Name: separation of immune cell subpopulations in peripheral blood samples from children with infectious mononucleosis
Uploaded: 2022-09-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82002130), Fundação de Ciências Naturais de Pequim (7222059) e pelo Fundo de Inovação CAMS para Ciências Médicas (2019-I2M-5-026).

Amostras de sangue foram obtidas de pacientes com MI (n = 3), portadores saudáveis de EBV (n = 3) e crianças não infectadas por EBV (n = 3). Os voluntários foram recrutados do Hospital Infantil de Pequim, da Universidade Médica da Capital, e todos os estudos foram aprovados eticamente. A aprovação ética foi obtida pelo Comitê de Ética do Hospital Infantil de Pequim, Capital Medical University (Número de Aprovação: [2021]-E-056-Y). O consentimento informado dos pacientes foi dispensado, pois o estudo utilizou...

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	<li>Kwok, H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+conventional+to+next+generation+sequencing+of+Epstein-Barr+virus+genomes.">From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes.</a> Viruses. 8 (3), 60 (2016).</li><li>Bu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+components+of+the+viral+fusion+apparatus+elicits+antibodies+that+neutralize+Epstein-Barr+virus+in+B+cells+and+epithelial+cells.">Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells.</a> Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).</li><li>Balfour, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral,+virology,+and+immunologic+factors+associated+with+acquisition+and+severity+of+primary+Epstein-Barr+virus+infection+in+university+students.">Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students.</a> Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).</li><li>Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+mononucleosis.">Infectious mononucleosis.</a> New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).</li><li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+research+on+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection+in+Japan.">Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan.</a> Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).</li><li>Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+infection+and+nasopharyngeal+carcinoma.">Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).</li><li>Zhong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+transcriptome+profiling+reveals+major+cell+types+in+the+cellular+immune+response+against+acute+and+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection.">Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).</li><li>Fedyanina, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+and+clinical+significance+of+atypical+mononuclear+cells+in+infectious+mononucleosis+caused+by+the+Epstein-Barr+virus+in+children.">The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children.</a> Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).</li><li>Al Tabaa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+polyclonal+activation+and+Epstein-Barr+viral+abortive+lytic+cycle+are+two+key+features+in+acute+infectious+mononucleosis.">B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis.</a> Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).</li><li>M, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+cell+transcriptome+during+primary+EBV+infection+and+EBV+associated+Hodgkin+Lymphoma+in+children-A+preliminary+observation.">Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation.</a> Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).</li><li>Greenough, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+signature+that+correlates+with+CD8++T+cell+expansion+in+acute+EBV+infection.">A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection.</a> Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).</li><li>Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+method+of+cell+separation+from+bile+of+patients+with+cholangiocarcinoma+for+flow+cytometry.">Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry.</a> Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+(cTfh)+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry.">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).</li><li>Djaoud, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+alternate+strategies+for+innate+immunity+to+Epstein-Barr+virus:+One+using+NK+cells+and+the+other+NK+cells+and+gammadelta+T+cells.">Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).</li><li>Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+in+post-transplant+lymphoproliferative+disorders.">Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders.</a> Cancers. 13 (8), 1836 (2021).</li><li>Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+analysis+of+CD8++T+cell+responses+to+EBV+reveals+differences+between+primary+and+persistent+infection.">Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).</li><li>Zamai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Synergy+of+NKp46+and+co-activating+signals+in+various+NK+cell+subpopulations:+paving+the+way+for+more+successful+NK-cell-based+immunotherapy.">Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), 753 (2020).</li><li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD4++and+CD8++polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection.">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).</li><li>Choi, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+by+the+Epstein-Barr+virus+LMP1+protein+induces+potent+cytotoxic+CD4(+)+and+CD8(+)+T+cell+responses.">Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).</li></ol>

Este protocolo representa uma maneira eficiente de classificar as subpopulações de células imunes do sangue periférico. Neste estudo, amostras de sangue venoso de pacientes com MI, portadores de EBV saudáveis e crianças não infectadas por EBV foram selecionadas como objetivo da pesquisa. Este trabalho utilizando o sangue periférico de pacientes com MI concentra-se principalmente em analisar e determinar as proporções de diferentes subconjuntos celulares através da citometria de fluxo multicolorida. O sequencia...

O vírus Epstein-Barr (EBV), um γ-herpesvírus também conhecido como vírus do herpes humano tipo 4, é onipresente na população humana e estabelece infecção latente ao longo da vida em mais de 90% da população adulta1. A maioria das infecções primárias por EBV ocorre durante a infância e adolescência, com uma fração de pacientes manifestando mononucleose infecciosa (IM)2, mostrando imunopatologia característica, incluindo uma resposta imune ativada com células T CD8+ no sangue e uma proliferação transitória de células B infectadas por EBV na orofaringe3. O curso da MI pode durar de 2 a 6 semanas e a maioria dos pacientes se recupera bem4. No entanto, alguns indivíduos desenvolvem sintomas persistentes ou recorrentes semelhantes aos MI com alta morbidade e mortalidade, que é classificada como infecção crônica ativa por EBV (CAEBV)5. Além disso, o EBV é um importante vírus oncogênico, que está intimamente relacionado a uma variedade de malignidades, incluindo malignidades epitelióides e linfoides, como carcinoma nasofaríngeo, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin (LH) e linfoma de células T/NK6. Embora o EBV tenha sido estudado por mais de 50 anos, sua patogênese e o mecanismo pelo qual induz a proliferação de linfócitos não foram totalmente elucidados.
Diversos estudos têm investigado as assinaturas moleculares para a imunopatologia da infecção por EBV por sequenciamento de transcriptoma. Zhong et al. analisaram o perfil do transcriptoma completo de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de crianças chinesas com MI ou CAEBV para descobrir que a expansão das células T CD8 + foi predominantemente encontrada no grupo IM7, sugerindo que as células T CD8 + podem desempenhar um papel importante na MI. Da mesma forma, outro estudo encontrou menores proporções de células T e CD19+ citotóxicas específicas para EBV e maiores porcentagens de células T CD8+ em pacientes com MI causada por infecção primária por EBV do que em pacientes com IM causada tanto pela reativação do EBV quanto por outros agentes8. As células B são envolvidas pela primeira vez na MI porque os receptores de EBV são apresentados em sua superfície. Al Tabaa et al. encontraram que as células B eram policlonalmente ativadas e diferenciadas em plasmoblastos (CD19+, CD27+ e CD20− e CD138−) e plasmócitos (CD19+, CD27+ e CD20−, e CD138+) durante o IM9. Além disso, Zhong et al. descobriram que os marcadores de monócitos CD14 e CD64 foram regulados positivamente no CAEBV, sugerindo que os monócitos podem desempenhar um papel importante na resposta imune celular do CAEBV através da citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) e fagocitose hiperativa7. Alka et al. caracterizaram o transcriptoma de células NK CD56 dim CD16+ classificadas por MACS de quatro pacientes de IM ou HL e descobriram que as células NK de IM e HL tinham imunidade inata e genes de sinalização de quimiocinas desregulados, o que poderia ser responsável pela hiporresponsividade das células NK10. Além disso, Greenough et al. analisaram a expressão gênica de células T CD8+ classificadas de 10 PBMCs de indivíduos com MI. Relataram que uma grande proporção de células T CD8+ na MI eram específicas do vírus, ativadas, dividindo-se e preparadas para exercer atividades efetoras11. Tanto as respostas específicas do EBV mediadas por células T quanto as respostas inespecíficas mediadas por células NK desempenham papéis essenciais durante a infecção primária por EBV. No entanto, esses estudos investigaram apenas os resultados do transcriptoma da mistura diversificada de células imunes ou apenas uma certa subpopulação de linfócitos, o que não é suficiente para a comparação abrangente das características moleculares e funções de diferentes subpopulações de células imunes em crianças com MI no mesmo estado de doença.
Este artigo descreve um método que combina contas imunomagnéticas e classificação celular ativada por fluorescência (FACS) para isolar e analisar subpopulações de células imunes definidas de PBMCs (monócitos, células T CD4+, células T CD8+, células B e células NK). Usando este método, as células magnéticas e fluorescentemente marcadas podem ser purificadas usando um separador magnético e FACS ou analisadas por citometria de fluxo. O RNA pode ser extraído das células purificadas para sequenciamento do transcriptoma. Este método permitirá a caracterização e expressão gênica de diferentes células imunes nos mesmos estados de doença de indivíduos com MI, o que ampliará nossa compreensão da imunopatologia da infecção por EBV.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD16</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302012</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD56 (NCAM)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>362504</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-human CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344616</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria fluorescence-activated&#160;flow&#160;cell&#160;sorter-cytometer (BD FACSAria II)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>644832</td>
			<td>Cell sort</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell ctng slides</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1450016</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (&#8805;99%, BioPremium)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST1303</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>&#160;367862&#160;</td>
			<td>EDTA anticoagulant tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD19</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302206</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;3K15</td>
			<td>Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human lymphocyte separation medium</td>
			<td>Dakewe</td>
			<td>DKW-KLSH-0100</td>
			<td>Ficoll-Paque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS&#160;Separation&#160;columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Separation&#160;columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>Magnetic bead separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344706</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344808</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>BI</td>
			<td>02-024-1ACS</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL tube for FACS flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596024</td>
			<td>Lyse cells for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td>Trypan Blue Staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of immune cell subpopulations in peripheral blood samples from children with infectious mononucleosis

A mononucleose infecciosa (MI) é uma síndrome aguda associada principalmente à infecção primária pelo vírus Epstein-Barr (EBV). Os principais sintomas clínicos incluem febre irregular, linfadenopatia e linfócitos significativamente aumentados no sangue periférico. O mecanismo patogênico da MI ainda não está claro; não existe um método de tratamento eficaz para o efeito, estando disponíveis principalmente terapias sintomáticas. A principal questão na imunobiologia do EBV é por que apenas um pequeno subconjunto de indivíduos infectados apresenta sintomas clínicos graves e até desenvolve malignidades associadas ao EBV, enquanto a maioria dos indivíduos é assintomática por toda a vida com o vírus.
As células B são envolvidas pela primeira vez na MI porque os receptores de EBV são apresentados em sua superfície. As células natural killer (NK) são linfócitos inatos citotóxicos que são importantes para matar as células infectadas pelo EBV. A proporção de células T CD4+ diminui, enquanto a de células T CD8+ se expande dramaticamente durante a infecção aguda por EBV, e a persistência de células T CD8+ é importante para o controle vitalício da MI. Essas células imunes desempenham papéis importantes na MI, e suas funções precisam ser identificadas separadamente. Para este propósito, os monócitos são separados primeiro das células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) de indivíduos IM usando microesferas CD14, uma coluna e um separador magnético.
Os PBMCs restantes são corados com peridinina-clorofila-proteína (PerCP)/Cianina 5.5 anti-CD3, aloficocianina (APC)/Cianina 7 anti-CD4, ficoeritrina (PE) anti-CD8, isotiocianato de fluoresceína (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 e APC anti-CD16 para classificar células T CD4+, células T CD8+, células B e células NK usando um citômetro de fluxo. Além disso, o sequenciamento do transcriptoma de cinco subpopulações foi realizado para explorar suas funções e mecanismos patogênicos na MI.

Referência da estratégia de confinamento A estratégia de gating utilizada para classificar as quatro subpopulações de linfócitos é mostrada na Figura 1. Resumidamente, os linfócitos são selecionados (P1) em um gráfico de pontos mostrando a granulosidade (SSC-A) versus o tamanho (FSC-A). Em seguida, as células simples são selecionadas (P2) em um gráfico de pontos mostrando o tamanho (FSC-A) versus dispersão para frente (FSC-H), enquanto as células duplas sã...

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Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Descrevemos um método que combina contas imunomagnéticas e classificação de células ativadas por fluorescência para isolar e analisar subpopulações de células imunes definidas de células mononucleares do sangue periférico (monócitos, células T CD4 + , células T CD8 + , células B e células natural killer). Usando este método, as células magnéticas e fluorescentemente marcadas podem ser purificadas e analisadas.

Separação de subpopulações de células imunes em amostras de sangue periférico de crianças com mononucleose infecciosa

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...

Este método permitirá a caracterização de diferentes células imunes nos mesmos estados de doença de indivíduos com MI, o que ampliará nossa compreensão do mecanismo de infecção por EBV. Demonstrando o procedimento estará Linlin Zhang, um médico do nosso laboratório. Para começar, pegue os PBMCs isolados anteriormente em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e gire-o a 300 G por 10 minutos à temperatura ambiente.Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células com 80 microlitros do tampão preparado. Em seguida, adicione 20 microlitros de microesferas CD 14 à suspensão celular, bem misturadas por pipetagem, e incube o tubo por 15 minutos no gelo. Em seguida, lave os PBMCs usando um mililitro de tampão e centrífuga a 300 G por 10 minutos à temperatura ambiente.Descarte todo o sobrenadante e ressuspenda as células com 500 microlitros do buffer. Para separação magnética, coloque uma coluna no separador de contas magnéticas e prepare a coluna lavando-a com três mililitros do buffer. Em seguida, adicione a suspensão da célula à coluna.Deixe-o passar e colete as células não rotuladas em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Lave a coluna três vezes com três mililitros do tampão e colete todo o efluente em um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Agora, coloque a coluna em um novo tubo de centrífuga de 15 mililitros e adicione cinco mililitros de buffer à coluna.Empurre o êmbolo firmemente para dentro da coluna para liberar as células marcadas magneticamente no tubo. Centrifugar as células marcadas magneticamente a 300 G durante cinco minutos. Depois de remover o sobrenadante, ressuspeite as células em 500 microlitros de PBS e transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para posterior sequenciamento do transcriptoma.Pellet as células coletadas não marcadas por centrifugação a 300 G por cinco minutos, e ressuspender as células em 100 microlitros de PBS em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, adicione dois microlitros de cada anticorpo marcado à suspensão celular e incube no gelo por 30 minutos, protegido da luz. Em seguida, alíquota de 100 microlitros da suspensão de células PBMC em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro para configurar uma amostra de controle negativo CD 3, CD 4, CD 8 e CD 19, amostras de coloração única e uma amostra de coloração CD 56 ou CD 16.Em seguida, adicione dois microlitros do anticorpo marcado fluorescentemente correspondente a cada tubo e incube no gelo por 30 minutos, protegido da luz. Após a incubação, lave todas as células com PBS, como demonstrado anteriormente, e ressuspeite em 500 microlitros de PBS. Abra o sistema de classificação de células e execute o programa power on.Em seguida, instale o bocal de 85 micrômetros e abra o fluxo de classificação. Defina a tensão de classificação para 4, 500 volts e a frequência para 47. Configure o intervalo como 8 na janela de interrupção e ative o modo de classificação automática de ponto ideal para determinar o valor da amplitude do gota automaticamente.Finalmente, ajuste o atraso da gota para 30,31 na janela de fluxo lateral. Usando um gráfico de pontos de dispersão para frente versus lateral, desenhe a porta do polígono P1 para identificar a população de linfócitos intacta. Em seguida, usando uma área de dispersão para frente versus gráfico de pontos de altura, desenhe a porta do polígono P2 para identificar as células individuais e exclua os dubletos.Em seguida, usando uma área FITC CD 19 versus CD 3 por gráfico de pontos de área CPCY 5.5, desenhe a porta retangular P3 para selecionar células T positivas para CD 3 e células B positivas para CD 19. Em seguida, usando um gráfico de pontos de área APCCY 7 do CD 4 versus área do CD 8 PE, desenhe uma porta retangular para selecionar as células T positivas do CD 4 e do CD 8. Finalmente, usando uma área de dispersão lateral versus gráfico de pontos de área APC CD 56 ou CD 16, desenhe uma porta retangular para selecionar células natural killer positivas para CD 56 ou CD 16.Para o tubo de controle negativo, clique em carregar no painel de aquisição e selecione as configurações do citômetro no software. Na janela do inspetor, clique na guia parâmetros e ajuste as tensões de dispersão para frente, dispersão lateral e corantes fluorescentes diferentes. Depois de carregar os tubos de coloração única no citômetro, clique em carregar no painel de aquisição e, em seguida, clique na guia de compensação para ajustar a compensação, conforme descrito no texto.Vórtice a suspensão celular suavemente, antes de carregar o tubo no citômetro. Adicione 200 microlitros de FBS a quatro tubos de fluxo de coleta e vortex os tubos. Coloque-os na câmara de coleta do citômetro.Colete os diferentes tipos de células separadamente nos quatro tubos de fluxo. Gire as células separadas a 300 G por cinco minutos e adicione 200 microlitros de reagente de isolamento de RNA à paleta celular para sequenciamento do transcriptoma. No presente estudo, subpopulações de células imunes de sangue periférico de diferentes amostras foram classificadas de forma eficiente, combinando as técnicas de esferas imunomagnéticas e triagem de células ativadas por fluorescência.É importante ressaltar que, neste protocolo, a etapa de classificação de células foi otimizada para melhorar a viabilidade celular. As células imunes classificadas mostraram uma proporção aumentada de células T positivas para CD 3, CD 8 em pacientes com mononucleose infecciosa em comparação com os portadores saudáveis do vírus Epstein-Barr e amostras não infectadas. Em contraste, proporções diminuídas de células T positivas para CD 3, CD 4 e células B positivas para CD 19 foram observadas em pacientes com mononucleose infecciosa em comparação com portadores saudáveis de EBV e crianças não infectadas por EBV.Além disso, foram observadas proporções diminuídas de células natural killer positivas para CD 56 ou CD 16 em pacientes com mononucleose infecciosa em comparação com crianças não infectadas por EBV. Manter a viabilidade celular é vital para experimentos subsequentes. Manter as células no gelo ou na geladeira durante o processo de classificação é benéfico para a viabilidade celular.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Enumeração dos principais Populações de Leucócitos do Sangue Periférico de ensaios clínicos multicêntricos usando um ensaio fenotipagem Sangue

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolamento de precursor de células B subconjuntos de Sangue do Cordão Umbilical

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Uma<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudar respostas imunes de sangue periférico humano células mononucleares para Vírus Respiratório Sincicial Humano Infecção

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Detecção de nanopartículas fluorescentes Interações com Primário imunitário subpopulações de células por citometria de fluxo

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Rápida identificação de bactérias gram-negativas de Sangue Cultura Caldo Usando MALDI-TOF Espectrometria de Massa

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Detecção de glicogênio no sangue periférico células mononucleares com Periodic Acid Schiff Coloração

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Geração de Células T humanas alo-específicos a partir de Sangue Periférico

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

Uma abordagem automatizada-Semi Preparando Antibody Cocktails para Análise imunofenotípica de Sangue Periférico Humano

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolamento e Análise de Citometria de Fluxo infiltrantes Glioma Células Mononucleares do Sangue Periférico

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...