Name: separation of immune cell subpopulations in peripheral blood samples from children with infectious mononucleosis
Uploaded: 2022-09-07T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis at JoVE.com

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82002130), Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (7222059) ve Tıp Bilimleri için CAMS İnovasyon Fonu (2019-I2M-5-026) tarafından desteklenmiştir.

IM'li hastalardan (n=3), sağlıklı EBV taşıyıcılarından (n=3) ve EBV ile enfekte olmayan çocuklardan (n=3) kan örnekleri alındı. Gönüllüler Pekin Çocuk Hastanesi, Capital Medical Üniversitesi'nden işe alındı ve tüm çalışmalar etik olarak onaylandı. Etik onay, Başkent Tıp Üniversitesi Pekin Çocuk Hastanesi Etik Kurulu tarafından alınmıştır (Onay Numarası: [2021]-E-056-Y). Hastaların bilgilendirilmiş onamından feragat edildi, çünkü çalışma sadece klinik testler için kalan örnekl...

<ol>
	<li>Kwok, H., Chiang, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+conventional+to+next+generation+sequencing+of+Epstein-Barr+virus+genomes.">From conventional to next generation sequencing of Epstein-Barr virus genomes.</a> Viruses. 8 (3), 60 (2016).</li><li>Bu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunization+with+components+of+the+viral+fusion+apparatus+elicits+antibodies+that+neutralize+Epstein-Barr+virus+in+B+cells+and+epithelial+cells.">Immunization with components of the viral fusion apparatus elicits antibodies that neutralize Epstein-Barr virus in B cells and epithelial cells.</a> Immunity. 50 (5), 1305-1316 (2019).</li><li>Balfour, H. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral,+virology,+and+immunologic+factors+associated+with+acquisition+and+severity+of+primary+Epstein-Barr+virus+infection+in+university+students.">Behavioral, virology, and immunologic factors associated with acquisition and severity of primary Epstein-Barr virus infection in university students.</a> Journal of Infectious Diseases. 207 (1), 80-88 (2013).</li><li>Luzuriaga, K., Sullivan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infectious+mononucleosis.">Infectious mononucleosis.</a> New England Journal of Medicine. 362 (21), 1993-2000 (2010).</li><li>Fujiwara, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+research+on+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection+in+Japan.">Current research on chronic active Epstein-Barr virus infection in Japan.</a> Pediatrics International. 56 (2), 159-166 (2014).</li><li>Tsao, S. W., Tsang, C. M., Lo, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epstein-Barr+virus+infection+and+nasopharyngeal+carcinoma.">Epstein-Barr virus infection and nasopharyngeal carcinoma.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B: Biological Sciences. 372 (1732), 20160270 (2017).</li><li>Zhong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+transcriptome+profiling+reveals+major+cell+types+in+the+cellular+immune+response+against+acute+and+chronic+active+Epstein-Barr+virus+infection.">Whole transcriptome profiling reveals major cell types in the cellular immune response against acute and chronic active Epstein-Barr virus infection.</a> Scientific Reports. 7 (1), 17775 (2017).</li><li>Fedyanina, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nature+and+clinical+significance+of+atypical+mononuclear+cells+in+infectious+mononucleosis+caused+by+the+Epstein-Barr+virus+in+children.">The nature and clinical significance of atypical mononuclear cells in infectious mononucleosis caused by the Epstein-Barr virus in children.</a> Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1699-1706 (2021).</li><li>Al Tabaa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+polyclonal+activation+and+Epstein-Barr+viral+abortive+lytic+cycle+are+two+key+features+in+acute+infectious+mononucleosis.">B-cell polyclonal activation and Epstein-Barr viral abortive lytic cycle are two key features in acute infectious mononucleosis.</a> Journal of Clinical Virology. 52 (1), 33-37 (2011).</li><li>M, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+Killer+cell+transcriptome+during+primary+EBV+infection+and+EBV+associated+Hodgkin+Lymphoma+in+children-A+preliminary+observation.">Natural Killer cell transcriptome during primary EBV infection and EBV associated Hodgkin Lymphoma in children-A preliminary observation.</a> Immunobiology. 225 (3), 151907 (2020).</li><li>Greenough, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene+expression+signature+that+correlates+with+CD8++T+cell+expansion+in+acute+EBV+infection.">A gene expression signature that correlates with CD8+ T cell expansion in acute EBV infection.</a> Journal of Immunology. 195 (9), 4185-4197 (2015).</li><li>Xia, Y., Gao, Y., Wang, B., Zhang, H., Zhang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+the+method+of+cell+separation+from+bile+of+patients+with+cholangiocarcinoma+for+flow+cytometry.">Optimizing the method of cell separation from bile of patients with cholangiocarcinoma for flow cytometry.</a> Gastroenterology Research and Practice. , 5436961 (2019).</li><li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+controls,+instrument+setup,+and+the+determination+of+positivity.">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry Part A. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li><li>Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+CD4++T-cells+and+analysis+of+circulating+T-follicular+helper+(cTfh)+cell+subsets+from+peripheral+blood+using+6-color+flow+cytometry.">Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).</li><li>Djaoud, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+alternate+strategies+for+innate+immunity+to+Epstein-Barr+virus:+One+using+NK+cells+and+the+other+NK+cells+and+gammadelta+T+cells.">Two alternate strategies for innate immunity to Epstein-Barr virus: One using NK cells and the other NK cells and gammadelta T cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 214 (6), 1827-1841 (2017).</li><li>Nakid-Cordero, C., Baron, M., Guihot, A., Vieillard, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cells+in+post-transplant+lymphoproliferative+disorders.">Natural killer cells in post-transplant lymphoproliferative disorders.</a> Cancers. 13 (8), 1836 (2021).</li><li>Forrest, C., Hislop, A. D., Rickinson, A. B., Zuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome-wide+analysis+of+CD8++T+cell+responses+to+EBV+reveals+differences+between+primary+and+persistent+infection.">Proteome-wide analysis of CD8+ T cell responses to EBV reveals differences between primary and persistent infection.</a> PLoS Pathogens. 14 (9), 1007110 (2018).</li><li>Zamai, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+Synergy+of+NKp46+and+co-activating+signals+in+various+NK+cell+subpopulations:+paving+the+way+for+more+successful+NK-cell-based+immunotherapy.">Understanding the Synergy of NKp46 and co-activating signals in various NK cell subpopulations: paving the way for more successful NK-cell-based immunotherapy.</a> Cells. 9 (3), 753 (2020).</li><li>Lam, J. K. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+CD4++and+CD8++polyfunctional+T+cell+responses+against+immunodominant+lytic+and+latent+EBV+antigens+in+children+with+primary+EBV+infection.">Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection.</a> Frontiers In Microbiology. 9, 416 (2018).</li><li>Choi, I. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+by+the+Epstein-Barr+virus+LMP1+protein+induces+potent+cytotoxic+CD4(+)+and+CD8(+)+T+cell+responses.">Signaling by the Epstein-Barr virus LMP1 protein induces potent cytotoxic CD4(+) and CD8(+) T cell responses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 686-695 (2018).</li></ol>

Bu protokol, periferik kan bağışıklık hücresi alt popülasyonlarını sıralamanın etkili bir yolunu temsil eder. Bu çalışmada IM'li hastalardan, sağlıklı EBV taşıyıcılarından ve EBV ile enfekte olmamış çocuklardan alınan venöz kan örnekleri araştırma amacı olarak seçilmiştir. IM hastalarının periferik kanını kullanan bu çalışma, esas olarak çok renkli akış sitometrisi yoluyla farklı hücre alt kümelerinin oranlarını analiz etmeye ve belirlemeye odaklanmaktadır. Transkriptom di...

İnsan herpes virüsü tip 4 olarak da bilinen bir γ-herpes virüsü olan Epstein-Barr virüsü (EBV), insan popülasyonunda her yerde bulunur ve yetişkin nüfusun% 90'ından fazlasında yaşam boyu gizli enfeksiyon oluşturur1. EBV primer enfeksiyonunun çoğu çocukluk ve ergenlik döneminde ortaya çıkar, hastaların bir kısmı enfeksiyöz mononükleoz (IM)2 ile kendini gösterir, kandaki CD8 + T hücreleri ile aktive olmuş bir immün yanıt ve orofarenks3'te EBV ile enfekte B hücrelerinin geçici proliferasyonu dahil olmak üzere karakteristik immünopatoloji gösterir. IM'nin seyri 2-6 hafta sürebilir ve hastaların çoğunluğuiyileşir 4. Bununla birlikte, bazı bireylerde kronik aktif EBV enfeksiyonu (CAEBV)5 olarak sınıflandırılan yüksek morbidite ve mortalite ile kalıcı veya tekrarlayan IM benzeri semptomlar gelişir. Ek olarak, EBV, nazofaringeal karsinom, Burkitt lenfoma, Hodgkin lenfoma (HL) ve T / NK hücreli lenfoma6 gibi epiteloid ve lenfoid maligniteler de dahil olmak üzere çeşitli malignitelerle yakından ilişkili olan önemli bir onkojenik virüstür. EBV 50 yılı aşkın süredir çalışılmasına rağmen, patogenezi ve lenfositlerin proliferasyonunu indüklediği mekanizma tam olarak aydınlatılamamıştır.
Birçok çalışmada transkriptom dizilimi ile EBV enfeksiyonunun immünopatolojisi için moleküler imzalar araştırılmıştır. Zhong ve ark., CD8 + T hücre genişlemesinin ağırlıklı olarak IM grubu7'de bulunduğunu bulmak için IM veya CAEBV'li Çinli çocuklardan periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC'ler) tüm transkriptom profillemesini analiz ettiler ve CD8 + T hücrelerinin IM'de önemli bir rol oynayabileceğini düşündürdüler. Benzer şekilde, başka bir çalışmada, birincil EBV enfeksiyonunun neden olduğu IM'li hastalarda, hem EBV reaktivasyonunun hem de diğer ajanların neden olduğu IM'li hastalara göre daha düşük oranda EBV'ye özgü sitotoksik T ve CD19 + B hücrelerinin daha düşük oranları veCD8 + T hücrelerinin daha yüksek yüzdeleri bulunmuştur. B hücreleri ilk önce IM'ye dahil olurlar, çünkü EBV reseptörleri yüzeylerinde sunulur. Al Tabaa ve ark., IM9 sırasında B hücrelerinin poliklonal olarak aktive olduğunu ve intoplazmablastlar (CD19+, CD27+ ve CD20− ve CD138− hücreleri) ve plazma hücrelerinin (CD19+, CD27+ ve CD20− ve CD138+) farklılaştığını bulmuşlardır. Ayrıca, Zhong ve ark. monosit belirteçleri CD14 ve CD64'ün CAEBV'de yukarı regüle olduğunu bulmuşlardır, bu da monositlerin antikora bağımlı hücresel sitotoksisite (ADCC) ve hiperaktif fagositoz7 yoluyla CAEBV'nin hücresel immün yanıtında önemli bir rol oynayabileceğini düşündürmektedir. Alka ve ark., dört IM veya HL hastasından CD56dim CD16 + NK hücrelerini sıralayan MACS'nin transkriptomunu karakterize ettiler ve hem IM hem de HL'den NK hücrelerinin, NK hücrelerinin hipoyanıtlılığından sorumlu olabilecek doğuştan gelen bağışıklık ve kemokin sinyal genlerini aşağı regüle ettiğini bulmuşlardır10. Ek olarak, Greenough ve ark., IM'li bireylerin 10 PBMC'sinden sıralanmış CD8 + T hücrelerinin gen ekspresyonunu analiz ettiler. IM'deki CD8 + T hücrelerinin büyük bir kısmının virüse özgü, aktive edilmiş, bölünen ve efektör aktivitelerini uygulamak için astarlanmış olduğunu bildirmişlerdir11. Hem T hücresi aracılı, EBV'ye özgü yanıtlar hem de NK hücre aracılı, spesifik olmayan yanıtlar primer EBV enfeksiyonu sırasında önemli roller oynamaktadır. Bununla birlikte, bu çalışmalar sadece immün hücrelerin çeşitli karışımının veya sadece belirli bir lenfosit alt popülasyonunun transkriptom sonuçlarını araştırmıştır; bu, aynı hastalık durumundaki IM'li çocuklarda farklı immün hücre alt popülasyonlarının moleküler özelliklerinin ve fonksiyonlarının kapsamlı bir şekilde karşılaştırılması için yeterli değildir.
Bu yazıda, PBMC'lerin (monositler, CD4 + T hücreleri, CD8 + T hücreleri, B hücreleri ve NK hücreleri) tanımlanmış immün hücre alt popülasyonlarını izole etmek ve analiz etmek için immünomanyetik boncukları ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralamayı (FACS) birleştiren bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntemi kullanarak, manyetik ve floresan olarak etiketlenmiş hücreler manyetik bir ayırıcı ve FACS kullanılarak saflaştırılabilir veya akış sitometrisi ile analiz edilebilir. RNA, transkriptom dizilimi için saflaştırılmış hücrelerden ekstrakte edilebilir. Bu yöntem, IM'li bireylerin aynı hastalık durumlarında farklı bağışıklık hücrelerinin karakterizasyonunu ve gen ekspresyonunu sağlayacak ve bu da EBV enfeksiyonunun immünopatolojisi hakkındaki anlayışımızı genişletecektir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD16</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302012</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-human CD56 (NCAM)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>362504</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC/Cyanine7 anti-human CD4</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344616</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated cell counter</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>TC20</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD FACSAria fluorescence-activated&#160;flow&#160;cell&#160;sorter-cytometer (BD FACSAria II)</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>644832</td>
			<td>Cell sort</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD14 MicroBeads, human</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-050-201</td>
			<td>microbeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell ctng slides</td>
			<td>BIO RAD</td>
			<td>1450016</td>
			<td>Cell count</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>35209715</td>
			<td>15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA (&#8805;99%, BioPremium)</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST1303</td>
			<td>EDTA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Company</td>
			<td>&#160;367862&#160;</td>
			<td>EDTA anticoagulant tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-human CD19</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>302206</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>16000-044</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>&#160;3K15</td>
			<td>Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;High-speed&#160;centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424R</td>
			<td>Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human lymphocyte separation medium</td>
			<td>Dakewe</td>
			<td>DKW-KLSH-0100</td>
			<td>Ficoll-Paque</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS&#160;Separation&#160;columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>Separation&#160;columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tubes</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>MCT-150-C</td>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>Magnetic bead separator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE anti-human CD8</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344706</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>344808</td>
			<td>Fluorescent antibody&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>BI</td>
			<td>02-024-1ACS</td>
			<td>PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene round bottom tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td>5 mL tube for FACS flow cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIzol reagent</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>15596024</td>
			<td>Lyse cells for RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>C0011</td>
			<td>Trypan Blue Staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

separation of immune cell subpopulations in peripheral blood samples from children with infectious mononucleosis

Enfeksiyöz mononükleoz (IM), çoğunlukla primer Epstein-Barr virüsü (EBV) enfeksiyonu ile ilişkili akut bir sendromdur. Başlıca klinik semptomlar düzensiz ateş, lenfadenopati ve periferik kanda önemli ölçüde artmış lenfositlerdir. IM'nin patojenik mekanizması hala belirsizdir; bunun için etkili bir tedavi yöntemi yoktur, esas olarak semptomatik tedaviler mevcuttur. EBV immünobiyolojisindeki ana soru, enfekte bireylerin sadece küçük bir alt kümesinin neden ciddi klinik semptomlar gösterdiği ve hatta EBV ile ilişkili maligniteler geliştirdiği, çoğu bireyin virüsle yaşam boyu asemptomatik olduğudur.
B hücreleri ilk önce IM'ye dahil olurlar, çünkü EBV reseptörleri yüzeylerinde sunulur. Doğal öldürücü (NK) hücreler, EBV ile enfekte olmuş hücreleri öldürmek için önemli olan sitotoksik doğuştan gelen lenfositlerdir. CD4 + T hücrelerinin oranı azalırken, CD8 + T hücrelerinin oranı akut EBV enfeksiyonu sırasında dramatik olarak genişler ve CD8 + T hücrelerinin kalıcılığı IM'nin yaşam boyu kontrolü için önemlidir. Bu bağışıklık hücreleri IM'de önemli roller oynar ve işlevlerinin ayrı ayrı tanımlanması gerekir. Bu amaçla, monositler önce CD14 mikroboncukları, bir sütun ve manyetik bir ayırıcı kullanılarak IM bireylerinin periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) ayrılır.
Kalan PBMC'ler, CD4 + T hücrelerini, CD8 + T hücrelerini, B hücrelerini ve NK hücrelerini bir akış sitometresi kullanarak sıralamak için peridinin-klorofil-protein (PerCP) / Siyanin 5.5 anti-CD3, allofikokosyanin (APC) / Siyanin 7 anti-CD4, fikoeritrin (PE) anti-CD8, floresan izotiyosiyanat (FITC) anti-CD19, APC anti-CD56 ve APC anti-CD16 antikorları ile boyanır. Ayrıca, IM'deki fonksiyonlarını ve patojenik mekanizmalarını araştırmak için beş alt popülasyonun transkriptom dizilimi yapıldı.

Geçit stratejisinin referansı Dört lenfosit alt popülasyonunu sıralamak için kullanılan geçit stratejisi Şekil 1'de gösterilmiştir. Kısaca, lenfositler, granüloziteye (SSC-A) karşı boyutu (FSC-A) gösteren bir nokta grafiği üzerinde seçilir (P1). Ardından, boyutu (FSC-A) ve ileri dağılımı (FSC-H) gösteren bir nokta grafiğinde tek hücreler (P2) seçilirken, çift hücreler hariç tutulur. CD3+ T hücreleri (P3) ve CD19+ B hü...

Watch this Scientific Journal Video about Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis at JoVE.com

Separation of Immune Cell Subpopulations in Peripheral Blood Samples from Children with Infectious Mononucleosis

Periferik kan mononükleer hücrelerinin (monositler, CD4 + T hücreleri, CD8 + T hücreleri, B hücreleri ve doğal öldürücü hücreler) tanımlanmış bağışıklık hücresi alt popülasyonlarını izole etmek ve analiz etmek için immünomanyetik boncukları ve floresan ile aktive edilmiş hücre sıralamasını birleştiren bir yöntem tanımladık. Bu yöntemi kullanarak, manyetik ve floresan olarak etiketlenmiş hücreler saflaştırılabilir ve analiz edilebilir.

Enfeksiyöz Mononükleozlu Çocuklardan Periferik Kan Örneklerinde İmmün Hücre Alt Popülasyonlarının Ayrılması

Infectious mononucleosis (IM) is an acute syndrome mostly associated with primary Epstein&#8211;Barr virus (EBV) infection. The main clinical symptoms ...

Bu yöntem, IM'li bireylerin aynı hastalık durumlarında farklı bağışıklık hücrelerinin karakterizasyonunu sağlayacak ve bu da EBV enfeksiyonunun mekanizması hakkındaki anlayışımızı genişletecektir. Prosedürü gösteren, laboratuvarımızdan bir doktor olan Linlin Zhang olacak. Başlamak için, daha önce 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde izole edilmiş PBMC'leri alın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 G'de döndürün.Süper natantı atın ve hücreleri hazırlanan tamponun 80 mikrolitresi ile yeniden askıya alın. Daha sonra, hücre süspansiyonuna 20 mikrolitre CD 14 mikroboncuk ekleyin, pipetle iyice karıştırın ve tüpü buz üzerinde 15 dakika inkübe edin. Daha sonra PBMC'leri bir mililitre tampon kullanarak yıkayın ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 G'de santrifüj yapın.Tüm süpernatanı atın ve hücreleri 500 mikrolitre tamponla yeniden askıya alın. Manyetik ayırma için, manyetik boncuk ayırıcının üzerine bir sütun yerleştirin ve sütunu tamponun üç mililitresi ile yıkayarak astarlayın. Ardından, hücre askıya alma işlemini sütuna ekleyin.Geçmesine izin verin ve etiketlenmemiş hücreleri 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın. Kolonu üç mililitre tamponla üç kez yıkayın ve tüm atık suyu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın. Şimdi, kolonu yeni bir 15 mililitrelik santrifüj tüpüne yerleştirin ve kolona beş mililitre tampon ekleyin.Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri tüpe yıkamak için pistonu sıkıca sütuna itin. Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri beş dakika boyunca 300 G'de santrifüj yapın. Süpernatanı çıkardıktan sonra, hücreleri 500 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın ve sonraki transkriptom dizilimi için hücre süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.Toplanan etiketsiz hücreleri beş dakika boyunca 300 G'de santrifüj yaparak toplayın ve hücreleri 1.5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde 100 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın. Daha sonra, hücre süspansiyonuna her etiketli antikorun iki mikrolitresini ekleyin ve ışıktan korunarak 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra, negatif kontrol numunesi CD 3, CD 4, CD 8 ve CD 19, tek boyama örnekleri ve bir CD 56 veya CD 16 boyama örneği oluşturmak için 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüplerinde PBMC hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini aliquot edin.Daha sonra her tüpe karşılık gelen floresan etiketli antikorun iki mikrolitresini ekleyin ve ışıktan korunarak 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Kuluçkadan sonra, tüm hücreleri daha önce gösterildiği gibi PBS ile yıkayın ve 500 mikrolitre PBS'de tekrar askıya alın. Hücre sıralama sistemini açın ve güç açma programını çalıştırın.Ardından, 85 mikrometrelik nozulu takın ve sıralama akışını açın. Sıralama voltajını 4.500 volta ve frekansı 47'ye ayarlayın. Kesme penceresinde boşluğu 8'e ayarlayın ve damlacık genlik değerini otomatik olarak belirlemek için tatlı nokta otomatik sıralama modunu açın.Son olarak, damlacık gecikmesini yan akış penceresinde 30.31'e ayarlayın. İleriye ve yana doğru saçılma nokta grafiği kullanarak, bozulmamış lenfosit popülasyonunu tanımlamak için P1 poligon kapısını çizin. Ardından, yükseklik noktası grafiğine karşı ileri dağılım alanı kullanarak, tek hücreleri tanımlamak için P2 çokgen kapısını çizin ve çiftleri hariç tutun.Ardından, CPCY 5,5 alan nokta grafiği başına CD 3'e karşı CD 19 FITC alanı kullanarak, CD 3 pozitif T hücrelerini ve CD 19 pozitif B hücrelerini seçmek için dikdörtgen kapı P3'ü çizin. Ardından, CD 4 APCCY 7 alanına karşı CD 8 PE alanı nokta grafiği kullanarak, CD 4 ve CD 8 pozitif T hücrelerini seçmek için dikdörtgen bir kapı çizin. Son olarak, CD 56 veya CD 16 APC alanı nokta grafiğine karşı bir yan dağılım alanı kullanarak, CD 56 veya CD 16 pozitif doğal öldürücü hücreleri seçmek için dikdörtgen bir kapı çizin.Negatif kontrol tüpü için, edinme panosunda yüke tıklayın ve yazılımdaki sitometre ayarlarını seçin. Denetçi penceresinde, parametreler sekmesini tıklatın ve ileri saçılma, yan saçılma ve farklı floresan boyaların voltajlarını ayarlayın. Tek lekeli tüpleri sitometreye yükledikten sonra, edinme panosunda yük'ü tıklayın, ardından metinde açıklandığı gibi telafiyi ayarlamak için telafi sekmesini tıklayın.Tüpü sitometreye yüklemeden önce hücre süspansiyonunu yavaşça vorteksleyin. Dört toplama akış tüpüne 200 mikrolitre FBS ekleyin ve tüpleri vorteksleyin. Onları sitometre toplama odasına yerleştirin.Farklı hücre tiplerini dört akış tüpünde ayrı ayrı toplayın. Ayrılmış hücreleri beş dakika boyunca 300 G'de döndürün ve transkriptom dizilimi için hücre paletine 200 mikrolitre RNA izolasyon reaktifi ekleyin. Bu çalışmada, farklı örneklerin periferik kanından elde edilen immün hücre alt popülasyonları, immünomanyetik boncuklar ve floresan aktive hücre sıralama teknikleri birleştirilerek verimli bir şekilde ayrıştırılmıştır.Bu protokolde daha da önemlisi, hücre sıralama adımı, hücre canlılığını artırmak için optimize edilmiştir. Sıralanmış bağışıklık hücreleri, enfeksiyöz mononükleozlu hastalarda hem sağlıklı Epstein-Barr virüs taşıyıcılarına hem de enfekte olmamış örneklere kıyasla CD 3, CD 8 pozitif T hücrelerinin artmış bir oranını göstermiştir. Buna karşılık, enfeksiyöz mononükleozlu hastalarda sağlıklı EBV taşıyıcılarına ve EBV ile enfekte olmamış çocuklara kıyasla CD 3, CD 4 pozitif T hücreleri ve CD 19 pozitif B hücrelerinin oranlarında azalma gözlenmiştir.Ek olarak, enfeksiyöz mononükleozlu hastalarda EBV ile enfekte olmamış çocuklara kıyasla CD 56 veya CD 16 pozitif doğal öldürücü hücrelerin oranlarında azalma gözlenmiştir. Hücre canlılığını korumak, sonraki deneyler için hayati öneme sahiptir. Ayırma işlemi sırasında hücreleri buz üzerinde veya buzdolabında tutmak, hücre canlılığı için faydalıdır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Enumeration of Major Peripheral Blood Leukocyte Populations for Multicenter Clinical Trials Using a Whole Blood Phenotyping Assay

Bir Tam Kan fenotipleme Testi Kullanarak Çok Merkezli Klinik Araştırmalar için Binbaşı Periferik Kan Lökosit Populasyonlarının Numaralama

Cryopreservation of peripheral blood leukocytes is widely used to preserve cells for immune response evaluations in clinical trials and offers many ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Kordon Kanı gelen Prekürsör B-hücreli altkümeleri İzolasyonu

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Detection of Fluorescent Nanoparticle Interactions with Primary Immune Cell Subpopulations by Flow Cytometry

Sitometrisi ile Primer İmmün hücre alt Floresan Nanoparçacık Etkileşimleri Algılama

Engineered nanoparticles are endowed with very promising properties for therapeutic and diagnostic purposes. This work describes a fast and reliable ...

Rapid Identification of Gram Negative Bacteria from Blood Culture Broth Using MALDI-TOF Mass Spectrometry

MALDI-TOF kütle spektrometrisi kullanılarak kan kültür besi yerinden, Gram negatif bakterilerin hızlı belirlenmesi

An important role of the clinical microbiology laboratory is to provide rapid identification of bacteria causing bloodstream infection. Traditional ...

Detecting Glycogen in Peripheral Blood Mononuclear Cells with Periodic Acid Schiff Staining

Periyodik Asit Schiff Boyama ile periferik kan mononükleer hücreleri glikojen algılama

Periodic acid Schiff (PAS) staining is an immunohistochemical technique used on muscle biopsies and as a diagnostic tool for blood samples. ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

Periferik Kan İnsan alloantijen-özgü T hücrelerinin üretilmesi

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

A Semi-automated Approach to Preparing Antibody Cocktails for Immunophenotypic Analysis of Human Peripheral Blood

İnsan Periferik Kan immünfenotipik Analizi Antikor Kokteyller Hazırlama A Yarı-otomatik Yaklaşım

Immunophenotyping of peripheral blood by flow cytometry determines changes in the frequency and activation status of peripheral leukocytes during disease ...

Isolation and Flow Cytometric Analysis of Glioma-infiltrating Peripheral Blood Mononuclear Cells

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

Our laboratory has recently demonstrated that natural killer (NK) cells are capable of eradicating orthotopically implanted mouse GL26 and rat CNS-1 ...