD3+ T-celler (P3) og CD19+ B-celler (figur 1B<...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis at JoVE.com

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Vi beskriver en metode som kombinerer immunmagnetiske perler og fluorescensaktivert cellesortering for å isolere og analysere definerte immuncelleunderpopulasjoner av mononukleære celler i perifert blod (monocytter, CD4+ T-celler, CD8+ T-celler, B-celler og naturlige drepeceller). Ved hjelp av denne metoden kan magnetiske og fluorescerende merkede celler renses og analyseres.

Separasjon av immuncellepopulasjoner i perifere blodprøver fra barn med infeksiøs mononukleose

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...

Denne metoden vil muliggjøre karakterisering av forskjellige immunceller i samme sykdomstilstander hos personer med IM, noe som vil utvide vår forståelse av mekanismen for EBV-infeksjon. Demonstrere prosedyren vil være Linlin Zhang, en lege fra vårt laboratorium. For å begynne med, ta PBMCs isolert tidligere i et 1, 5 milliliter mikrosentrifugerør, og spinn det ved 300 G i 10 minutter ved romtemperatur.Kast supernatanten, og suspender cellene på nytt med 80 mikroliter av den tilberedte bufferen. Deretter tilsettes 20 mikroliter CD 14 mikroperler til cellesuspensjonen, blandes godt ved pipettering, og inkuberer røret i 15 minutter på is. Vask deretter PBMCs med en milliliter buffer og sentrifuge ved 300 G i 10 minutter ved romtemperatur.Kast hele supernatanten, og suspender cellene på nytt med 500 mikroliter av bufferen. For magnetisk separasjon, plasser en kolonne på den magnetiske dråpeseparatoren, og prime kolonnen ved å vaske den med tre milliliter av bufferen. Deretter legger du til cellesuspensjonen i kolonnen.La det passere gjennom, og samle de umerkede cellene i et 15 milliliter sentrifugerør. Vask kolonnen tre ganger med tre milliliter av bufferen, og samle hele avløpet i et 15 milliliter sentrifugerør. Plasser nå kolonnen i et nytt 15 milliliter sentrifugerør, og legg til fem milliliter buffer til kolonnen.Skyv stempelet godt inn i kolonnen for å skylle de magnetisk merkede cellene inn i røret. Sentrifuge de magnetisk merkede cellene ved 300 G i fem minutter. Etter å ha fjernet supernatanten, suspender cellene på nytt i 500 mikroliter PBS, og overfør cellesuspensjonen til et 1, 5 milliliter mikrosentrifugerør for etterfølgende transkriptomsekvensering.Pellet de oppsamlede umerkede cellene ved sentrifugering ved 300 G i fem minutter, og suspendere cellene i 100 mikroliter PBS i et 1,5 milliliter mikrosentrifugerør. Deretter legger du til to mikroliter av hvert merket antistoff til cellesuspensjonen, og inkuberer på is i 30 minutter, beskyttet mot lys. Deretter aliquot 100 mikroliter av PBMC-cellesuspensjonen i 1,5 milliliter mikrosentrifugerør for å sette opp en negativ kontrollprøve CD 3, CD 4, CD 8 og CD 19, enkeltfargeprøver og en CD 56- eller CD 16-fargeprøve.Tilsett deretter to mikroliter av det tilsvarende fluorescerende merkede antistoffet til hvert rør, og inkuber på is i 30 minutter, beskyttet mot lys. Etter inkubasjon, vask alle celler med PBS som vist tidligere, og suspender igjen i 500 mikroliter PBS. Åpne cellesorteringssystemet, og kjør power on-programmet.Installer deretter 85 mikrometerdysen, og åpne sorteringsstrømmen. Sett sorteringsspenningen til 4.500 volt og frekvensen til 47. Sett opp gapet til 8 i avbruddsvinduet, og slå på sweet spot automatisk sorteringsmodus for å bestemme dråpeamplitudeverdien automatisk.Til slutt justerer du dråpeforsinkelsen til 30.31 i sidestrømvinduet. Ved hjelp av et fremover-mot-side-spredningspunktplott tegner du polygonporten P1 for å identifisere den intakte lymfocyttpopulasjonen. Deretter tegner du polygonporten P2 ved hjelp av et fremoverspredt punktdiagram kontra høydepunktplott for å identifisere enkeltcellene, og ekskluderer dubletter.Bruk deretter et CD 19 FITC-område kontra CD 3 per CPCY 5.5-punktdiagram, Tegn den rektangulære porten P3 for å velge CD 3-positive T-celler og CD 19-positive B-celler. Deretter bruker du et CD 4 APCCY 7-område kontra CD 8 PE-punktpunktplott, tegner du en rektangulær port for å velge CD 4 og CD 8-positive T-celler. Til slutt, ved å bruke et sidespredningsområde kontra CD 56 eller CD 16 APC-punktpunktplott, tegner du en rektangulær port for å velge CD 56 eller CD 16 positive naturlige drepeceller.For det negative kontrollrøret klikker du på last inn i innsamlingsdashbordet og velger cytometerinnstillingene i programvaren. I inspektørvinduet klikker du på parameterfanen og justerer spenningene til fremoverspredning, sidespredning og forskjellige fluorescerende fargestoffer. Etter at du har lastet de enkeltfargede rørene inn i cytometeret, klikker du på last inn i anskaffelsesdashbordet, og deretter klikker du på kompensasjonsfanen for å justere kompensasjonen, som beskrevet i teksten.Vortex cellesuspensjonen forsiktig, før du legger røret inn i cytometeret. Tilsett 200 mikroliter FBS til fire oppsamlingsstrømningsrør, og virvle rørene. Plasser dem i cytometeroppsamlingskammeret.Samle de forskjellige celletypene separat i de fire strømningsrørene. Spinn ned de separerte cellene ved 300 G i fem minutter, og tilsett 200 mikroliter RNA-isolasjonsreagens til cellepaletten for transkriptomsekvensering. I denne studien ble immunceller subpopulasjoner fra perifert blod av forskjellige prøver sortert ut effektivt ved å kombinere teknikkene for immunomagnetiske perler og fluorescensaktivert cellesortering.Det er viktig i denne protokollen at cellesorteringstrinnet er optimalisert for å forbedre cellens levedyktighet. De sorterte immuncellene viste en økt andel CD 3, CD 8 positive T-celler hos pasienter med infeksiøs mononukleose sammenlignet med både de friske Epstein-Barr-virusbærerne og uinfiserte prøver. I motsetning til dette ble reduserte andeler av CD 3, CD 4-positive T-celler og CD 19-positive B-celler observert hos pasienter med infeksiøs mononukleose sammenlignet med friske EBV-bærere og EBV-uinfiserte barn.I tillegg ble det observert reduserte andeler av CD 56 eller CD 16 positive naturlige drepeceller hos pasienter med infeksiøs mononukleose sammenlignet med EBV uinfiserte barn. Opprettholde cellens levedyktighet er viktig for etterfølgende eksperiment. Å holde celler på is, eller i kjøleskapet under sorteringsprosessen, er gunstig for cellens levedyktighet.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Telling av Store perifert blod leukocytter populasjoner multisenter kliniske studier med en Fullblod fenotyping Assay

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolering av forløper B-celle undergrupper fra navlestrengsblod

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Påvisning av Fluorescent Nanoparticle Interaksjoner med Primær immun celle subpopulasjoner av flowcytometri

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rapid Identifikasjon av gramnegative bakterier fra blodkultur buljong Bruke MALDI-TOF massespektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Oppdager Glykogen i perifere mononukleære blodceller med Periodisk Acid Schiff Farging

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Generation of Human alloantigen spesifikke T-celler fra perifert blod

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

En semi-automatisert tilnærming til Klar Antistoff Cocktails for Immunophenotypic analyse av perifert blod

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolering og flowcytometrisk analyse av gliom-infiltrerende perifere mononukleære blodceller

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...