Name: separation of immune cell subpopulations in peripheral blood samples from children with infectious mononucleosis
Uploaded: 2022-09-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis at JoVE.com

Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China (82002130), Beijing Natural Science Foundation (7222059) och CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).

Blodprover erhölls från patienter med IM (n = 3), friska EBV-bärare (n = 3) och EBV-oinfekterade barn (n = 3). Volontärer rekryterades från Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, och alla studier var etiskt godkända. Etiskt godkännande erhölls av etikkommittén vid Beijing Children's Hospital, Capital Medical University (godkännandenummer: [2021] -E-056-Y). Informerat samtycke från patienter upphävdes eftersom studien endast använde de återstående proverna för klinisk testning. All data a...

<ol>
	<li>Kwok, H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+conventional+to+next+generation+sequencing+of+Epstein-Barr+virus+genomes.">From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes.</a> Viruses. 8 (3), 60 (2016).</li><li>Bu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+components+of+the+viral+fusion+apparatus+elicits+antibodies+that+neutralize+Epstein-Barr+virus+in+B+cells+and+epithelial+cells.">Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells.</a> Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).</li><li>Balfour, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral,+virology,+and+immunologic+factors+associated+with+acquisition+and+severity+of+primary+Epstein-Barr+virus+infection+in+university+students.">Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students.</a> Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).</li><li>Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+mononucleosis.">Infectious mononucleosis.</a> New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).</li><li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+research+on+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection+in+Japan.">Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan.</a> Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).</li><li>Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+infection+and+nasopharyngeal+carcinoma.">Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).</li><li>Zhong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+transcriptome+profiling+reveals+major+cell+types+in+the+cellular+immune+response+against+acute+and+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection.">Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).</li><li>Fedyanina, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+and+clinical+significance+of+atypical+mononuclear+cells+in+infectious+mononucleosis+caused+by+the+Epstein-Barr+virus+in+children.">The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children.</a> Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).</li><li>Al Tabaa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+polyclonal+activation+and+Epstein-Barr+viral+abortive+lytic+cycle+are+two+key+features+in+acute+infectious+mononucleosis.">B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis.</a> Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).</li><li>M, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+cell+transcriptome+during+primary+EBV+infection+and+EBV+associated+Hodgkin+Lymphoma+in+children-A+preliminary+observation.">Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation.</a> Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).</li><li>Greenough, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+signature+that+correlates+with+CD8++T+cell+expansion+in+acute+EBV+infection.">A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection.</a> Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).</li><li>Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+method+of+cell+separation+from+bile+of+patients+with+cholangiocarcinoma+for+flow+cytometry.">Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry.</a> Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+(cTfh)+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry.">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).</li><li>Djaoud, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+alternate+strategies+for+innate+immunity+to+Epstein-Barr+virus:+One+using+NK+cells+and+the+other+NK+cells+and+gammadelta+T+cells.">Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).</li><li>Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+in+post-transplant+lymphoproliferative+disorders.">Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders.</a> Cancers. 13 (8), 1836 (2021).</li><li>Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+analysis+of+CD8++T+cell+responses+to+EBV+reveals+differences+between+primary+and+persistent+infection.">Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).</li><li>Zamai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Synergy+of+NKp46+and+co-activating+signals+in+various+NK+cell+subpopulations:+paving+the+way+for+more+successful+NK-cell-based+immunotherapy.">Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), 753 (2020).</li><li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD4++and+CD8++polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection.">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).</li><li>Choi, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+by+the+Epstein-Barr+virus+LMP1+protein+induces+potent+cytotoxic+CD4(+)+and+CD8(+)+T+cell+responses.">Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).</li></ol>

Detta protokoll representerar ett effektivt sätt att sortera perifera blodimmunceller subpopulationer. I denna studie valdes venösa blodprover från patienter med IM, friska EBV-bärare och EBV-oinfekterade barn som forskningsmål. Detta arbete med hjälp av perifert blod hos patienter med IM fokuserar huvudsakligen på att analysera och bestämma proportionerna av olika cellundergrupper genom flerfärgsflödescytometri. Transkriptomsekvensering används huvudsakligen för detektion och analys av en viss delpopulation ...

Epstein–Barr-virus (EBV), ett γ-herpesvirus även känt som humant herpesvirus typ 4, är allestädes närvarande i den mänskliga befolkningen och etablerar livslång latent infektion hos mer än 90% av den vuxna befolkningen1. De flesta EBV-primära infektioner inträffar under barndomen och tonåren, med en bråkdel av patienterna som manifesterar sig med infektiös mononukleos (IM)2, som visar karakteristisk immunopatologi, inklusive ett aktiverat immunsvar med CD8 + T-celler i blod och en övergående proliferation av EBV-infekterade B-celler i orofarynx3. Förloppet av IM kan pågå i 2–6 veckor och majoriteten av patienterna återhämtar sig väl4. Vissa individer utvecklar dock ihållande eller återkommande IM-liknande symtom med hög sjuklighet och dödlighet, vilket klassificeras som kronisk aktiv EBV-infektion (CAEBV)5. Dessutom är EBV ett viktigt onkogent virus, som är nära besläktat med en mängd olika maligniteter, inklusive epiteloida och lymfoida maligniteter såsom nasofaryngealt karcinom, Burkitts lymfom, Hodgkins lymfom (HL) och T / NK-celllymfom6. Även om EBV har studerats i över 50 år har dess patogenes och mekanismen genom vilken den inducerar proliferation av lymfocyter inte helt klarlagts.
Flera studier har undersökt de molekylära signaturerna för immunopatologin för EBV-infektion genom transkriptomsekvensering. analyserade hel-transkriptomprofilering av mononukleära celler i perifert blod (PBMC) från kinesiska barn med IM eller CAEBV för att upptäcka att CD8 + T-cellutvidgning övervägande hittades i IM-gruppen7, vilket tyder på att CD8 + T-celler kan spela en viktig roll i IM. På samma sätt fann en annan studie lägre andelar av EBV-specifika cytotoxiska T- och CD19 + B-celler och högre procentandelar av CD8 + T-celler hos patienter med IM orsakad av primär EBV-infektion än hos patienter med IM orsakad både av EBV-reaktivering och andra medel8. B-celler är först involverade i IM eftersom EBV-receptorer presenteras på deras yta. fann att B-celler aktiverades polyklonalt och differentierades tillplasmablaster (CD19 +, CD27 + och CD20 − och CD138 - celler) och plasmaceller (CD19 +, CD27 + och CD20 − och CD138 +) under IM 9. fann dessutom att monocytmarkörerna CD14 och CD64 var uppreglerade i CAEBV, vilket tyder på att monocyter kan spela en viktig roll i det cellulära immunsvaret hos CAEBV genom antikroppsberoende cellulär cytotoxicitet (ADCC) och hyperaktiv fagocytos7. karakteriserade transkriptomet av MACS-sorterade CD56dim CD16 + NK-celler från fyra patienter med IM eller HL och fann att NK-celler från både IM och HL hade nedreglerad medfödd immunitet och kemokinsignaleringsgener, vilket kan vara ansvarigt för hyporesponsiviteten hos NK-celler10. analyserade dessutom genuttryck av sorterade CD8 + T-celler från 10 PBMC av individer med IM. De rapporterade att en stor andel av CD8 + T-cellerna i IM var virusspecifika, aktiverade, delande och grundade för att utöva effektoraktiviteter11. Både T-cellmedierade, EBV-specifika svar och NK-cellmedierade, ospecifika svar spelar viktiga roller under primär EBV-infektion. Dessa studier undersökte emellertid endast transkriptomresultaten av den olika blandningen av immunceller eller endast en viss subpopulation av lymfocyter, vilket inte är tillräckligt för en omfattande jämförelse av molekylära egenskaper och funktioner hos olika immuncellssubpopulationer hos barn med IM vid samma sjukdomstillstånd.
Detta dokument beskriver en metod som kombinerar immunomagnetiska pärlor och fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för att isolera och analysera definierade immuncellssubpopulationer av PBMC (monocyter, CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler och NK-celler). Med hjälp av denna metod kan magnetiska och fluorescerande märkta celler renas med hjälp av en magnetisk separator och FACS eller analyseras med flödescytometri. RNA kan extraheras från de renade cellerna för transkriptomsekvensering. Denna metod kommer att möjliggöra karakterisering och genuttryck av olika immunceller i samma sjukdomstillstånd hos individer med IM, vilket kommer att utöka vår förståelse för immunopatologin för EBV-infektion.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD16</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302012</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD56 (NCAM)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>362504</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-human CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344616</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria fluorescence-activated&#160;flow&#160;cell&#160;sorter-cytometer (BD FACSAria II)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>644832</td>
			<td>Cell sort</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell ctng slides</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1450016</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (&#8805;99%, BioPremium)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST1303</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>&#160;367862&#160;</td>
			<td>EDTA anticoagulant tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD19</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302206</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;3K15</td>
			<td>Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human lymphocyte separation medium</td>
			<td>Dakewe</td>
			<td>DKW-KLSH-0100</td>
			<td>Ficoll-Paque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS&#160;Separation&#160;columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Separation&#160;columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>Magnetic bead separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344706</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344808</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>BI</td>
			<td>02-024-1ACS</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL tube for FACS flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596024</td>
			<td>Lyse cells for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td>Trypan Blue Staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of immune cell subpopulations in peripheral blood samples from children with infectious mononucleosis

Infektiös mononukleos (IM) är ett akut syndrom som oftast förknippas med primär Epstein – Barr-virusinfektion (EBV). De viktigaste kliniska symptomen inkluderar oregelbunden feber, lymfadenopati och signifikant ökade lymfocyter i perifert blod. Den patogena mekanismen för IM är fortfarande oklar; Det finns ingen effektiv behandlingsmetod för det, med huvudsakligen symptomatiska terapier tillgängliga. Huvudfrågan i EBV-immunbiologi är varför endast en liten delmängd av infekterade individer visar allvarliga kliniska symtom och till och med utvecklar EBV-associerade maligniteter, medande flesta individer är asymptomatiska för livet med viruset.
B-celler är först involverade i IM eftersom EBV-receptorer presenteras på deras yta. Naturliga mördarceller (NK) är cytotoxiska medfödda lymfocyter som är viktiga för att döda EBV-infekterade celler. Andelen CD4 + T-celler minskar medan andelen CD8 + T-celler expanderar dramatiskt under akut EBV-infektion, och persistensen hos CD8 + T-celler är viktig för livslång kontroll av IM. Dessa immunceller spelar viktiga roller i IM, och deras funktioner måste identifieras separat. För detta ändamål separeras monocyter först från mononukleära celler i perifert blod (PBMC) hos IM-individer som använder CD14-mikrober, en kolonn och en magnetisk separator.
De återstående PBMC: erna är färgade med peridinin-klorofyllprotein (PerCP) / cyanin 5.5 anti-CD3, allophycocyanin (APC) / Cyanine 7 anti-CD4, phycoerythrin (PE) anti-CD8, fluorescein isotiocyanat (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 och APC anti-CD16 antikroppar för att sortera CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler och NK-celler med hjälp av en flödescytometer. Vidare utfördes transkriptomsekvensering av fem delpopulationer för att utforska deras funktioner och patogena mekanismer i IM.

Hänvisning till grindstrategin Gatingstrategin som används för att sortera de fyra lymfocytunderpopulationerna visas i figur 1. Kortfattat väljs lymfocyter (P1) på ett punktdiagram som visar granulositeten (SSC-A) kontra storleken (FSC-A). Sedan markeras enstaka celler (P2) på ett punktdiagram som visar storleken (FSC-A) kontra framåtriktad spridning (FSC-H), medan dubblettceller utesluts. CD3+ T-celler (P3) och CD19+ B-celler (<strong class="...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis at JoVE.com

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Vi beskriver en metod som kombinerar immunomagnetiska pärlor och fluorescensaktiverad cellsortering för att isolera och analysera definierade immuncellssubpopulationer av mononukleära celler i perifert blod (monocyter, CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, B-celler och naturliga mördarceller). Med hjälp av denna metod kan magnetiska och fluorescerande märkta celler renas och analyseras.

Separation av immuncellssubpopulationer i perifera blodprover från barn med infektiös mononukleos

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...

Denna metod kommer att möjliggöra karakterisering av olika immunceller i samma sjukdomstillstånd hos individer med IM, vilket kommer att utöka vår förståelse för mekanismen för EBV-infektion. Demonstrerar proceduren kommer att vara Linlin Zhang, en läkare från vårt laboratorium. För att börja, ta PBMC: erna isolerade tidigare i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och snurra det vid 300 G i 10 minuter vid rumstemperatur.Kassera supernatanten och suspendera cellerna igen med 80 mikroliter av den beredda bufferten. Tillsätt sedan 20 mikroliter CD 14-mikrober till cellsuspensionen, blandas väl genom pipettering och inkubera röret i 15 minuter på is. Tvätta sedan PBMC: erna med en milliliter buffert och centrifugera vid 300 G i 10 minuter vid rumstemperatur.Kassera hela supernatanten och suspendera cellerna igen med 500 mikroliter av bufferten. För magnetisk separation, placera en kolonn på magnetpärlseparatorn och primera kolonnen genom att tvätta den med tre milliliter av bufferten. Lägg sedan till cellsuspensionen i kolumnen.Låt den passera igenom och samla de omärkta cellerna i ett 15 ml centrifugrör. Tvätta kolonnen tre gånger med tre milliliter av bufferten och samla hela utflödet i ett 15 ml centrifugrör. Placera nu kolonnen i ett nytt centrifugrör på 15 ml och tillsätt fem milliliter buffert till kolonnen.Tryck in kolven ordentligt i kolonnen för att spola in de magnetiskt märkta cellerna i röret. Centrifugera de magnetiskt märkta cellerna vid 300 G i fem minuter. Efter avlägsnande av supernatanten, suspendera cellerna igen i 500 mikroliter PBS och överför cellsuspensionen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör för efterföljande transkriptomsekvensering.Pellet de uppsamlade omärkta cellerna genom att centrifugera vid 300 G i fem minuter och suspendera cellerna i 100 mikroliter PBS i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tillsätt sedan två mikroliter av varje märkt antikropp till cellsuspensionen och inkubera på is i 30 minuter, skyddad från ljus. Därefter alikvotera 100 mikroliter PBMC-cellsuspensionen i 1,5 ml mikrocentrifugrör för att ställa in ett negativt kontrollprov CD 3, CD 4, CD 8 och CD 19, enstaka färgningsprover och ett CD 56- eller CD 16-färgningsprov.Tillsätt sedan två mikroliter av motsvarande fluorescerande märkta antikropp till varje rör och inkubera på is i 30 minuter, skyddad från ljus. Efter inkubation, tvätta alla celler med PBS som visats tidigare och suspendera igen i 500 mikroliter PBS. Öppna cellsorteringssystemet och kör power on-programmet.Installera sedan munstycket på 85 mikrometer och öppna sorteringsströmmen. Ställ in sorteringsspänningen på 4 500 volt och frekvensen på 47. Ställ in gapet på 8 i avbrottsfönstret och aktivera det automatiska sorteringsläget för sweet spot för att bestämma droppamplitudvärdet automatiskt.Slutligen justerar du droppfördröjningen till 30,31 i sidoströmsfönstret. Använd ett framåtriktat kontra sidospridningspunktdiagram och rita polygonporten P1 för att identifiera den intakta lymfocytpopulationen. Använd sedan ett framåtriktat spridningsområde kontra höjdpunktsdiagram, rita polygonporten P2 för att identifiera de enskilda cellerna och uteslut dubbletter.Använd sedan ett CD 19 FITC-område jämfört med CD 3 per CPCY 5,5-områdespunktdiagram, rita den rektangulära grinden P3 för att välja CD 3-positiva T-celler och CD 19-positiva B-celler. Använd sedan ett CD 4 APCCY 7-område jämfört med CD 8 PE-punktdiagram, rita en rektangulär grind för att välja CD 4 och CD 8-positiva T-celler. Slutligen, med hjälp av ett sidospridningsområde kontra CD 56 eller CD 16 APC-områdespunktdiagram, rita en rektangulär grind för att välja CD 56 eller CD 16 positiva naturliga mördarceller.För det negativa kontrollröret klickar du på ladda i anskaffningsinstrumentpanelen och väljer cytometerinställningarna i programvaran. I kontrollfönstret klickar du på fliken parametrar och justerar spänningarna för framåtspridning, sidospridning och olika fluorescerande färgämnen. När du har laddat de enstaka färgade rören i cytometern klickar du på ladda i förvärvspanelen och klickar sedan på kompensationsfliken för att justera kompensationen, enligt beskrivningen i texten.Vortex cellsuspensionen försiktigt, innan du laddar röret i cytometern. Tillsätt 200 mikroliter FBS till fyra uppsamlingsflödesrör och virvla rören. Placera dem i cytometeruppsamlingskammaren.Samla de olika typerna av celler separat i de fyra flödesrören. Snurra ner de separerade cellerna vid 300 G i fem minuter och tillsätt 200 mikroliter RNA-isoleringsreagens till cellpaletten för transkriptomsekvensering. I den aktuella studien sorterades immuncellers subpopulationer från perifert blod i olika prover effektivt genom att kombinera teknikerna för immunomagnetiska pärlor och fluorescensaktiverad cellsortering.Viktigt i detta protokoll är att cellsorteringssteget har optimerats för att förbättra cellviabiliteten. De sorterade immuncellerna visade en ökad andel CD 3, CD 8-positiva T-celler hos patienter med infektiös mononukleos jämfört med både de friska Epstein-Barr-virusbärarna och oinfekterade prover. Däremot observerades minskade andelar av CD 3, CD 4-positiva T-celler och CD 19-positiva B-celler hos patienter med infektiös mononukleos jämfört med friska EBV-bärare och EBV-oinfekterade barn.Dessutom observerades minskade andelar av CD 56 eller CD 16-positiva naturliga mördarceller hos patienter med infektiös mononukleos jämfört med EBV-oinfekterade barn. Att upprätthålla cellviabilitet är avgörande för efterföljande experiment. Att hålla celler på is eller i kylskåp under sorteringsprocessen är fördelaktigt för cellviabiliteten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Räkning av Stora perifera populationer blodleukocyt för kliniska multicenterstudier Använda en hel analys Blood Fenotypning

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Isolering av prekursor B-cell-underuppsättningar från navelsträngsblod

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Upptäckt av fluorescerande nanopartiklar Interaktion med Primär Immun cellsubpopulationer med flödescytometri

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

Snabb identifiering av gramnegativa bakterier från Blood Culture Broth Använda MALDI-TOF masspektrometri

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Upptäcka Glykogen i perifera mononukleära blodceller med Periodic Acid Schiff Färgning

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Generering av Human Alloantigen-specifika T-celler från perifert blod

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

En halvautomatisk metoden att förbereda antikropp Cocktails för Immunophenotypic Analys av humant perifert blod

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

Isolering och flödescytometrisk analys av gliom-infiltrera perifera mononukleära blodceller

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...